中国医科大学研究生学位论文独创性声明
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或撰写过的研究成果，也不包含
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书
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日 期：
目 录
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一、摘要
中文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1
英文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3
二、英文缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··5
三、论文
前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”6刖磊⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”6
实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”7
实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11
讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16
结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18
四、本研究创新性的自我评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19
五、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20
六、附录
综j苤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22
在学期间科研成绩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29
致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30
个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31
·中文论著摘要·
抑郁症模型大鼠海马Caspase一3和Bcl．2表达变化
及米氮平的调节作用
目 的
通过建立慢性应激抑郁症大鼠模型，研究大鼠学习记忆力改变、海马凋亡蛋
白Caspase．3和凋亡抑制蛋白Bcl．2表达变化，以及米氮平对其调节作用。
方 法
20只雌性成年SD大鼠，随机分为三组：对照组、抑郁组和治疗组。制备抑
郁症模型及米氮平治疗模型。采用Morris水迷宫实验方法评价各组大鼠的学习记
忆能力，应用免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹杂交方法定性定量分析慢性应激
及米氮平治疗对大鼠海马组织Caspase．3蛋白和Bcl．2蛋白表达的影响。
实验结果
Morris水迷宫实验显示，各组大鼠在隐匿平台所在象限的游泳距离用其占四
个象限总游泳距离的比值表示，组间有统计学差异60<0．01)。多重比较示，抑郁
组大鼠在目标象限的游泳距离较对照组和治疗组减少，有统计学差异p
0．05)。
光镜下观察Caspase．3和Bcl．2免疫组化染色海马切片。Caspase一3及Bcl．2阳
性颗粒物呈棕色，分别表达于神经元细胞核内和细胞浆内。对照组及治疗组大鼠
海马神经元形态正常，可见Caspase．3及Bcl．2阳性颗粒物表达；抑郁组大鼠海马
神经元萎缩变形伴有细胞核固缩改变，以CAl和CA3神经元破坏最明显，形态
正常的神经元少见，正常神经元中Bcl．2阳性颗粒物表达明显减少。
蛋白免疫印迹杂交发现Caspase一3蛋白表达水平组间有统计学差异p<0．05)，
多重比较发现，抑郁组大鼠海马Caspase．3蛋白表达水平显著高于对照组和治疗
组，有统计学意义600．05)2Bcl-2蛋白表达水平组间有统计学差异p<0．05)，多
重比较发现，抑郁组大鼠海马Bcl．2蛋白表达水平显著低于对照组和治疗组，有
统计学意义p<0．05，P<0．05)，而对照组和治疗组海马Bcl-2蛋白表达水平未见统
计学差异p>0．05)。
结论
1、慢性应激抑郁症模型大鼠学习记忆力下降、海马Caspase．3蛋白异常高表
达、海马Bcl．2蛋白异常低表达。
