生物技术制药课件

生物技术制药BiotechnologicalPharmaceutics*2019-2-26一、课程内容 第一章绪论 第二章基因工程制药 第三章动物细胞工程制药 第四章抗体制药 第五章植物细胞工程制药 第六章酶工程制药 第七章发酵工程制药*2019-2-26Chapter1绪论*2019-2-262019-2-26第一节生物技术的发展史一、生物技术（biotechnology）生物技术：以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。*2019-2-26⑴不可取代性（育种、制药）⑵快速、精确（单克隆抗体检测妊娠）⑶低耗、高效（生物酶催化：化学催化）⑷副产物少、副作用小、安全性好⑸高附加值性⑹符合生态型的经济技术发展体系生物技术的优越性*2019-2-26现代生物技术的基础学科和分支 分子生物学 微生物学 生物化学 遗传学　　 细胞生物学 化学工程　　　　　　现代生物技术医药生物技术生物技术疫苗生物技术诊断农业生物技术家畜生物技术海洋生物技术*2019-2-26二、生物技术发展简史 传统生物技术的技术特征是酿造技术 公元前6000年古代巴比伦人酿造啤酒 公元前4000年埃及人发酵面包 我国殷朝制酱 周朝制醋 特点:自然发酵、全凭经验 １传统生物技术阶段*2019-2-26 近代生物技术的技术特征是微生物发酵技术 1674年荷兰布商列文虎克自制了高倍显微镜(300倍左右)观察到了微生物。 1865年法国科学家巴斯德证明了发酵原理。 1928年英国Fleming发现青霉素 1940年英国弗洛里、钱恩分离出青霉素２近代生物技术阶段*2019-2-26近代生物技术时期的特点：1.产品类型多初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体）等；2.生物技术要求高（纯种、无菌、通气、产品质量要求也高）；3.生产设备规模巨大500立方米，2000立方米；4.技术发展速度快。青霉素初期发酵效价为200U/ml,现在为80000U/ml。*2019-2-26 现代生物技术的技术特征就是以基因工程为首要标志 1953年Watson、Crick提出DNA双螺旋结构 1973年建立DNA重组技术（Boyer&Cohen，美国） 1975年建立单克隆抗体技术（杂交瘤细胞） 1978年大肠杆菌表达出胰岛素 1997年英国克隆多利羊 ３现代生物技术*2019-2-26 现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术*2019-2-26 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术 ⑽海洋生物技术 ⑺现代微生物发酵技术*2019-2-26不能忘记的人JDWatsonFHCCrick1953年4月25日，英国《自然》杂志发表了沃森和克立克的文章“核酸的分子结构—DNA的一个结构模型”。标志着DNA双螺旋结构的建立，从此，遗传学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子阶段。*2019-2-26不能忘记的人FSangerWGilbertSanger（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。22年后，他因测定了一种噬菌体的一级结构获1980年的诺贝尔化学奖。Gilbert在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。*2019-2-26不能忘记的人PaulBergBerg（美国生物化学家）通过把两个不同来源的DNA连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”于1980年获诺贝尔化奖。*2019-2-26不能忘记的人KaryBMullis1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的聚和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。*2019-2-26第二节生物技术药物生物技术制药：生物技术药物：生物药物：采用现代生物技术，按照人的设想，借助动植物微生物来生产所需的医药品。一般来说,采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。生物技术药物、生化药物、微生物药物、海洋药物、生物制品的统称。*2019-2-26生物技术药物分类 重组蛋白质药物 治疗性抗体药物 核酸药物干扰素、生长激素、胰岛素、集落刺激因子等Panorex单抗用于结肠直肠炎治疗Zenapax用于治疗急性肾移植排斥反应反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸、裸DNA疫苗与基因药物*2019-2-26生物技术药物的特性 1.分子结构复杂 2.具有种属特异性 3.治疗针对性强、疗效高 4.稳定性差 5.基因稳定性 6.免疫原性 7.体内的半衰期短 8.受体效应 9.多效性和网络性效应 10.检验的特殊性*2019-2-26第三节生物技术制药一、生物技术制药的特征 高技术高知识层次的人才和高新的技术手段 高投入一个新的生物医药的平均费用为1～3亿美元，有的高达6亿。 高风险成功率为5%－10%，研制时间却需8－10年。 高收益利润率回报可高达10倍,上市后2－3便可收回投资。*2019-2-26二、生物技术在制药中的应用 1.基因工程制药 （1）基因工程药物品种的开发生长激素抑制素1mg传统法：10万只羊的下丘脑，现：10L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg （2）基因工程疫苗 （3）基因工程抗体 （4）基因诊断与基因治疗*2019-2-26 （5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型 （6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物 （7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用将血红蛋白基因克隆进菌种后可提高菌种对缺氧环境的耐受力。 （8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物人体蛋白AAT10万美元/g，转基因羊羊奶中20g/L*2019-2-26 2.细胞工程制药 （1）单克隆抗体技术 （2）动物细胞培养 （3）植物细胞培养生产次生代谢产物 3.酶工程制药 4.发酵工程制药 工艺改进、新药研制和菌种改造*2019-2-26三、我国生物技术制药现状和发展前景 开始于20世纪70年代初，先是进行固定化酶的研究，以后固定化酶和固定化细胞的研究与应用得到发展。 