体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究_5426

体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究_5426 体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究 [标签:来源] 作者:黄新 江长青 肖颖锋 万圣祥 【摘要】 目的:观察维甲酸(RA)体外诱导神经干细胞后体内移植治疗失神经肌萎缩的效 果。方法:共使用成年SD 大鼠28 只，切断两侧坐骨神经，随机选择一侧直接吻合坐骨神经 作为对照组，实验组从孕龄15 d 的胚胎SD 大鼠脊髓组织中分离获得脊髓源性神经干细胞， 经维甲酸(RA)体外诱导后，显微注射到SD 大鼠失神经支配的一侧踇长伸肌中，术后16 周 神经电生理和免疫组织化学等方法观察。结果:实验组与对照组间的踇长伸肌肌肉纤颤电波 幅度，神经肌纤维传导速度的数目无统计学差异(P , 0.05)。结论:神经干细胞经体外诱 导后体内移植具有治疗失神经肌萎缩的作用。 【关键词】 干细胞;维甲酸;胆碱能神经元 observe the effect of induction of neural stem cells in vitro and then to preventdenervation muscular atrophy in vivo. Methods The spinal cord-derived neural stem cells of SD fetal rats afterpregnant 15 days were harvested and cultivated in serum–free medium, differentiated and induced by RA in vitro,Thenneural stem cells were random microinjected into single extensor hallucis longus of 28 SD rats which were transectedsciatic nerve ,others choosen as control groups which were repaired sciatic nerves, the two groups were examined bymuscular electrophysiological examination and cellular immunohistochemistry 16 weeks postoperatively. ResultsThe differents of the mean peak of CMAP(extent of muscle fibrillation waves) , the mean NCV(velocity of musclefiber nerve conduction)in experiment group and normal control group was not statistically significant (P > 0.05).Conclusions Neural stem cells by diferentiated into cholinergic neurons induced with RA in vitro can therapydenervation muscular atrophy in vivo. 〔Key Words〕 Stem cells; Retinoic acid; Cholinergic neuron 失神经支配后，骨骼肌立即停止收缩，肌组织失去神经元原来的营养因子，发生萎缩、 纤维化、往往再生的神经轴突尚未到达靶肌肉，运终板已经发生碎裂和崩解，导致功能无法 恢复，这是外周神经损伤后治疗极为棘手的问题。神经干细胞是一群具有多向分化潜能的原 始细胞，在特定的因素影响或诱导下，能向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化[1，2]。将其作为细胞移植材料对中枢神经系统疾病和外伤引起的神经元缺失具有良好效果，而且已有临床应用报道。