人脐带间充质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

· 118 · 中华实验外科杂志 2006年 1月第 23卷第 1期 Chin J Exp su理，January 2006，vol 23．No．1 人脐带间充质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究 袁源 杨树源 韩忠朝 张晓辉 问充质干细胞(MSC)在特定条件下 能转化为神经元样细胞，并参与神经损 伤修 复，使 其 受 到 了越 来 越 多 的关 注【 · 。研究表 明，MSC不仅存在于骨 髓．还存在于脐血，胎儿内脏等【 。脐带 作为胎儿与母体间的营养桥梁，其中是 否也含有并能否提取到足量的 MSC引 起本研究室的关注。本研究首次探讨从 脐带获取 MSC的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 及其基本生物学 特性。 一 、材料和方法 1．材料：脐带取 自天津市中心妇产 医院足月剖宫产新生儿，均经父母授权 同意。 2．细胞分离扩增：将脐带从手术台 上取下，剪碎至 1 mm 大小组织块。组 织块接种于DMEM／F12培养基中，放置 于饱和湿度孵箱内培养，1周后，去掉组 织块更换培养基。细胞长到 80％融 合 时，0．25％胰蛋白酶消化，传代培养。 3．细胞表面分子标志检测：取第 3、 5、l0代的脐带 MSC(UCMSC)，胰蛋 白 酶消化后制成单细胞悬液。分别加入抗 人 CD13一PE、CD14一 FITC、CD31一PE、 CD34一PE、CIM5一PE、CDl1 a-PE、CD29一 PE、CD105一FITC、CD106一PE单抗各 5“l。 4℃孵育30 min，流式细胞仪检测。 4．细胞周期测定：分别取第 3代及 第 8代 UCMSC．消化后离心．磷酸盐缓 冲液(PBS)漂洗，50 rag／L碘化丙锭标记 细胞，100 mg／L RNA酶处理。流式细胞 术检测细胞周期。 5．RT-PCR检测：取 3×10 第 3代 细胞，以 Trizol提取总 RNA。逆转录 为 cDNA。测 OCT一4基因表达。引物 序列 为 ：Primerl5’．GACAACAATAGAGAAC- 基金项 目：天津市科委重点公关项 目 (013111211) 作者单位：300040天津医科大学总医院 神经外科(袁源、杨树源、张晓辉)，中国医科 院血液病研究所(韩忠朝) CTTCAGGAGA-3’Primer2：5’一TTCTG— GCGCCGGTTACAGAACCA一3’。 6．超微结构观察：取 第 3代 UCM— SE，胰酶 消化，PBS清洗，离心，2％戊二 醛固定，透射电镜观察。 二、结果 1．脐带 MSC的分离、纯化及扩增： 组织块贴壁后 1周可见散在分布、贴壁 生长的细胞集落。细胞多为双突起的长 梭形或扁平形的成纤维样细胞，折光度 好，核仁明显。两周后，细胞形态变为均 一 的纺锤形。3周左右细胞达到 80％融 合。消化、传代后可得到纯化的成纤维 样细胞。 2．免 疫表 型 测 定：第 3、5、10代 UCMSC各代 间免疫表 型无 明显差异。 均强烈表达 CD13、CD29、CD105、CD44。 弱表达 CD106．不 表达 CD14、CD34、 CD1la、CD31、CD45。表明脐带 MSC表 达间充质细胞特异性抗原标志而不表达 造血干细胞、内皮细胞特异性抗原。这 与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的 MSC流式检测结果一致。 3．细胞周期检测：第 3代和第 8代 脐带 MSC细胞周期无明显差别。均为 有80％～90％细胞处于 Go—G，期，表明 细胞增殖活跃。 4．RT．PCR检测结果：RT—PCR检测 示 UCMSC OCT一4 mRNA表 达 阳性， OCT一4是胚胎干细胞特异性基因，对维 持干细胞未分化状态具有重要作用【4】。 5．超微结构观察：透射 电镜观察显 示脐带 MSC核大，不规则，核仁明显，常 染色质多。异染色质少。胞浆少，细胞器 以粗面内质网和线粒体为主。胞浆内有 较多游离核糖体。 三、讨论 MSC可向多胚层组织细胞分化。甚 至能分化为神经细胞，且其扩增迅速。免 疫源性低，易于转染外源基因。是细胞替 代治疗的理想来源。但骨髓 MSC取材 困难，供体有限，受年龄限制，胎儿来源 · 简 报 · MSC则受伦理学限制【5l。因此尽管 MSC 基础研究取得了长足进展，却始终未能 应用于临床【引。 本研究在脐带中提取到的细胞增殖 能力强，表达干细胞特异性抗原 OCT-4， 具有干细胞特性。且形态及生理学特征 与骨髓 MSC相似，流式检测结果更表明 其抗原标志与骨髓 MSC相同。因此，脐 带分离到的贴壁细胞也属于 MSC，表 明 除骨髓、胎儿脏器外，MSC还存在于新生 儿脐带组织。众所周知，脐带作为分娩 废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何 伦理及法理的限制，因此 UCMSC的发 现突破了上述 MSC来源的所有限制。 有报道，在脐带的连接组织 Wharton jelly中分离出的细胞在特定条件下能分 化为软骨细胞或神经样细胞。并表达神 经烯醇化 酶 NSE等神经 元特 异性 抗 原【7 J，本室的后续实验中亦证实 UCMSC 能诱导分化为神经元样细胞。表明脐带 来源的干细胞具有神经分化潜能。 参 考 文 献 1 张军，邵明．龚冬梅，等．骨髓基质细胞转化 为神经细胞的研究．中华实验外科杂志。 2003．20：259—260． 2 邓志锋，汪泱。宋 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 欣，等．骨髓基质细胞移 植对大鼠局灶性脑缺血区血运重建的作 用．中华实验外科杂志，2003。20：1153． 3 Anker PS，Noort WA，Scherjon SA。et a1． Mesenchyrnal stem cells in human seeond- trimester bone marrow，liver，lung． and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentia tion potential。2003，88：845—852． 4 Hochedlinger K，Yamada Y，Beard C，et a1． Ectopic expression of Oct．．4 blocks progeni．． tor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues．Cell，2005。121：465—477． 5 Rao MS，Mattson MP．Stem cells and aging： expanding the possibilities．Mech Ageing Dev．2001。122：713—734． 6 Deans RJ，Moseley AB．Mesenchymal stem ceHs：biology and potential clinical uses．Exp Hema to1．2000．28：875，884． 7 Mitchell KE，Weiss M L．Mitchell BM ，et a1． Matrix cells from Wharton’S jally forrn neu． rons and glia．Stem Cells．2003。21：50．60． (收稿日期：2005．07，25) 维普资讯 http://www.cqvip.com