异种脊髓前角匀浆对豚鼠前角运动神经元的影响

异种脊髓前角匀浆对豚鼠前角运动神经元的影响 异种脊髓前角匀浆对豚鼠前角运动神经元 的影响 CHINESEJOURNAIOFANArr()MYVo1.29No.42006解剖学杂志2006年第29卷第4期 异种脊髓前角匀浆对豚鼠前角运动神经元的影响 郭艳苏许蕾刘亚玲吴红然任爱兵宋学琴李春岩? (河北医科大学第二医院神经内科,石家庄050000) 摘要目的:观察豚鼠脊髓前角运动神经元在异种脊髓前角匀浆免疫后的变化.方法:猪脊髓前角匀浆免疫豚 鼠后,豚鼠脊髓前角以苏木精一伊红,甲苯胺蓝及IgG免疫组化染色,同时电镜下观察前角运动神经元的超微变 化.结果:豚鼠脊髓前角运动神经元存在变性和丢失,以神经元固缩,胶质细胞围绕破坏的神经元形成卫星现象 及小墓穴为主,脊髓前角运动神经元胞质内IgG沉积呈颗粒状分布.运动神经元胞质内内质网扩张,线粒体肿 胀.结论:猪脊髓前角匀浆作为抗原可引起豚鼠下运动神经元损伤,说明猪与豚鼠运动神经元存在共同抗原,自 身免疫机制可能参与了运动神经元变性过程. 关键词前角细胞;豚鼠;猪 Influenceofheterogeneousspinalcordventralhornhomogenate onventralhornmotoneuronsinguineapig GUOYan-Su,XULei,LIUYa-Ling,WUHong-Ran,RENAi-Bing,SONGXue-Qin,LIChu n-Yanzx (DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhang05 0000,China) AbstractObjective:Tostudythechangesofspinalcordanteriorhornmotoneuronsinguineapi ginoculatedwith heterogeneousspinalcordventralhornhomogenate.Methods:Afterinoculationofguineapigswithswinespinal cordventralhornhomogenate,spinalcordventralhorninguineapigswerestainedwithHematoxylin-eosin,tolu— idineblueandIgGimmunohistochemistry;ultrastructuralchangesofventralhornmotoneuronswereobservedby electronmicroscopeaswel1.Results:Degenerationandlossofspinalcordventralhornmotoneuronswerefound. Neuronalcoagulation,proliferationofglialcellsformingsatellitesaroundmotorneuronsandglialcoffinsatthe placesOfdestroyedmotoneuronswerepredominant.DistributionofimmunoglobulinGinthecytoplasmofspinal cordanteriorhornmotoneuronswasinagranularpattern.Dilationofendoplasmicreticulumandswellingofmito— chondriainmotorneuroncouldbeobserved.Conclusion:Theinoculationofguineapigswithswinespinalcord ventralhornhomogenatecaninducedegenerationoflowermotoneurons.Swineandguineapigmotoneuronmay