2、米氮平治疗可以改善抑郁症模型大鼠学习记忆能力、分别下调、上调
Caspase．3蛋白和Bcl．2蛋白表达水平至接近正常水平。
关键词
慢性应激；米氮平；海马；Caspase．3；Bcl．2
2
·英文论著摘要·
RegulationofhippocampalCaspase-3andBcl-·2
protef
。 。’
ratdel modelLndtheeffectsofprotein 111tlleratdepressionmoelandtlleellectsOt
chronicmirtazapinetreatment
ob．i
ectiveTo investigatethechangesinhippocampalCaspase·-3andBcl—-2proteinlevelsas
well鹊thebehavioralchangesinratdepressionmodel，andtheeffectsofmirtazapine
缸．eatment．
Methods
TwentyfemaleSDratswererandomlydividedintothreegroups：thecontrolgroup，
theexperimentalgroupandthetreatmentgroup．Ratdepressionmodelandmirtazapine
treatmentmodelwereprepared，followedbyMorriswatermazetesttoevaluatethe
learningandmemorychangesamongthegroups．Immunochemistrystainingand
westernblotassayweredoneto，qualitativelyandquantitatively,assessthechangesin
hippocampalexpressionofCaspase一3andBcl一2proteinamongthegroups．
Results
IntheMorriswatermazetest，theswimlengthsinthequadrant，wherethehidden
platformWasplaced，whichwereexpressedaspercentagesofthetotalswimlengthsin
thefourquadrants，weresignificantlydifferentamongthegroupsp<0．01)．Theswim
lengthsinthetargetedquadrantintheexperimentalgroupweresignificantlyshorter
thanthatinthecontrolgroup(p<0．O1)andthanthatinthetreatmentgroup(p<0．05)，
whereasnodifferencesintheswimlengthsexistedbetweenthecontrolandthe
treatmentgroup(p>0．05)．
Caspase·-3andBcl··2immunohistochemistrystainingforhippocampalsections
Wasobservedtraderlightmicroscope．Caspase-3一positivegranulesandBcl一2-positive
granulesexisted，separately,inthenucleiandcytoplasmofhealthyhippocampal
neurons．Inthecontrolandthetreatmentgroup，Caspase-3一positiveandBcl一2一positive
3
granuleswereobservedinhealthyneurons；whileintheexprimentalgroup，many
shrtmkenandcondensedneurons、析tllpyknoticnuclei．especiallyintheCA1 andCA3
regions，wereobserved，healthyneuronswererare，andBcl-2。positivegranules
obviouslydecreased．
WesternblotassayshowedstatisticaldifferencesofthehippocampalCaspase-3
proteinlevelsamongthethreegroups(p<0．05)．ThehippocampalCaspase-3protein
levelsintheexperimentalgroupweresignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup
andthetreatmentgroup(p0．05)．
ThehippocampalBcl·2levelsweresignificantlydifferentamongthegroups(p<0．05)，
whichintheexperimentalgroupwerehigherthanthatinthecontrolgroupandthe
treatmentgroup(p<0．05，P<0．05)，andthereWasnostatisticaldifferencesinthe
expressionofBcl．2proteinbetweenthetreatmentgroupandthecontrolgroup(p>
0．05)．
Conclusions
1．Depressionmodelratsmadebychromestressshowedimpairedlearningand
memory,significantlyhighlevelsofhippocampalCaspase-3protein，andlowlevelsof
hippocampalBcl一2protein．
2．Mirtazapineattenuatedtheimpairedlearningandmemoryofrats，separately
andsignificantlydown—andup-regulatedtheabnormalexpressionofCaspase-3and
Bcl一2proteininthehippocampitonormallevels．
KevWords
Chromestress；Mirtazapine；Hippocampi；Caspase·3；Bcl一2
4
·英文缩略语·
5
·论文·
抑郁症模型大鼠海马Caspase一3和Bcl一2表达变化
及米氮平的调节作用
刖 吾
抑郁症是由各种原因引起的以心境低落或情感障碍主要症状，以抑郁心境自
我体验为中心的临床症状群或状态。具有高发病率、高复发率、高死亡率的特点，
严重影响人类生活质量。
世界卫生组织2009年在世界精神卫生日上公布的数据显示【】J，抑郁症是目前
全球范围内导致残疾或导致劳动能力丧失的几种主导疾病之一，预计到2020年将
上升至第二位，并将于2030年跃居为全部健康问题的首位，并成为各国尤其是发
展中国家最大的社会负担。对抑郁症发病机制及治疗方法的研究将有助于减轻社
会负担，改善人群生存质量。
最早有关抑郁症发病机制假说是单胺类神经递质假说。假说认为体内单胺类
神经递质水平不足或者严重缺乏是导致抑郁症发病的原因。但是，随后研究发现
给予抗抑郁药物大脑内单胺类神经递质水平迅速上升，但抗抑郁药物起效仍需要
漫长的潜伏期，二者间矛盾不完全支持单胺类神经递质假说【2】。由于抑郁症患者
出现海马等重要脑功能区萎缩及功能改变【31，参与神经元存活以及可塑性调节的重
要信号通路在抑郁症发病机制及抗抑郁药物药理机制中的作用逐渐受到重榭41。
凋亡蛋白Caspase家族成员是执行凋亡的主要因子，可以引起DNA片段增加、
细胞膜起泡等凋亡的特征性改变，参与各种急慢性神经退行变疾病所致细胞死亡
iSl。Caspase．3作为凋亡通路信号传递的交汇点，在程序性细胞死亡中起主要作用，
因而推测其可能通过凋亡机制参与抑郁症患者海马萎缩、神经元／神经胶质细胞萎
缩过程[61。此外，最新研究发现，Caspase．3不必然引起神经元凋亡，Caspase．3蛋
白及其活性形式表达于海马健康神经元内，是长时程抑制诱导及谷氨酸受体内化
所必需的【7i。长时程抑制作为神经元重要电活动形式之一，调节神经元突触受体表
6
达与分布，诱导神经元突触对相应外界刺激做出长时程调整及结构修饰，并因而
被认为是各种学习记忆过程所必需的【8】o因此，Caspase．3可能通过可塑性机制对
中枢神经系统结构和突触功能进行长时程调节最终影响大脑的结构和功能改变。
总之，Caspase．3的表达变化可能影响神经元存活和突触可塑性，最终参与抑郁症
发病机制。
另外，凋亡蛋白CaSpaSe．3活性受抗凋亡蛋白Bcl．2抑制。Bcl．2蛋白通过与
自身或与其他Bcl．2家族成员如Bcl．xl等形成同源或异源二聚体调节CaSpaSe一3活
化所需细胞色素C的释放，从而有效抑制CaspaLse．3活性【91。
米氮平是近年来研发的具有5．羟色胺和去甲肾上腺素双重再摄取抑制作用的
新型抗抑郁药，但目前有关抗抑郁药物米氮平药理机制的研究很少。本实验构建
慢性应激大鼠模型并给予米氮平治疗，研究分析大鼠学习记忆能力及海马
Caspase一3和Bcl-2蛋白表达变化，探讨Caspase一3和Bcl．2在抑郁症发病机制及米
氮平对其调节作用。
实验方法
一、实验材料
实验动物：成年雌性SD大鼠20只，购自中国医科大学实验动物中心。
主要试剂：兔抗大鼠CaSpaSe-3，兔抗大鼠Bcl-2，生物素标记的山羊抗兔IgG