70年代后期，开始跟踪国外基因工程技术的某些基础性工作。 80年代初期，开始乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素的研究，生物技术方面的项目得到了国家的支持，其中-1b型干扰素为我国首创。*2019-2-26 目前我国生物制药技术申报貌似“活跃”，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。 与发达国家相比，我国生物技术实验室技术差距不大，但在产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有20多种畅销生物药时，我国能生产10种；而现在世界上有140多种时，我国却只能生产20多种。 由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我国生物制药公司中技术和产业发展比较成熟的也仅有北京天坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企业，产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条件等影响而难以迅速进入生物制药领域。*2019-2-26医药生物技术发展展望 21世纪是医药生物技术快速发展的时期,生物制药、化学药物、中药形成三足鼎立,有效的为人类健康服务。 1.利用新发现的人类基因开发新型药物。人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 已完成。 1986年美国科学家达尔贝科提出的人类基因组计划，1990年启动该计划。23对染色体30亿对碱基，3.5万个基因进行测序。 美国承担54%，英33%，日7%，法2.8%,德2.2%,中国1%。 1999年中国加入人类基因组计划，投资3亿元，负责测定3号染色体3000万对碱基，2000年4月完成。*2019-2-26 2.新型疫苗的研制 艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。 3.基因工程活性肽的生产 基因药物:淋巴因子、生长因子、激素和酶 4.其它医药业将得到不断改造和发展 转基因药材（利用转基因的烟草来生产人造血浆将成为现实）*2019-2-265.新型生物反应器和新型生物技术不断出现 新型生物反应器有:气升式生物反应器流化床式生物反应器固定床式生物反应器袋式或膜式生物反应器中空纤维生物反应器等。*2019-2-26四、我国的医药生物技术已上市的基因工程药物和疫苗 1995年白细胞介素-2 1996年α1b-干扰素α2a-干扰素α2b-干扰素 1997年粒细胞集落因子红细胞生成素 1992年乙型肝炎疫苗*2019-2-26 作业：1、生物技术制药的概念。2、生物技术药物分为哪些类型？3、生物技术制药有哪些特征？*2019-2-26*2019-2-26Chapter2基因工程制药*2019-2-26 用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。 获取方式：生化提取基因工程表达成本高产量低质量难以保证成本低产量高活性强性质优 实例：人生长激素（侏儒症）50具新鲜尸体脑下垂体中提取采用基因工程从1～2升细菌培养液中提取获得=*2019-2-26 1982年世界上第一个基因工程药物―重组人胰岛素获准生产销售，至今已有100多个生物技术药物上市; 促红细胞生成素（EPO）以全球销售额38亿美元的业绩，居全球最畅销10种药物的第6名； 美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜首,其2002年产值和销售额已超过200亿美元; 1989年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物--重组人干扰素（IFN–α1b）上市以来，目前，世界上销售额排前10位的生物技术药物我国已能生产8种。国际生物医药产业发展动态*2019-2-26第一节概述 生物技术的核心就是基因工程，20世纪70年代基因工程诞生,最先应用在医药科学领域。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 来制备生物药物。 （如：生长激素抑制素1mg传统法：10万只羊的下丘脑，现：10L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。*2019-2-26应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。*2019-2-26利用基因工程技术生产药品的优点： （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；*2019-2-26 （4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。利用基因工程技术生产药品的优点：*2019-2-26第二节基因工程药物生产的过程基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞），内进行复制和表达的技术。*2019-2-26基因工程药物生产的上游和下游 上游阶段：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； 下游阶段：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。*2019-2-26获得目的基因组建重组质粒培养工程菌构建基因工程菌或细胞产物分离纯化除菌过滤半成品检定包装成品检定基因工程药物制备的一般过程*2019-2-26基因工程基本过程切接转增检*2019-2-26工程菌（或细胞）构建中重要的工具 工具：酶 限制性内切酶 连接酶 逆转录酶 Klenow酶大片段（DNA聚合酶I） 核酸酶S1*2019-2-26第三节目的基因的获得克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。（不能直接分离？）一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。*2019-2-26 逆转录法的步骤 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定*2019-2-26cDNA克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1*2019-2-261、mRNA的纯化 真核细胞mRNA3’-polyA（20～250) 采用OligodT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。