sharecertainantigens.Autoimmunemechanismmighthavearoleintheprocessofmotoneurondegeneration. Keywordsanteriorhorncells;guineapigs;swine 肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种以选择性运动 皮质,脑干和脊髓运动神经元丢失为特征的致死 性神经变性疾病,运动神经元死亡的确切机制尚 未明确,可能的机制有:SOD1(superoxidedis- mutase1)基因突变,氧化应激,兴奋性氨基酸毒 性,免疫学说及细胞骨架异常等【1q].有关免疫介 导的运动神经元损伤机制研究,国内外均少见【4]. 本研究旨在研究猪脊髓前角匀浆免疫豚鼠后,豚 鼠脊髓前角运动神经元的数量,形态学变化以及 IgG反应,进一步探讨免疫机制在选择性运动神经 元损伤过程中的可能作用. ?通讯作者,E-mail:guoyansu@163.corn 收稿日期:2005—10—24;修回日期:20051222 —-—— 460?--—— 1材料和方法 1.1动物分组及处理 9只雄性豚鼠(2月龄,体质量450500g,河 北医科大学动物中心提供),随机分为3组:实验 组5只,免疫对照组2只,正常组2只.实验组以 新鲜猪脊髓(取自石家庄市双鸽肉联厂)前角匀浆 0.18,0.24g(湿重)与0.5ml磷酸盐缓冲液, 0.5ml完全弗氏佐剂(Sigma)制成油包水状,于豚 鼠背部皮下分10个部位进行接种.免疫对照组 去除免疫原(猪脊髓前角匀浆)以同样方法接种. 每隔4周重复1次,除第1次外,均为不完全弗氏 佐剂,共免疫4次.正常对照组不做任何处理. 1.2行为学观察 每犬观察动物并测量体匝量.观察指标包 括:运动速度和平衡能力:对引刺的反应;括约【 功能及呼啦和乔咽有尤障碍等 l_3组织学处理 打组豚鼠均丁筇4次免癌后2个月取材麻 醉后.以4多聚醛,0.05.戊一醛,cJ2昔眯 酸混合液(c1Inlol/】,磷酸缓冲液配制pH7j)灌 流闻窟.取脊髓颈,腰膨大.律确定位脊髓前角升 [刀成1mm小块.1戊醛继续浸泡同定】d.继 之经I氧化锇后固定lh.然后经系州而酮脱水, 浸透.环氧树脂包埋,半薄哪片做定倚分析后.制 备超薄切片,进行醋酸铀枸橼酸铅电子染色. JEM123(>型透射电子显微镜观察.余下组纵用 于石蜡包埋.5m切片.HE,甲革胺蓝及Luxol FastB1ue染色;部分组织经:蔗糖寝泡过使 后,液氯异戊烷速冻.冷冰冻切片机切片.厚 2(1J帅.崩f漂浮法免疫组织化学染色 1.4IgG免疫组织化学染色 用棘根l过氧化物晦标记的羊抗鼠lg((北京中 杉金桥生物技术有限公司)作免疫组织化学染色. 检测豚鼠脊髓前角运动神经元上腺位结合的豚鼠 抗猪神经元机体. 2结果 z1行为学观察 所有豚鼠于第4次免疫f2个收材时均来 现叫硅的肌尤力症状驶其他行为学异常寅骑 组有lI!豚鼠叫消瘦,取材前体质量与免疫前 相比未见增长.余与对照组相比无明差异 22组织学检查 蛮骑组豚鼠脊髓?斤可前垧运动神经元生 性和丢火(同lA,lH).神彝儿蛮性?』艘缩,j在染. m胶质细胞同绕形成卫星现象(罔l(J多见.仆 可见神经细胞破坏,胶质细胞增形成的小墓穴 (coffin)病堂轻微昔可神经元多角形消失.胞 体变,中央染色质褥王解及梭11=6位等后角神班 元未见}lIj挂的神经元丢失.脊髓切片未见叫硅的 炎性反应灶及脱髓鞘改变. 尼氏染色后进行脊髓前角动神经儿计 数.以仲n髓质前角.肓径2jl』m.有明盟的 核投清晰的核f.者为标准与龟疰埘脒组相比. 免疫绢脉鼠颈,腰运动神绛儿丢失比例分别为 205和Z8.8.经非配对,&验,旃者存在着 莘别( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1). , 葱 l脲脊髓腰晦^前.HE染色A:正常,×lO0:B:免疫后动神经元数日.