SABC免疫组化试剂盒，DAB显色剂，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，
f；-actin，SDS．PAGE凝胶制备试剂盒，ECM．Kit发光试剂盒等均购自博士德公司。
主要仪器：Moms水迷宫实验系统及配套摄像机和记录软件，石蜡切片机，
水浴箱，恒温箱，Olympus显微镜，一80。C冰箱，制冰机，台式低温高速离心机，
酶标仪，垂直电泳仪，半干转印仪，水平摇床，分析天平，凝胶图像分析系统等。
二、实验动物分组及模型制备
分组：20雌性成年SD大鼠，体重180．2009，由中国医科大学实验动物中心
提供，清洁级。大鼠自由进食水，常温、正常昼夜节律下饲养1周以适应环境。
用数字表法随机分为三组：对照组(Controlgroup，Con，n=4)、抑郁组(Experimental
group，Exp，n-8)和治疗组(Treatmentgroup，Tre，n-8)。
模型制备：对照组大鼠合养，不给予任何应激刺激和药物治疗。抑郁组和治
7
疗组大鼠孤养，并给予一系列慢性不可预见性应激刺激【101，包括束缚应激、斜笼
30。、昼夜颠倒、禁食、禁水、夹尾5min、湿垫料、冰水游泳10min等，具体见
表1。给予慢性应激刺激的同时，治疗组大鼠每日口饲米氮平盐溶液(10mg／kg；
2ml／kg)，米氮平标准品，由华裕制药有限公司提供，其剂量根据动物换算公式【ll】，
每公斤体重10mg抑郁组大鼠每日口饲生理盐水(2ml／kg)。
表1，21天慢性不可预见性应激
注：悬尾5min，束缚4h，游泳5min，央尾5min，湿笼17h(16：00．次日9：00)，
斜笼17h(16：00．次日9：00)，空笼17h(16：00．次日9：00)，禁水16h(16：00．次日9：00)，
禁食16h(16：00．次日9：00)，昼夜颠倒(48h光照后48h黑暗)。应激源随机安排到
21d，每日两次。
三、Morris水迷宫实验
实验第18．21天，用Morris水迷宫(Morriswatermaze，MWM)实验测试大鼠空
间学习及记忆能力。MwM是一个直径150cm、高50cm的圆形水池，内池壁为黑
色，水深30cm，水温26-4-1℃。池壁上标有东南西北四个入水点分别用E，S，W
和N表示，将水池划分为SW，NW，SE和NE四个象限。NE象限正中离池壁
33cm处放置一个直径为9cm，高29cm的圆形透明平台，平台顶距水面lcm，迷
宫上方安装有带显示系统的摄像头，同步记录大鼠活动轨迹。实验历时5天【12】，
第1天，水池中未放置隐匿平台，将大鼠放入水池自由游泳120min，以便大鼠适
应训练过程：第2、3、4天，是大鼠学习记忆的关键时机，将透明平台放入水池
中固定位置，每日训练分为上午和下午两段，每段每只鼠从各个象限入水训练4
次：将大鼠面向水池从E，S和W三个入水点入水，观察并记录120s内大鼠寻找
8
并爬上透明平台的路线图以及所需时间即逃避潜伏期，对于在规定时间内未找到
隐匿平台的大鼠，引导其爬上隐匿平台并停留10s加深印象，每次训练间隔60s；
第5天，第5次训练时撤走透明平台，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，
记录120s内大鼠穿越平台所在位置的次数及搜索透明平台的路线图，计算各象限
内游泳距离，计算NE象限游泳距离占总游泳距离的百分比。
四、免疫组织化学染色
MWM实验12小时后，将10只大鼠(对照组2只、抑郁组4只、治疗组4只)
用于免疫组化染色。具体取材及操作如下：用戊巴比妥经腹腔深麻醉，大鼠固定
于灌流台，剖开胸腔，剪开右心耳，经左心室快速灌注37。C生理盐水(含适量肝素)，
待右心耳流出液无色澄清时用4％多聚甲醛溶液灌注全身，大鼠痉挛、四肢伸直时
取脑组织并修块，将脑修块置于4％多聚甲醛溶液中4。C条件下固定过夜。梯度酒
精脱水，石蜡包埋，切成51xm切片。用涂有明胶铬明矾的载玻片捞片。
采用免疫组化ABC法，步骤如下：①上述石蜡切片常规脱蜡，用新鲜配制的
3％过氧化氢溶液室温孵育10min，蒸馏水冲洗3次；②将切片浸人0．01M构椽酸
缓冲液中，微波加热至沸腾，间隔lmin后重复一次，待自然冷却后，0．01MPBS
洗5minx2次；③滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30mira④分别滴加兔抗大
鼠Bcl．2多克隆抗体(即用型)(1：lOO)和兔抗大鼠Caspase一3抗体(即用型)(1：100)，4。C
孵育过夜，0．01MpBS洗5minx3次；⑤滴加生物素标记的山羊抗兔(即用型)
(1：200)，室温孵育30min，0．01MPBS洗5minx3次；⑥滴加SABC(艮O用型)，室