2、cDNA第一链的合成可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。*2019-2-263、cDNA第二链的合成 除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链(碱解或RNaseH酶解) 然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3’-末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链(常用Klenow酶或DNA聚合酶I) 切除发夹结构（核酸酶S1，专一性切除单链DNA）*2019-2-264、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有三类：细菌质粒（如pBR322、pUC等）插入片段<10kb噬菌体（如gt10、gt11等）>10kb动植物病毒 根据重组后插入的cDNA能否经转录和翻译合成蛋白质非表达型载体（pBR322及gt10）表达型载体（pUC及gt11）有利于目的基因的筛选*2019-2-265、将重组体导入宿主细胞1、转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。2、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。脂质体介导：原生质体融合：电穿孔：显微注射：基因枪：病毒介导：农杆菌转染：*2019-2-266、cDNA文库的鉴定1、表型改变：抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变）a互补： 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因：缺陷恢复：2、结构特征：DNA大小：酶切图谱：杂交（核酸、蛋白）：PCR检测：DNA序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 3、免疫化学检测：表达产物分析*2019-2-267、目的cDNA克隆的分离和鉴定 从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用： （1）核酸探针杂交法。根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 （2）免疫反应鉴定法。用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。*2019-2-26 分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定（限制酶图谱、基因测序等）。 不需合成第二链mRNA逆转录酶ss-DNAPCR特异引物目的cDNA链 1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。二、逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）*2019-2-26三、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，50～60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。*2019-2-26第四节基因表达 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因高效表达：将外源基因片段拼接到另一个基因表达体系中，使即获得原生物活性又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化。*2019-2-26一、宿主细胞的选择1、培养容易、生长快速：2、容易获得较高浓度的细胞：3、能利用易得廉价原料：4、不致病、不产生内毒素：5、发热量低、需氧低、适当的发酵温度：6、容易进行DNA重组技术操作：7、产物的产量、产率高：8、产物容易提取纯化：*2019-2-26宿主细胞常用两大类：原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。*2019-2-26原核细胞⑴大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。缺点：①不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，产品多为胞内产物，提取困难；②蛋白表达后不能修饰加工（糖基化等）；③产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应；④内毒素存留。*2019-2-26⑵枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。⑶链霉菌：作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。*2019-2-26真核细胞⑴酵母是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。*2019-2-26⑵丝状真菌优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。⑶哺乳动物细胞优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。*2019-2-26二、大肠杆菌体系中的基因表达（一）表达载体表达载体必须具备的条件（1）载体能独立地进行复制(复制起点，ori)（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。*2019-2-26（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列,以便转录后能顺利翻译。如：在大肠杆菌中表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌启动子—细菌SD序列—起始密码子—结构基因—终止子。*2019-2-26常用表达载体pBV220系统启动子多克隆位点终止子阻遏子P23复制起始位点它已成功地表达了人白细胞介素2，γ干扰素和肿瘤坏死因子等外源基因。