微囊藻毒素检测方法的研究进展

微囊藻毒素检测方法的研究进展 湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构和功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻（Cyanobacteria）的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。随着水体富营养化的加剧而引起有害藻类水华（HAB,harmful algal bloom）的频繁发生已成为国内外普遍关注的环境问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味。不仅影响人的感官，破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。世界上25%~70%的蓝藻水华污染可产生藻毒素，在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒（Microcystins,MC）是目前已知的一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。在20世纪80年代对全国范围内的水源水质进行过全面的调查，结果表明34个湖泊中有一半以上的湖泊面积处于富营养状态。进入20世纪90年代，全国淡水水体富营养化日益严重，涉及范围不断扩大。通过对各大饮用水水源及各种湖泊的监测表明，在夏秋季节藻类水华严重，每年长达7~8个月，而天然水体蓝藻水华80%是产生毒素的。从加拿大、日本、芬兰、美国、中国等地对湖水、河水、水库水、井水及自来水等水样的检测结果看，有的水体中微囊藻毒素检出率高达60%~87%，源水中微囊藻毒素浓度从130ng/ml~2μg/ml，经加氯处理后的浓度也在0.09~0.6μg/L之间。淡水水源受到微囊藻毒素的检测方法的研究日益深入，需要建立一种简单、快速、准确的系统的检测方法。 1  微囊藻毒素简介 1.1  微囊藻毒素 淡水藻类通常以蓝藻、绿藻、硅藻、甲藻、隐藻、裸藻、金藻、黄藻等8个门为主。蓝藻门是已知的产生毒素最多的门类，这些毒藻可产生具有明显肝毒性的肽类物质，称为微囊藻毒素（Microcystins,MC）。它是一种肝毒素，是肝癌的强烈致癌剂。 1.2  微囊藻毒素的结构 Louw认为，微囊藻毒素是一种具有强烈慢性肝脏中毒特征的生物碱。Hughes等人在1958年发现并分离得到铜绿微囊藻NRC-1有毒品系。1959年Bishop等人对铜绿微囊藻NRC-1有毒品系的毒性做全面研究，发现这种微囊藻毒素是由7种氨基酸组成的小分子环状多肽，为单环结构：D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-谷氨酸-Mdha。其中Mdha是一种特殊的氨基酸；Adda为3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯-4,6-二烯酸；X和Y为两种可变L氨基酸。目前已鉴定的约有65个微囊藻毒素变式，其中多数毒性较高，如MC-LR，MC-RR和MC-YR等。 1.3  微囊毒素的产生 MC是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性。由于它有很小的体积（分子量1000左右）、环状结构及其氨基酸的特殊结构，一般认为它不在核糖体内合成，而是由肽合成酶复合体合成的生物活性小肽，类似于在一些杆菌和真菌中小肽的合成。这些小肽大多是抗生素、免疫抑制物和一些对动物和植物有毒的物质。关于微囊藻毒素产生的机理有很多假设，但目前为止尚无令人满意的结果，现在常提到的有环境因素和遗传因素。微囊藻毒素受光照、温度、营养盐等多种环境因素影响，其中光照可起到非常重要的作用。但遗传论者认为微囊藻毒素的合成是由毒素肽合成酶基因多基因控制的，并由肽合成酶复合体合成（非核糖体合成的多肽）。 1.4  微囊藻毒素对生物的影响 因为MC主要以肝脏为靶器官，当动物被灌喂或腹腔注射后，破坏细胞内的蛋白磷酸化平衡，改变多种酶活性，引起肝脏病变，造成一系列的生理紊乱。中毒症状主要表现为虚弱、呼吸沉重、皮肤变白、呕吐、腹泻、毛立和嗜睡等。如猴子的中毒症状为昏迷、肌肉痉挛、呼吸急促、腹泻等，在数小时内或几天内死亡。1987年Brook WP用HC标记的MC-LR腹腔注射染毒小鼠，1分钟后肝脏内出现总标记的70%，3小时后肝脏内积聚的MC-LR占总量的90%，表明肝脏是MC-LR分布的主要器官。它不仅对动物有影响，而且对植物也有一定的影响。Mcelhiney等发现MC-LR的存在可对茄属植物的生长和豆类植物根的发育产生不良影响。Singh等研究了MC对藻类、微生物和真菌生长的效应，发现在初始50mg/L的MC可完全抑制灰色念珠藻和鱼腥藻的生长并使藻细胞溶解。观察到了MC对二氧化碳的吸收和光合作用的不良影响，同时推断出铜绿微囊藻通过MC的杀藻作用是在自然条件下保持其优势藻种的重要原因。微囊藻对人体的健康也会造成很严重的危害，据报道，巴西曾发生一起126个做肾透析的病人出现神经系统中毒症状，造成60人死亡事件。生化检验结果表明，中毒病人血清中MC浓度为2.4~31ng/ml，渗透液用水经HPLC检测，其中含有MC-LR、RR、AR，证实这起医疗事故是因MC进入血循环引起急性肝损伤而导致病人死亡。 2  微囊藻毒素的检测方法 正是因为MC来源于藻且对人和水生动植物具有很高的毒性及潜在危害，目前的环境检测已经把其列为其中的一个指标，但是如何既能准确又能迅速地定性定量地检出也是科学界普遍关注的问题。因此对于藻毒素分析检测的研究对于维护环境安全和人类健康具有重要意义，世界卫生组织规定饮用水中的MC浓度不得高于1.0μg/L(MC-LR)。