在2006 年8 月,2008 年2 月间，我们利用在体外培养诱导的胎鼠脊髓的神经干细胞移植到SD 大鼠切断神经支配的踇长伸肌的上1/3 部，观察其在治疗失神经肌萎缩中的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 DMEM/F10(Gibco)，B27(Sigma)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D)，维甲酸(Gibco)，神经元无血清限定性培养基(Gibco)，胎牛血清( 四季青)， 磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsolution，PBS)(Sigma)， 兔抗大鼠神经上皮干细胞蛋白(nestin) 抗体、兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶(CHAT)抗体、兔抗大鼠神经胶质酸性蛋白(GFAP)抗体、兔抗大鼠微管相关蛋白–2(MAP2)抗体;FITC 标记的羊抗兔二抗和Cy3 标记的羊抗兔二抗，荧光显微镜。 1.2 胎鼠神经干细胞的体外培养与诱导参照Reynolds 等[3] 的方法，孕15 d 的重约250g SD 大鼠颈椎脱臼致死，酒精浸泡消毒后移入无菌操作箱，取出胎鼠去头，用显微器械取出脊髓组织，于10 倍手术显微镜下去除脊髓外膜，在预冷的D–Hank’S 液中用吸管缓慢吹打数次，使其分离成单细胞，将细胞悬液移至离心管中，1 500 r/min 离心5 min 弃去上清液，用限定性培养液(内含DMEM/F10、2 , B27，20 ng/mL bFGF) 重悬细胞沉淀，37?、5, CO2 条件下悬浮培养，视细胞生长情况每隔3~5 d 换液1 次。3 周后吸取部分神经干细胞的免疫荧光鉴定，检测抗原为Nestin，神经干细胞纯度达到90,。在上述神经干细胞的培养液中加入维甲酸(RA,5 μmol/L)后置于37?、5, CO2 培养箱中培养，分别于3 周后取培养细胞应用兔抗大鼠MAP2一抗(1:200)，Cy3 标志的羊抗兔二抗(1:50)，兔抗大鼠GFAP 一抗(1:200)，FITC 标记的羊抗兔二抗(1:50)来检测神经干细胞的分化，再次以小鼠抗胆碱乙酰转移酶(CHAT) 抗体双重标记。免疫荧光鉴定，荧光显微镜下观察拍照。 1.3 体外诱导的神经干细胞体内移植 1.3.1 动物模型制作 200~250 g 成年健康SD大鼠28 只(中山大学实验动物中心提供)，质量百分比为1,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后消毒铺单。于双侧大腿后外侧行直切口，显露坐骨神经，于中段处切断，实验分两组:随机选择一侧直接吻合修复坐骨神经(对照组)，另外一侧显微种植体外培养的神经干细胞悬液于踇长伸肌上1/3 部(实验组)，术后饲养16 周。 1.3.2 细胞移植、取材与免疫组化鉴定 将已经培养的神经干细胞与DMEM 培养液混合后制成浓度为105 mL 悬液，在10 倍手术显微镜下应用100 μm 玻璃筒不锈钢针头显微注射器显微注入干细胞悬液于随机选择的大鼠一侧踇长伸肌上1/3 部肌肉组织中，术后单笼饲养16 周。16 周后分别测双踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，坐骨神经肌纤维神经传导速率后，再次以1,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分别以4, 多聚甲醛和生理盐水经左心室插管灌注，原切口进入后游离切取踇长伸肌，称湿重后，10 μm 片厚冰冻切片并贴片，小鼠抗胆碱乙酰转移酶(CHAT)抗体免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察拍照，检测胆碱酯酶运动神经元。 1.4 观察指标 1.4.1 神经干细胞体外诱导成胆碱酯酶运动神经元的情况 维甲酸体外诱导神经干细胞后，以MAP2，GFAP 鉴定诱导分化成神经元的比例，再加 入小鼠抗胆碱乙酰转移酶(CHAT)抗体双重标记显示诱导成胆碱酯酶运动神经元比例。 1.4.2 神经电生理检测 术后16 周，在麻醉下无菌手术显露移植物全长，用Keypoint 3.02 型便携式四导程神经电生理仪于近端吻合口近侧刺激坐骨神经，在踇长伸肌记录坐骨神经肌纤维神经传导速率及踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，应用SPSS 13.0软件进行t 检验。 1.4.3 组织学检查 切取踇长伸肌，称湿重后，10% 福尔马林固定的标本常规石腊包埋，行CHAT免疫细胞荧光染色，观察胆碱酯酶运动神经元数量。 2 结 果 2.1 神经干细胞体外诱导成胆碱酯酶运动神经元的情况 神经干细胞体外诱导分化为神经元经免疫荧光检测比例达到(68.7?5.3)%，诱导分化成胆碱酯酶运动神经元的比例达(18.9?4.6)%。 