氨苄青霉素抗性基因限制性内切酶SD序列*2019-2-26pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:①来源于pUC8多克隆位点②核糖体rrnB基因终止信号③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌体cIts857阻遏子基因及PR启动子⑥pRC23的PL启动子及SD序列*2019-2-26pBV220系统优点：①cIts857阻遏子基因与PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；*2019-2-26④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%；产物以包含体形式存在不易降解均一性好。*2019-2-26PR和PL启动子选用温度敏感突变体cIts857的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落PL、PRcIts857*2019-2-26PL和PR表达系统存在的问题PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉。缺陷1.在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。2.在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。3.pBV220系统表达的外源蛋白以包含体的形式存在，不易纯化。*2019-2-26pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入G蛋白中与IgGFc段结合的结构域基因片段180个核苷酸，下游是多克隆位点，引入了剪切融合蛋白的切点，具有与IgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。pBG-2*2019-2-26（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因表达产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：⑴外源基因的拷贝数 质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道*2019-2-26⑵外源基因的表达效率外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子转录翻译*2019-2-26①启动子和终止子的强弱；大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子。外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。*2019-2-26外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列（消除二级结构）所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。②核糖体结合位点的有效性*2019-2-26③SD序列与翻译起始密码子之间的距离SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。*2019-2-26由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因④密码子组成生物体对密码子的偏爱性*2019-2-26⑶表达产物的稳定性①组建融合蛋白；②利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽；③采用位点突变的方法；④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱表达产物的降解。*2019-2-26⑷细胞代谢负荷①宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开②细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段⑸工程菌的培养条件除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。以后会对其进行详细的介绍。*2019-2-26（三）真核基因在大肠杆菌中的表达形式⑴以融合蛋白的形式表达药物基因以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。*2019-2-26⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。*2019-2-26⑶分泌型表达蛋白药物基因优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；缺点：产量不高，信号肽不被切割。*2019-2-26三、酵母中的基因表达（一）表达载体酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。1.载体的复制序列①酵母附加体质粒（yeastepisomalplasmid，Yep类）②酵母复制型质粒（yeastreplicationplasmid，Ypp类）③酵母着丝粒质粒（yeastcentromericplasmid，YCp类）④酵母整合型质粒（yeastinteegrativeplasmid，YIp类）*2019-2-26(1)克隆载体从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和增殖的能力。(2)表达载体将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。*2019-2-26①普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增减并无严格要求。②精确表达载体，要求在启动子或信号肽编码序列的适当部位有内切酶点，以利于接入外源基因，并使他在表达后加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。*2019-2-26⒉影响目的基因在酵母菌中表达的因素⑴外源基因的剂量高稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数通常会引起细胞生长量的降低；而单拷贝数的质粒对细胞的最大生长没有影响，因而也能达到高效表达。⑵外源基因的表达效率　①启动子(组成型和诱导型)　②分泌信号的效率　③终止序列的影响外源基因表达产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：*2019-2-26⑶外源蛋白的糖基化外源蛋白经酿酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培养基中；某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于分离精制。