温孵育30min，0．01MpBS洗5minx3次；⑦滴加DAB显色(即用型)，显微镜下控
制显色时间2-4min，自来水冲洗终止显色反应；⑧苏木素轻度复染，脱水、透明、
中性树胶封片。
五、蛋白免疫印迹杂交
MwM实验12小时后，另外10只大鼠(对照组2只、抑郁组4只、治疗组4
只)用于蛋白免疫印迹杂交(WestemBlot)实验。具体取材及操作如下：用戊巴比
妥经腹腔深麻醉，断头取脑，于冰上快速剥离海马组织，．80。C冻存。取大脑海马
组织称重，按1：100(g／l,t1)加入哺乳动物组织蛋白抽提试剂，冰上匀浆，4。C
1,4000rpm离心30min,收集上清。加入LoadingBuffer，隔水煮沸5min。取适量
9
样品，用Commassie改良增强型蛋白质定量试剂，按照微孔板法在酶标仪下测
595nm处光吸收值，计算蛋白浓度。
WesternBlot实验过程：①制胶及上样：用SDS．PAGE凝胶制备试剂盒配制
12％分离胶，灌注分离胶，无水乙醇封闭30min，配置并灌注的5％浓缩胶，插入
加样梳，室温下静置20min。将制备好的凝胶玻璃板垂直固定于垂直电泳仪上，
电泳仪的上下两槽分别加入电泳缓冲液使其没过凝胶水平，以电泳缓冲液冲洗加
样孔数次。每孔上样12J-tl，含50lag蛋白样品，不足体积用1xPBS补足。②电泳：
凝胶电泳仪初始电压60V，30mira80V，10min；120V，分离条带。③转膜：从
玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。裁取与胶同样大小的硝酸纤维素
膜，以ddH20激活5min，浸泡于转移缓冲液约30min待用。按由下向上的顺序将
滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸铺到半干转印仪中，保证每层之间没有气泡。
硝酸纤维素膜在正极、胶在负极，60V稳压转移40min。④封闭：按照蛋白质分
子量Marker指示的位置切下目的条带所在硝酸纤维素膜，浸入5％脱脂奶粉封闭
液中室温振摇lh。⑤杂交：以TBST洗膜，一抗多克隆抗体封闭(Bcl．2以1：200
稀释；Caspase．3以1：300稀释)，以小鼠源性13-actin(1：500)作为内参，按O．1ml／cm2
加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃轻微振摇过夜，TBST
洗膜，5minx3次，辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗封闭(1：5000)，内参二抗为辣根
酶标记山羊抗小鼠IgG(1：2000)，按0．1ml／cm2加入封有膜的杂交袋中，去除所有
气泡，室温下轻微摇动60min，TBST洗膜，5minx3次。⑥发光：等体积混合适
量ECL试剂盒A液和B液滴加到膜上，反应1min，用ECL成像系统采集图像。
图像分析：用ImageJ软件测量Bcl．2条带目标灰度值，灰度单位分为255个
等级，蛋白表达量与灰度值呈反比关系。每张切片双侧海马的平均目标灰度值来
代表这张切片的目标灰度值。
六、统计学分析
计量数据用Mean+SD表示，采用SPSSl3．0软件One—WayANOVA进行统计分
析，组间差异显著时进行多重比较(Posthoe)。P0．05)。但大鼠在NE
象限内游泳距离占在四个象限内总游泳距离的比例，方差齐性检验尚不能认为总
体方差不齐p>0．05)，单因素方差分析示组间存在统计学差异p<0．01)。多重比
较发现抑郁组大鼠NE象限游泳距离比例减小，与对照组比有统计学差异p<
0．01)；治疗组大鼠NE象限游泳距离比例增加，与抑郁组比存在统计学差异p<
O．05)；治疗组大鼠NE象限游泳距离比例与对照组相比无统计学差异⑦>0．05)。
表3，穿越隐匿平台次数及NE象限游泳距离占总游泳距离比例(Mean+SD)
注：对照组与抑郁组比较，幸宰P<0．01；抑郁组与治疗组比较，Ap<0．05
吾2000
∞
=
游
泳1500
距
离
O
对照组 抑郁组 治疗组
Ermrbars：+产2．00SD
象限
●四个象限
●NE象限
图2，Morris水迷宫实验记忆阶段，大鼠在四个象限总游泳距离和NE象限游
泳距离
12
二、免疫组织化学染色结果
光镜下观察海马切片Caspase．3免疫组化染色：对照组海马神经元排列整齐紧
密，胞浆透明，细胞核圆润呈现均匀一致的棕色(Caspase．3免疫反应阳性)，图3A，D
为对照组海马切片CAl、CA3区神经元；抑郁组海马尤其是CAl和CA3区神经
元萎缩，出现核固缩浓染、染色质边集现象，部分神经元呈现胞浆和胞核水肿，
胞体增大甚至空泡样改变，如图3B，E所示，其间散在少量形态正常、胞核呈棕色
免疫反应阳性的神经元细胞；治疗组大鼠海马神经元形态较抑郁组明显改善，趋
近正常，图3C，F为治疗组大鼠海马切片CAl和CA3区神经元。