×L?一'':免疫种兀目胶 胞成现象,( 目2电痤后脬脊髓腰&前角运动神经兀质I免瞧粗颗粒壮墨m性.免硅化E.×1 月青甚捌膨大前神经辊内质张拽粒体肿胀.嵴排列希L.TEM相.×2 目履?前自形质胞增,TEM相.×3000 FlSpillal—lv'r1h0mofI?In1…1…nlingu…I1-lEslaininRANomud.×JO0.B【…of0I…u "m*Hnerl?uIRl10×100【r;h0?I……mllnddbyglIBIce?…fo峭ll1】tenf1erin~-ulalion,×401) F2t_mrg~nularslaining…t删1of1…yt.plmofvel1lrall………nsofhlml…p'n?"l帅~howninln oculal~dguin~pigl—uD0hl一口lstag.×150 F3Dilatlon.fmu皿d.j一……Iumandawdlin~gofmitochondlqa嗣ththcir一aealst~rbenedinD~OIOTTl…0f 1na1?…enloxgem~ll哪r帅rnicl~graph,×20000 F{Astmcylicgl10^…inmer10rh0moflumbarenlI.1lronmi~)graph-x3000 46l 0鸯 免疫对照及正常对照组脊髓前角未见明显神 经元数量及形态学改变. IgG免疫组织化学检查:免疫对照和正常组豚 鼠脊髓前角运动神经元胞质内呈弱阳性IgG免疫 反应;实验组豚鼠脊髓前角运动神经元胞质内可 见大量颗粒状IgG沉积(图2),后角神经元阳性反 应程度明显弱于前角运动神经元. 表1免疫豚鼠与对照豚鼠颈和腰段脊髓运动 神经元数目的比较(士s) Tab1Comparisonofmotorneuronnumberincervicalandlumbar spinalcordofimmunizedandcontrolguineapigs(士s) 一P<O.01735normalgroupandcontrolgroup 2.3透射电镜观察 免疫后豚鼠颈和腰段脊髓前角电镜观察可见 运动神经元胞质基质水肿,粗面内质网及高尔基 复合体扩张,线粒体肿胀变圆甚至呈泡状,线粒体 基质电子密度降低,嵴排列紊乱,稀疏,甚至消失 (图3).神经元周围胶质细胞增多,并可见5,7 个星形胶质细胞聚集形成的小墓穴(图4).部分 神经元体积缩小,胞质浓缩,整个细胞体电子透明 度降低,胞质内含大量密集的线粒体,游离核糖 体,散在的溶酶体及轻度扩张的内质网,胞质基质 脱水,电子密度增高.免疫对照和正常组豚鼠脊 髓前角运动神经元超微结构未见明显异常. 3讨论 本研究通过用猪脊髓前角匀浆免疫豚鼠,引 起了脊髓前角运动神经元的丢失和变性,所有实 验组动物取材前虽未出现明显的肌无力症状,但 病理形态学观察符合运动神经元变性改变,对照 组豚鼠则无变化.免疫组织化学证实实验组豚鼠 残存脊髓前角运动神经元内可见颗粒状IgG沉 积,由此可见,运动神经元的变性和丢失可能与抗 运动神经元抗体有关. 关于ALS的发病机制,目前尚未明确.近年 一 462一 来,随着研究的进一步深入,越来越多的证据支持 自身免疫机制在运动神经元变性和死亡中的作 用【5].ALS患者脊髓灰质和运动皮质内存在T淋 巴细胞浸润,并可见大量激活的小胶质细胞【6; ALS免疫动物模型和AIS患者的血清IgG分别 被动转移给小鼠,可引起IgG在运动神经元内及 运动轴索终末的沉积,变性的运动神经元内存在 钙超载【7],同时电生理检查神经肌肉接头处微小 终板电位频率增加,而波幅及时限正常,静息膜电 位正常,提示神经终末静息时乙酰胆碱量子释放 增多;用Western免疫斑点和EIISA法发现,形 成电压门控钙通道a亚单位的钙离子载体是 ALSIgG结合的最主要电压门控钙通道抗原,而 且I型电压门控钙通道a亚单位单克隆抗体可模 拟ALSIgG对骨骼肌电压门控钙通道电流的影 nile引.