⑷宿主菌株的影响　①菌体生长力强　②菌体内源蛋白酶要较弱　③菌体性能稳定常用的几乎是突变株，避免使用回复突变率高的不稳定体系；最好使用二倍体或多倍体菌株；　④分泌能力强(5)培养条件*2019-2-26四、动物中的基因表达 优点：产物类似于天然产物，容易分离纯化 缺点：动物细胞生长慢，培养条件苛刻，费用高培养液浓度较小。*2019-2-26主要基因工程表达体系比较* 表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌2019-2-26第五节基因工程菌生长代谢的特点菌体的生长通常用比生长速率来表示。比生长速率:菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。*2019-2-26大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。*2019-2-26一、菌体的生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用*2019-2-26分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。*2019-2-26大肠杆菌中克隆携带氧能力的透明颤菌血红蛋白（VHB蛋白）的基因可提高菌体生长速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酰辅酶A乙酸产生，可提高产量。*2019-2-26二、菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体蛋白合成增加，比生长率提高。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。*2019-2-26质粒存在对菌体代谢的影响： 中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，其质粒对工程菌的生长影响不大。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝），生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。*2019-2-26严紧反应当细菌发现它们处于很差的生长环境，没有足够的氨基酸来维持蛋白质合成时，它们就会停止大部分活动，这种现象称为严紧反应。严紧反应产生两种非正常的核酸堆积物，即ppGpp和pppGpp，统称(P)PPGPP。*2019-2-26严紧反应机制　　　产生鸟苷四磷酸鸟苷五磷酸激活核糖体RelA蛋白（严紧因子）抑制rRNA基因表达核糖体与mRNA结合抑制其翻译氨基酸饥饿　GTPATP*2019-2-26(p)ppGpp的产生机制 应急因子RelA是一种(p)ppGpp合成酶，约与5%的核糖体结合在一起。 当核糖体A位被空载tRNA占据时，RelA被激活。 一个空载tRNA进入A位就生成一个(p)ppGpp*2019-2-26(p)ppGpp的作用应急应答使得rRNA和tRNA的合成量大幅减少（10-20%），一些mRNA的合成也减少（1/3）。蛋白质的降解速率增加，许多代谢调节作用开始发生。*2019-2-26基因工程菌的不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：一、质粒的不稳定性　分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。第六节基因工程菌的不稳定性*2019-2-26影响质粒分裂不稳定的因素： ⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； ⑵这两种菌比生长速度率差异的大小。 *2019-2-26质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳定性stability)*2019-2-26二、提高质粒稳定性的方法1.选择合适的宿主菌 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解2.选择合适的载体低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但如果提高质粒拷贝数，可能抑制菌体生长，对稳定性不利。*2019-2-263.施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高*2019-2-264.分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制。在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表达。*2019-2-265.控制培养条件工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大可调控的环境参数为：培养基组分、培养温度、pH和溶解氧浓度。有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定*2019-2-266.固定化固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。*2019-2-26中试是上游技术与工业化生产的连接环节，其目的在于考察一个上游构建成功的重组菌种是否适合未来的产业化。另外，通过中试还可以获得大量的产品供临床试验，同时中试所得的相关培养、发酵、纯化等工艺参数可以做为生产设计时的参考。第七节基因工程菌的中试*2019-2-26中试应考虑的问题：工程菌是否适宜商品化发酵反应器设计反应过程选择发酵培养条件生产工艺最佳方法优化工艺监测方法工艺控制方法工艺自动化使用方法生物催化剂使用方法（如果有的话）产品提取方法分离精制技术等。*2019-2-26一、工程菌选择：用于中试的工程菌需具备的条件：1、能用一般基因重组技术获得2、有高产潜力3、能以工业原料为培养基，主要是碳源4、生产工艺不复杂，能一般化5、能产生和分泌蛋白质（细胞外分泌）6、不致病、无毒性7、能安全生产、符合国家卫生部门规定8、代谢可控性，产品有特异性9、发酵液粘度小等*2019-2-26二、反应器（发酵罐）设计符合生物反应和化学工程需要。设计基础：5种生物数据－培养细胞系特性、细胞生长率、发酵罐消毒方法、温度pH溶氧二氧化碳及代谢产物、后处理效果。