光镜下观察海马切片Bcl．2免疫组化染色：对照组海马神经元排列整齐紧密，
胞浆呈现均匀一致的棕色(Bcl．2免疫反应阳性)，核仁淡蓝，图4A，D为对照组CAl、
CA3区神经元；抑郁组海马尤其是CAl、CA3区多数神经元萎缩、形态不规则，
核染色质浓集呈深蓝色，可见少量形态正常神经元，这些神经元细胞浆内棕色免
疫反应阳性颗粒明显减弱，如图4B，E；治疗组大鼠海马神经元胞膜棕色免疫反应
阳性颗粒较抑郁组增多，细胞形态趋于正常，图4C，F为治疗组CAl、CA3区神
经元。
舔嗡蕊露冀霉≤
豫≮笺蘩璐≤
图3，海马切片CauspaSe．3免疫组化染色(x400)。Con为对照组，Exp为抑郁
组，Tre为治疗组；A，B，C代表三组大鼠海马切片CAl区神经元；D，E，F代表三组
大鼠海马切片CA3区神经元；黑色箭头指向
13
．3免疫反应阳性神经元，红
色箭头指向变性破坏的神经元。
吾薛漆主媾暑蠲
亨隧一壤一
图4，海马切片Bcl．2免疫组化染色(x400)。Con为对照组，Exp为抑郁组，
Tre为治疗组；A，B，C代表三组大鼠海马切片CAl区神经元；D，E，F代表三组大鼠
海马切片CA3区神经元；黑色箭头指向Bcl．2免疫反应阳性神经元，红色箭头指
向变性破坏的神经元。
三、蛋白免疫印迹杂交结果
蛋白免疫印迹杂交技术
检测
工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训
慢性应激及米氮平治疗大鼠海马Caspase-3、
Bcl．2及fl-actin蛋白条带，如图5所示，以fl-actin蛋白为内参校J下得到的Caspase-3
和Bcl．2蛋白相对表达量见表4。
对C嬲pause．3蛋白相对表达量进行方差齐性检验p>o．os)，尚不认为总体方差
不齐，单因素方差分析示CaSpase．3蛋白相对表达量组间有统计学差异p<0．05)，
多重比较发现抑郁组海马CaspaSe．3蛋白相对表达量高于对照组和治疗组，有统计
学意义仞<0．05，P<0．05)，而对照组和治疗组海马Caspase一3蛋白相对表达量无统
计学差异p>0．05)。对Bcl．2蛋白相对表达量进行方差齐性检验，尚不认为总体方
差不齐p>0．05)，单因素方差分析示Bcl．2蛋白相对表达量组间有统计学差异p
o．os)。各组大鼠海马CaSpase．3和Bcl．2蛋白相对表达量见图6。
14
Caspase-3
Bd．2獭一穆晦痨鬻章穆。籁每≯嶙菇荔蚤躺13I咱ctin戮锄纛溯缀鳓绷缈穆骖㈥溯C—on——百r——1r
图5，大鼠海马Caspase一3、Bcl．2和p-actin蛋白条带。Con为对照组，Exp
为抑郁组，Tre为治疗组
表4，大鼠海马Caspase·3和Bcl-2蛋白相对表达量(Mean+SD)
注：对照组与抑郁组比较，车p<0．05；抑郁组与治疗组比较，Ap<0．05
Z
o
∞
=
相
对
蛋
白
表
达
量
O．OO
Caspase-3蛋白 Bd-2f白
EI∞arbam：,／-2．00SD
图6，大鼠海马CaSpaSe一3和Bcl-2蛋白相对表达量
15
组别
■对照组
●抑郁组
口治疗组
讨论
本次实验研究了慢性应激和慢性米氮平治疗对大鼠学习记忆的影响、以及对
海马C嬲paSe．3和Bcl．2蛋白表达量的影响。实验发现，与非应激正常大鼠相比，
慢性应激显著增加大鼠在水迷宫实验中的抑郁样行为，而慢性米氮平治疗则明显
改善大鼠在水迷宫实验中的学习记忆能力；同时慢性应激显著上调海马组织
Caspase．3蛋白表达量、并显著下调Bcl．2蛋白表达量，而给予慢性米氮平治疗则
将海马CaspaSe．3和Bcl．2蛋白表达量逆转至应激前水平；此外，慢性应激导致海
马神经元变性破坏，神经元变性破坏尤以海马CAl和CA3区明显，而慢性米氮
平治疗表现出明显的神经元保护作用。
为评价慢性应激及慢性米氮平治疗对学习记忆能力的影响，对大鼠进行了
Moms水迷宫实验。通过记录比较学习阶段的逃避潜伏期，并比较记忆阶段大鼠
穿越隐匿平台的次数以及大鼠在隐匿平台所在象限的游泳距离占总游泳距离的比
值，发现慢性应激显著损害大鼠学习记忆，而慢性米氮平治疗则明显改善大鼠在
Moms水迷宫实验中学习及记忆阶段的表现。既往认知及神经生物学研究认为海
马参与短期记忆到长期记忆的转换，对长时程记忆的形成极其重要，海马受损动
物需要比正常动物更多的训练才能巩固条件反射，其机制涉及神经元突触重塑过
程【13】，本次实验结果提示慢性应激导致海马功能失调，与既往临床研究结论相符，
这些临床研究发现抑郁患者表现出不同类型的依赖海马的记忆功能受损【l41。
除海马功能受损表现外，临床研究还发现抑郁患者海马结构改变，尤其表现
为海马萎缩。多年来研究认为抑郁症海马萎缩与神经元死亡增加、树突结构重构
有关f81。本次实验通过免疫印记杂交技术发现，相比于正常大鼠，慢性应激制备的