此外,AIS患者与正常人群相比,患甲状腺 疾病的概率增高,患者亲属中患免疫性疾病的病 人数量也明显增多.本研究以免疫作为始动因 素,引起了脊髓运动神经元的变性和丢失,也为自 身免疫机制可能在AIS运动神经元变性和丢失过 程中具有潜在的作用提供了依据. 此外,作者通过超微结构观察发现,脊髓前角 运动神经元线粒体肿胀,嵴排列紊乱,泡状改变早 于粗面内质网的脱颗粒(即尼氏体消失),是运动 神经元变性的早期超微病理改变.免疫引起运动 神经元损伤的机制不清,文献报道ALS患者血清 被动转移给小鼠,可引起脊髓前角运动神经元线 粒体肿胀,内质网扩张及组织化学染色大量的钙 沉积等【9],IgG的Fc片段可能参与运动神经元对 IgG的摄取及细胞内钙增加【1.因此,推测免疫 机制引起的细胞内钙水平和(或)分布异常在运动 神经元损伤过程中起关键性作用. 猪脊髓前角匀浆作为免疫原方便易得.猪脊 髓前角免疫豚鼠后,脊髓前角运动神经元可见颗 粒状IgG沉积,运动神经元数量减少,残存运动神 经元表现为深染,固缩,胞体变圆,核偏位等,提示 豚鼠与猪运动神经元存在共同抗原,猪脊髓前角 匀浆免疫豚鼠可引起运动神经元变性和丢失.实 验动物未出现肌无力的原因可能与种属差异,抗 原量,免疫次数及取材时间有关,以往的文献认 为,ALS在出现临床症状之前,可能已经有数月 至数年不等的亚临床病理改变期.出现I临床肌萎 缩体征前可能已有约3O以上的运动神经元损 害;只有运动神经元缺失达5O以上才会出现肌 无力症状. (下转467页) 术后14d,单损组N0S阳性细胞数,阳性细 胞平均光密度及阳性细胞平均面积均显着降低, 是由于随着损伤区炎性细胞浸润,炎性因子产生, 转录因子核因子B活化,诱导iNOS表达增加_8j. iNOS大量表达导致N0S阳性细胞数急剧升高, 由此带来的后果是过量NO产生使细胞明显皱 缩.相比而言,微囊组虽然NoS表达也进一步增 高,但相对较平稳,NOS阳性细胞胞体皱缩也不 明显,我们认为可能与微囊对移植雪旺细胞的保 护作用使雪旺细胞能在损伤区持续发挥作用 有关. 从本实验结果可以看出,即使是微囊组也存 在存活神经元发生胞体皱缩的现象,而张燕青 等[也观察到雪旺细胞能明显促进受损伤的背核 神经元存活,但不能阻止其胞体出现皱缩,这可能 是NOS过量表达导致的结果.如果在损伤后期 能进一步减少NO的产生,如使用NOS抑制剂 等,可以避免神经元胞体的皱缩,这有待进一步的 深入研究. 综上所述,NO在脊髓损伤中具有双重作 用_9],早期NO的适度增加对减轻损伤程度有利; 而如果过量生成NO,则会加重受损脊髓的继发性 损伤.本实验中,微囊化兔坐骨神经组织细胞移 植后在损伤初期NOS表达增加,而在损伤后期则 抑制N0S过量表达,发挥了对受损脊髓的保护 作用. 2 4 5 6 7 8 参考文献 WutianW.KaiH.IinxiI,eta1.ImplantationofPNSgraft inhibitstheinductionofneuronalnitricoxidesynthaseanden hancethesurvivalofspinalmotoneuronsfollowingrootavul— sion.ExpNeurol,1994,129(2):335339. 刘成龙,靳安民,周初松,等.大鼠脊髓损伤后一氧化氮合酶摹 因表达的变化.中华实验外科杂志,200I,18(1):75—76. 刘成龙,靳安民,周初松,等.脊髓损伤后两种结构型一氧化氮 合酶基因表达的变化.现代康复,2001,5(16):35—36. 刘曾旭,刘德明,王文敏,等.复方l丹参对脊髓损伤大鼠一氧化 氮合酶神经元的影响.解剖学杂志,200,1,24(4):71—73,128. 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