设计中应考虑的问题：根据实验条件需要，能连续发酵（也可分批发酵），并附有加料管取料管及测量仪表，易安装及移动，仪表所得数据可靠，数据重复性好，可任意安装附件，罐体材质好并打光，避免残渣积存。*2019-2-26三、发酵培养基组成：1、化学元素：细胞生长必需的碳、氮、氧、氢、磷及一些微量元素和金属离子。2、特殊营养源：氨基酸、维生素等。3、能源：葡萄糖等。4、代谢控制物：生物活性物质，或者改变温度、pH值、诱导菌种改变生长速度或代谢途径等，目的为增加产量。注意：工业化生产用培养基以工业原料为主，以降低生产成本，所以中试时就要进行培养基及培养条件探索。*2019-2-26四、工艺最佳化与参数监测控制1、工艺最佳化：指最快周期、最高产量、最好质量、最低能耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳化速度、最低失败率等。只有在掌握菌种生物特性和发酵工艺参数了如指掌，才能设计出最佳生产工艺。2、参数监测控制：四种需要监测的参数主要参数－pH、温度、溶氧、二氧化碳生物量－浑浊度、细胞组分、总氮量及菌丝干重。碳源－糖、有机酸、乙醇、淀粉、脂质产品－形成时间、形式、性状等全自动化控制*2019-2-26五、计算机的应用：全自动化控制的基础 热电耦电极－－温度 离子敏感电极－离子 pH电极－－－－pH 氧化还原电极－还原电位 热量计－－－－热平衡 可以储存于计算机－通过计算机计算、对比、优化选择－提高产品产量与质量、降低原材料与能源消耗、降低成本－最终模拟出一个高产、高质、低成本生产工艺最佳化的控制微生物数学公式并实际运用。*2019-2-26培养工艺是发酵工艺的重要组成部分，对外源蛋白的表达至关重要，直接影响产品的产量和质量，从而影响产品成本及市场竞争力。最佳的培养工艺还要考虑对纯化工艺的影响。第八节基因工程菌的培养*2019-2-26一、基因工程菌的培养方式：1、分批培养：培养基的量一次性加入，产品一次性收获,分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限。2、补料分批培养：在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，可得到更多的代谢产物。3、连续培养：不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。4、透析培养：5、固定化培养：*2019-2-26补料分批培养补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。基因工程菌培养方式*2019-2-26连续培养连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。基因工程菌培养方式*2019-2-26透析培养透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。基因工程菌培养方式发酵液透析过的发酵液透析膜乙酸养分代谢产物*2019-2-26固定化培养基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。基因工程菌的培养方式*2019-2-26二、选择培养方式必须考虑的因素：1、培养基2、溶解氧3、温度4、pH5、蛋白表达相关因素－表达时机、表达程序等*2019-2-26三、基因工程菌的培养设备基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细胞和高效的表达基因产物。*2019-2-26发酵罐的组成部分有：发酵罐体保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置残留气体处理装置参数测量与控制系统（如pH、O2、CO2等）培养液配制及连续操作装置等。基因工程菌的培养设备*2019-2-26基因工程菌在发酵培养过程中要求环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。对发酵罐有特殊要求如要提供菌体生长的最适条件培养过程不得污染保证纯菌培养培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动基因工程菌的培养设备*2019-2-261.发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成2.罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角3.所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔”，不得有泄漏4.发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。5.搅拌器转速和通气应适当6.与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀7.空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料8.培养液要经化学处理或热处理后才可排放9.轴封可采用磁力搅拌或双端面密封基因工程菌的培养设备*2019-2-26第十节基因工程药物的分离纯化基因工程药物大部分为多肽或蛋白质，其分离、纯化非常重要。特点：①目的产物在初始物料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表达产物稳定性差，易失活变性；④表达产物的种类繁多、结构不一；⑤成品要求纯度高、无菌、无热原。*2019-2-26一、建立分离纯化工艺的依据⒈含目的产物的起始物料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：　　①菌种的类型及其代谢特性。　　②原材料和培养基的来源及其质量。　　③生产工艺及条件。④初始物料的物理、化学、生物学性质⒉物料中杂质的种类和性质⒊目的产物特性⒋产品质量的要求*2019-2-26二、分离纯化的基本过程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离可溶性蛋白包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品*2019-2-26三、分离纯化的技术分离纯化的技术要求：①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。③收率高、成本低。④两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。*2019-2-26⒈细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、生物膜分离法。⑵细胞破碎：是否加外力：机械破碎法、非机械破碎法。