抑郁大鼠海马内Caspase．3蛋白相对表达量显著增加，而给予抗抑郁药物米氮平
Caspase一3蛋白相对表达量下调至正常水平。既往研究认为CaSpaSe．3蛋白的主要
作用在于执行凋亡，是执行凋亡的关键因子，在中枢神经系统神经元死亡中起重
要作用【5l，同时尸检研究还发现抑郁症患者海马内作为凋亡主要标志的DNA片段
量增加【6】。结合免疫组化染色发现的抑郁组大鼠海马组织尤其是CAl和CA3区神
经元萎缩及细胞核固缩浓染现象，提示CaSpase家族蛋白导致的凋亡可能是导致
这些神经元固缩破坏的原因之一。因而，慢性应激和慢性米氮平治疗对Caspase一3
16
蛋白表达量的不同调节提示Caspase．3蛋白可能通过凋亡、促进细胞死亡这条途径
参与抑郁症起病、发展及药物治疗，这是CaspaSe．3蛋白参与抑郁症起病及米氮平
治疗的可能机制之一。此外，李等人在最近实验中得到了C2Lspase．3蛋白在海马成
熟神经元中起非凋亡作用的证据17]。通过一系列实验，作者证明CaspaSe．3蛋白及
其活性形式存在于海马健康神经元细胞内而不引起细胞死亡，Caspase．3蛋白经线
粒体机制活化后的活性形式是长时程抑带U(Longtermdepression，LTD)诱导及0c．氨
基羟甲基恶唑丙酸(仅一amino一3-hydroxy·5-methyl．4．isoxazolepropionicacid，AMPA)
受体内化必需的。AMPA受体是代谢性谷氨酸受体之一，主要介导快速的兴奋性
突触传递。因而，推测Caspase一3蛋白还可能通过非凋亡机制，即通过诱导易化
LTD这条途径参与海马萎缩及树突棘丢失，参与中枢神经系统可塑性调节。实验
同时证明诱导易化LTD过程中CaSpase．3蛋白激活所需的N．甲基．D．天冬氨酸
(N．methyl．D—aSparticacid，NMDA)受体通路开放程度及钙离子内流量与引起细胞
凋亡时CaSpaSe．3蛋白激活所需的NMDA受体通路开放程度及钙离子内流量相比
明显减少。NMDA受体是另一种代谢性谷氨酸受体，在神经可塑性和发育中起到
重要作用。本次免疫组化染色示Caspase．3免疫阳性反应产物广泛表达于正常大鼠
及米氮乎治疗后大鼠的海马神经元细胞，支持Caspase．3蛋白表达于海马健康神经
元细胞而不引起细胞死亡的结论。此外，免疫组化染色所见抑郁组大鼠海马切片
中CaspaSe．3免疫阳性细胞数量较少，考虑原因可能与神经元破坏严重及细胞凋亡
过程持续时间很短因而难于捕捉有判”】，与既往抑郁症患者尸检结论相符，尸检
同样发现凋亡细胞散布于海马等边缘结构，但是可检测到的阳性细胞数量很少【6】。
本次实验还研究了慢性应激及慢性米氮平治疗对大鼠海马Bcl．2蛋白表达量
的影响。免疫印迹杂交及免疫组化染色都发现抑郁大鼠Bcl．2蛋白表达量显著下
降，而米氮平治疗则上调Bcl．2蛋白表达量至正常水平。本次实验结果与既往研
究结论相符合。这些研究发现慢性应激降低海马Bcl．2mRNA表达量，而抗抑郁治
疗后海马Bcl．2蛋白免疫杂交量增加【16，171。Bcl一2蛋白可能通过其抑制凋亡及其神
经元保护作用两方面参与抑郁症发病机制。既往研究证明Bcl．2蛋白具有强烈抑
制凋亡蛋白活化的作用，提示Bcl．2蛋白表达量下降可能使海马更容易受到促凋
亡因子诱导损伤【l01，本次免疫组化染色发现海马组织出现多量固缩变性神经元支
17
持上述结论。其次，Bcl．2蛋白除了抗凋亡促进神经元存活作用外，对神经元细胞
还具有显著的类似神经营养因子的保护作用【181，Bcl．2蛋白表达量下降可能促使神
经元萎缩、不利于神经元轴突和树突分支。因而，我们推测Bcl．2蛋白可能通过
凋亡和非凋亡两条途径参与抑郁症的神经病理改变，而Bcl．2蛋白这两条途径可
能也是米氮平药理机制之一。既往有的研究结果与本实验结果不完全符合，这些
研究发现不可预见性应激选择性降低海马Bcl．xlmRNA表达量，而海马Bcl一2
mRNA表达量不受影响，考虑可能与实验中采用的应激方式、实验动物及实验方
法不同有关【191。
总之，本次实验结果提示慢性应激可能通过改变海马Caspase．3和Bcl一2蛋白
表达量导致大鼠海马结构和功能性改变，而抗抑郁药米氮平治疗则通过逆转
Caspase．3和Bcl．2蛋白异常表达减少细胞死亡，促进神经纤维网修复实现其药理
作用。
结论
l、慢性应激抑郁症模型大鼠学习记忆力下降、海马Caspase．3蛋白异常高表
达、海马Bcl．2蛋白异常低表达。
2、米氮平治疗可以改善抑郁症模型大鼠学习记忆能力、分别下调、上调
Caspase一3蛋白和Bcl．2蛋白表达水平至接近正常水平。
18
·本研究创新性的自我评价·
目前国内外研究认为抑郁症发病机制与参与神经元存活以及可塑性调节的重
要信号通路有关。凋亡蛋白家族成员，尤其是CaSpaSe．3在神经元存活以及可塑性