2.2 神经电生理检测 术后16 周, 饲养过程中，大鼠死亡1 只，近端吻合口近侧给予电刺激时，均可在踇长伸肌记录到动作电位, 实验组、对照组的肌肉纤颤电波幅度无明显差异(P , 0.05); 实验组，对照组的神经肌纤维传导速度无明显差异(P , 0.05)。 2.3 组织学检查 术后16 周，2 组踇长伸肌外观，饱满度肉眼无明显差别，标本CHAT 免疫细胞荧光染色，可见实验组可见胆碱能运动神经元阳性细胞分布，而对照组则无。 3 讨 论 目前国内外防治失神经肌萎缩的研究主要集中在两方面:?提高神经吻合质量，加速神经的再生。如应用显微外科技术和细胞外科技术修复损伤神经、应用神经生长因子来促进神经再生，缩短神经损伤后功能恢复时间。这仅仅是间接防治失神经肌萎缩，这对臂丛、坐骨神经、尺神经损伤后的肌萎缩难以发挥作用;?阻止和延缓失神经肌萎缩的发生与发展。主要采用电磁刺激、针灸和药物治疗等方法，通过改善局部的血液循环来预防和治疗失神经肌萎缩，其临床疗效相当有限的。也有用各种神经营养因子通过局部或全身注射的方法来预防和治疗失神经后肌萎缩。但神经元对肌细胞作用是一个持续且长久的过程，而外源性的神经营养因子存在来源有限、生物活性较低、半衰期短、无理想载体、所需浓度较高和不易反复加入等缺点，影响其效应的发挥。这些方法将电生理和营养因子割裂开来，并由于各自的局限性，疗效欠佳。 要想从电生理冲动和神经源性肌营养因子两个方面同时治疗失神经肌萎缩，就必须重建神经肌连接，失神经肌获得神经再支配后肌萎缩缓解，其关键也在于神经肌连接。 Crain(1964 年)取横纹肌组织在体外培养，发现由于失神经支配，肌组织发生萎缩;但在培养液中加入脊髓组织，肌萎缩得到明显改善，并且体外培养的肌组织和脊髓组织可重新建立神经肌连接。 近年来，有人将胚胎运动神经元移植入失神经肌肉中，也观察到运动终板的形成，肌萎缩减轻。但组织培养神经肌连接形成数量有限，神经元移植则存在免疫排斥反应较强的缺点。 神经干细胞是神经科学领域近10 年来最热门的研究方向之一。“神经干细胞”指的是一群具有自我复制或自我更新能力的原始细胞，具有多分化潜能，在特定的因素影响或诱导下，能向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。神经干细胞处于一种较原始的、未分化状态，从而不表达或少表达个体所特有的抗原，表现出更低的抗原性，更容易在受体内成活。神经干细胞移植后能迁移、分化、整合入宿主组织。已有研究表明神经干细胞表达多种细胞因子， 如NGF、PDGF、LIF 等，不仅有神经营养因子，也有肌营养作用的因子，如BDNF 等。不同组织来源的神经干细胞更容易分化为相应组织中的神经细胞，如人们常用中脑来源的神经干细胞来诱导分化为多表1 术后16 周各组电生理检测结果组别 坐骨神经肌纤维神经 肌肉纤颤电波幅度巴胺能神经元。神经干细胞移植后的分化不仅与移植前的定向诱导分化培养有关，更与移植后受体局部微环境有关。Galli 等在研究神经干细胞分化潜能时，将神经干细胞移植到肌组织中，发现散在的神经干细胞可以分化为肌细胞并形成肌管，而成簇的细胞团则不分化为肌细胞。tephen 等[4] 将神经干细胞移植到横切断的坐骨神经远断端，在靶肌组织中观察到重建神经肌连接。以上研究为亟待解决的失神经肌肉萎缩防治提供了新的思路，即用神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩。 神经生物学研究证实运动神经元及认知记忆等功能的神经细胞均与乙酰胆碱有关，为胆碱能神经元，而乙酰胆碱转移酶为Ach 合成酶，也是中枢胆碱能神经元的标志酶，也可以作为胆碱能神经元的标志。 本实验研究结果表明胚胎SD 大鼠脊髓神经干细胞在维甲酸诱导下，在体内外均能检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞，这表明神经干细胞在体内外均能诱导成胆碱能神经元，实验中将其体内移植后，具有防治大鼠踇长伸肌失神经肌萎缩的作用，可以达到和大鼠神经损伤修复后通过神经再生营养肌组织相同的效果，另外维甲酸是通过何种信号途径诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元，还须做进一步研究工作。 本实验为神经干细胞移植并诱导分化为胆碱能神经元，为防治失神经肌萎缩提供了实验基础，由于本实验动物是大鼠，其神经再生能力强，到达运动终板距离短，这些使本实验没能显示出移植神经干细胞治疗失神经肌萎缩的优势。但这对于今后研究灵长类动物甚至人类预防失神经肌萎缩提供极有价值的参考。 【参考文献】 1〕 Modo M, Rezaie P, Heuschling P, et al. 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