所用方法属性：物理法、化学法、生物法。⑶固液分离：高速离心、膜过滤、双相萃取*2019-2-26目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。五、重组蛋白的分离纯化*2019-2-26产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件　相对分子量选择不同孔径的介质　疏水性与疏水、反相介质结合的程度　生物特异性决定亲和配基　溶解性决定分离体系及蛋白浓度　稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的特性：分离纯化方法*2019-2-26 层析(chromatography)A离子交换层析B疏水层析C亲和层析D凝胶过滤层析*2019-2-262019-2-26A离子交换层析离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则外源基因表达产物的分离纯化方法*2019-2-262019-2-26离子交换层析的基本原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。　*2019-2-262019-2-26离子交换剂，通常是一种不溶性高分子化合物如纤维素，葡聚糖，琼脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。离子交换剂－－－－*2019-2-26阳离子交换剂：强酸型和弱酸型可电离的基团磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团 伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3）离子交换剂的分类*2019-2-26常用的离子交换剂 离子交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）*2019-2-26常用的离子交换剂 离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（SephadexG）。常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂 CM-SephadexC-25CM-SephadexC-50阴离子交换剂 DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50*2019-2-26常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6BDEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点。*2019-2-26离子交换介质的选择原则一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离碱性物质用阳离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择*2019-2-26离子交换介质的选择原则12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）对pI=5的某酸性蛋白质当pH5.5-9.0的范围内时，蛋白质为阴离子，应首选DEAE纤维素；当pH3.5-4.5的范围内时，蛋白质为阳离子，应首选CM纤维素*2019-2-262019-2-26B疏水层析 疏水层析（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。 疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。*2019-2-26疏水配基烷基链配基芳基配基高分子配基*2019-2-26疏水基质应用最广泛良好的生物相容性和化学稳定性*2019-2-26基本操作 平衡Equilibration 上样Sampleapplication 洗杂Washing洗脱Elution*2019-2-26C亲和层析亲和层析的原理亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择*2019-2-26亲和层析的原理亲和层析：利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。*2019-2-26亲和层析的特点：1.纯化过程简单、迅速，且分离效率高；2.特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子;3.纯化倍数大，产物纯度高;4.必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制。*2019-2-26常用的亲和层析载体纤维素葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体*2019-2-26亲和层析配基的选择：纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。*2019-2-26D凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则*2019-2-26凝胶层析的基本原理凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。*2019-2-26常用的凝胶葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G表示葡聚糖，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克。G值越小，交联度越大，吸水性越小。SephadexLH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。*2019-2-26常用的凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose和Bio-Gel-A等。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。*2019-2-26常用的凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）*2019-2-26E膜分离膜分离的基本原理分离膜的主要性能影响膜分离的因素*2019-2-26膜分离的基本原理膜分离的基本定义膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。*2019-2-2