方面起重要调节作用。本实验通过制备大鼠抑郁症模型以及米氮平治疗模型，采
用Moms水迷宫、免疫组化染色和免疫印迹杂交实验方法，分析了大鼠的行为学
改变及海马组织凋亡蛋白CaSpaSe．3和抗凋亡蛋白Bcl．2表达变化，从而探讨了凋
亡蛋白CaSpaSe．3和抗凋亡蛋白Bcl．2在抑郁症发病机制中的作用，并首次从这个
方面探讨了米氮平的调节作用。本实验为分析抑郁症发病机制及探讨药物起效机
制提供了实验依据。
19
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·综述·
抑郁症发病机制研究进展
2009年9月2日至6日世界卫生组织在世界精神卫生日上公布的最新数据显
示【IJ，抑郁症是目前全球范围内导致患者劳动能力丧失的几种主导疾病之一，2006
年在这类疾病中排第四位，预计到2020年将上升至第二位，并将于2030年跃居
为全部健康问题的首位，并成为最大的社会负担。目前全球范围内约有45千万人
正遭受抑郁症及抑郁症所致残疾的困扰，这些人中大部分生活在发展中国家。届
时抑郁症将成为发展中国家严重的负担。对抑郁症发病机制及治疗方法的研究将
有助于减轻社会负担，改善人群生存质量。
传统神经生物学研究认同抑郁症发病的单胺类神经递质假说，即体内单胺类
神经递质水平不足或者严重缺乏是抑郁症发病的原因。假说最初是因为降压药物
利血平药物作用临床观察时偶然发现其严重减少脑内5．羟色胺等单胺类神经递质
表达并最终引起抑郁症而提出来的，因而推测单胺类神经递质代谢紊乱与抑郁症
发病间可能存在相关性。但是近年来随着研究深入，发现单胺类神经递质在脑内
的表达水平与抑郁类精神疾病临床表现及严重程度并不完全一致，并且发现许多
其他因素在抑郁症发病中起到不可忽视的作用【2】。随着研究进展，细胞内成分及
细胞结构改变在抑郁症发病中的作用逐渐受到重视，同时神经可塑性紊乱被认为
可能是抑郁症发病的生物学基础【3】。围绕新认识抑郁症新假说逐渐形成，其中包
括脑源性神经营养因子假说和炎症及神经退行性变假说。
一、抑郁症的神经营养因子假说
‘
神经营养因子对中枢神经系统的各种功能的实现起着至关重要的作用，包括
从神经元分化存活到突触生成及依赖动作电位的突触可塑性【4】。脑源性神经营养
因子(brain—derivedneurotrophicfactor,BDNF)作为神经营养因子家族内分泌蛋白中
的一种，已经被证明与抑郁症有关。
少量人体研究为神经营养因子假说提供了相关支持【51。与正常人组织相比，
抑郁症患者尸检脑组织中BDNF表达水平较低，而生前服用抗抑郁药的患者脑组
织中BDNF表达相对增加。此外，脑组织造影发现抑郁个体海马体积减小，而抗
抑郁治疗可以逆转这种现象。
慢性应激动物模型实验也为神经营养因子假说提供了实验依据。慢性应激动
物模型大脑不同区域神经元萎缩或消失，其中包括在记忆和认知中发挥重要作用
的海马结构f61；应激事件降低海马BDNFmRNA的表达。相反，各种不同种类的
抗抑郁药及电休克治疗均能显著地增加海马BDNFmRNA的表达水平。慢性应激
动物模型BDNF表达水平增加依赖于慢性抗抑郁治疗，这点与临床所见抗抑郁药
起效缓慢相一致【71。此外，少量研究发现向啮齿类动物侧脑室内直接注射BDNF
可以产生抗抑郁效果【81。
但是近年来研究发现，BDNF在体内有两种存在形式：未经加工处理的前体
形式(proBDNF)和加工处理后的成熟形式(matureBDNEmBDNF)，其前体形式
proBDNF不是无活性的中间产物，而是有活性的配体，proBDNF和mBDNF与各
自不同的跨膜受体：神经生长因子低亲和力受体(thep75neurotrophinreceptor,
p75NTR)和酪氨酸激酶受体(Trkreceptortyrosinekinase，TrkB)结合在神经系统可
塑性中发挥重要作用。既存研究只证实了应激事件和抗抑郁治疗对海马总的
BDNFmRNA和蛋白表达水平起相反作用，并未区分proBDNF和mBDNF两种
存在形式各自发挥的作用。因而深入研究进一步区分proBDNF和mBDNF在抑郁
症发病机制中各自所起的作用。
目前研究认为结合各自受体后BDNF成熟形式和前体形式分别参与调节长时
程增强(10ngtermpotential，LTP)和长时程抑f1]lJ(10ngtermdepression，LTD)对细胞生
存、结构变化以及突触可塑性发挥完全相反的影响。
关于mBDNF在海马LTP中的作用，Pang等人研究认为mBDNF是LTP诱导
的必要因素191。弱刺激通常只引起早期长时程增强(earlyphaseofUEE．LTP)，但
给予弱刺激后向海马切片内注射mBDNF可以引出强直的晚期长时程增强(1ate
phaseofLTP,L．LTP)。此外，整个实验过程中使用抑制剂抑制蛋白合成后，mBDNF
可以挽救海马切片受
浙公网安备 33021202002483