目前普遍采用的方法可以归纳为生物毒理学法、化学分析法、免疫检测法。 2.1  生物毒理学法 2.1.1  生物测试法 采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性。此方法经Medcof和chantz修改完善后于1985年被分析化学家协会确定为标准方法沿用至今。它的优点是简便直观，能较为粗略地判断提取物是否有毒性。具有操作简单，结果直观、快速等优点，但需要消耗较多的毒素，灵敏度和专一性不高；无法准确定量，也不能辨别毒素的异构体类型；小鼠的维持费用高、工作量大。因此，生物测试通常只作为毒性检测的最初筛选方法，并且正日益被其他方法所取代。 2.1.2  细胞毒性的检测技术 细胞毒性检测技术是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素的一种技术，不仅可以判断毒素是否存在，还可以对毒素进行精确的定量。Fladmark等人利用藻毒素诱导沙门氏菌和大鼠的原发性肝细胞死亡的能力为参数检测MC-LR，表明悬浮培养液中的沙门氏菌肝细胞为检测较广范围的肝毒素提供了迅速灵敏的系统。Fladmark等建立了一种根据MC导致鲑鱼或大鼠肝细胞凋亡的程度来确定MC的方法。他们将分离的鲑鱼或大鼠的肝细胞悬浮培养，然后加入MC，根据细胞凋亡的程度即可求出MC的含量，检测限度为10~20ng;并根据动物细胞凋亡的第一信号是发生凋亡的细胞与临近的细胞分离这一特征还建立了用MC导致悬浮培养的鲑鱼或鼠肝细胞解聚的程度来检测毒素的方法，所得结果比用判断细胞凋亡的程度所得结果灵敏5~10倍。 2.2  化学分析法 包括高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、高效液相色谱和质谱（HPLC-MS）、气相色谱和质谱（GC-MS）联用、毛细管电泳（CE）等方法。在化学检测方法中使用较多的是HPLC，其次是GC-MS联用，单独用GC和TLC的情况不多。HPLC技术一般采用正相或反相色谱对毒素进行分离，然后进行紫外（UV）、荧光（FL）或化学发光（CL）检测，可广泛用于MC分离、鉴定和定量检测，HPLC普遍应用的紫外检测器。 2.2.1  高效液相色谱（HPLC） 目前，高效液相色谱（HPLC）法是WHO、美英等发达国家和我国权威机构推荐的MC检测方法。该方法具有准确、灵敏、重现性好，能同时分析出不同的MC异构体等优点，目前关于HPLC测定MC的研究报道比较多，都集中在对色谱分析条件、样品的前处理、洗脱液、SPE柱、淋洗剂、浓缩定容过程的优化处理上，找到最适条件统一检测程序，才能在数据上有可比性。闫海等在岛津液相色谱（LCIOA）上用二级管紫外检测器测定，发现MC-LR和RR毒素都在238nm波长下有最大吸收峰。因为HPLC对MC检测限为1mg/L左右，而天然水体中的MC含量仅为μg/L水平，故水样一般要通过富集柱进行浓缩并洗脱后再进行HPLC测定。被测毒素进行鉴定时，将被测毒素与标准毒素的峰面积进行比较可对其进行精确定量。Lee等发展了一种新的柱转换高效液相色谱方法在线检测水样中的MC-LR、MC-RR及MC-YR，此方法不需要对水样进行预净化。过滤后的水样以3ml/min的流速流经ZorbaxCN预置柱进行在线的浓缩；经过阀转换后，浓缩的被分析物经反相洗脱并在LunaC18柱上进行分离，此种方法表现出很好的准确性、精确度及分析速度，整个分析方法过程需时90分钟，较采用离线固相萃取的分析方法用时短。目前采用HPLC-UV法对MC进行检测，检测限一般为ng级。 Murata等于1995年 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了一种用HPLC-CL监测MC的方法，他们将粗提的MC与半胱氨酸（Cys）反应生成Cys-MC，然后与荧光剂丹磺酰氯（Dns-CL）反应得到具有荧光发色团的Dns- Cys – MC。经HPLC后，再用TDPO和过氧化氢进行衍生，使之产生过氧草酸-化学发光（peroxyoxalate-Chemilumine-scence,PO-CL）,最后用化学发光检测器进行检测。这种方法的检测限小于15pg/L。 HPLC监测技术往往需要标准毒素，而目前已发现60多种MC，多数缺乏标准毒素，这限制了HPLC的进一步应用。HPLC-MS技术很好地解决了这一问题，即使没有标准毒素，只要知道这种毒素的分子量，就可对其进行定性，而且LMS技术亦可对毒素进行精确定量。快速原子轰击质谱（FABMS）和液相次级离子质谱（LSIMS）是确定毒素分子量的有效手段。虞锐鹏等采用HPLC-ESI-MS法，以乙腈-水-甲酸作为流动相，对水中的藻毒素进行测定；该法检出限为0.01μg/L，线性定量范围为0.02~20μg/L；该法具有灵敏度高，专属性强等特点。通过准确的分子量及结构信息，确定毒素类型，这种实验开发的方法实用性强，可为水质检测领域藻毒素风险 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 和监测水处理脱毒效能，提供痕量、快速、灵敏、准确的分析方法。 但HPLC方法技术含量高，价格昂贵，各实验室的检测程序和条件差别较大，极大地影响了相关资料间的对比分析，因而另外必须备有标准毒素或某毒素在相同实验条件下的保留值。由于当前世界在塑料制品中塑料添加剂可干扰HPLC对MC-LR、MC-YR的检测。 2.2.2  气相色谱法（GC-MS） GC和GC-MS可用于MC总量的测定。单独用GC测定MC的情况不多，主要是GC-MS连用法。GC-MS测定MC的前处理和HPLC法一样。将被测毒素进行鉴定，将被测毒素与标准毒素的峰面积进行比较可对其进行精确定量。目前采用GC-MS法对MC进行检测，检测限度一般为ng级。