高效液相色谱法测定蒙药复方述达格4有效部位中山奈素和高良姜素的含量

高效液相色谱法测定蒙药复方述达格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量 张海玉1李常胜*2塔 娜1 1.内蒙古自治区国际蒙医医院药学部，内蒙古呼和浩特 010065；2.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010110 [摘要] 目的 探析蒙药复方述达格-4有效部位高良姜素2与中山奈素应用高效液相色谱法检测的方法。方法 应用高效液相反相色谱法，流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液，检测波长286 nm，梯度洗脱（0 min～20 min，34%A→37%A；20 min～60 min，37%A），流速1.0 mL/min，色谱柱为Diamosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30°C，进样量20 μL。结果 山柰素的线性范围为0.01656 μg～0.1656 μg（γ=0.9999），高良姜素线性范围为0.04 μg～0.40 μg（γ=0.9999）。重复性试验中，山柰素、高良姜素的平均含量分别为0.43%、1.21%；RSD分别为1.43%、0.94%；加样回收率试验评估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分别为98.92%、99.92%，RSD为2.33%、2.09%。结论 高效液相色谱检测法的重复性较佳，简便准确，可为蒙药复方述达格-4质量控制提供依据。 关键词 山柰素；高良姜素；有效部位；蒙药复方述达格-4 [中图分类号] R29 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）07（b）－０130-03 [作者简介] 张海玉（1968-），女，内蒙古呼和浩特人，大专，副主任蒙药师，研究方向：蒙药相关。 [通讯作者] 李常胜，讲师，E-mail:immc_kjc@163.com。 述达格-4为蒙药传统配方，蒙医中用于止痛平喘，药物成分为100 g石菖蒲、100 g木香、200 g紫硵砂，可止痛消喘，具有镇“巴达干赫依”的作用[1]。用于胃肠消化功能低下、胸肋刺痛、气短胸闷、膈肌痉挛等临床病症[2]。述达格-4中主药高良姜具有抗血栓、抗凝血、镇痛、抗腹泻、止呕、抗溃疡等功能，黄酮为其主要药理成分[3]。本研究富集复方药物中黄酮类成分，对其有效部位的含量应用HPLC法进行检测，取得满意效果，现报道如下。 1 试药与仪器 Mettler Toledo公司生产的AB135-S电子天平，AB135-S型超声清洗仪，日本日立公司生产的LC-2000全自动进样高效液相色谱仪，Agilent Chemstation，L-2455紫外检测器。安国市康达中药材有限公司提供蒙药复方述达格-4中各药材，娃哈哈纯净水，乙腈为Fisher 色谱纯试剂，其他试剂为分析纯；山柰素（批号：110861-200808；中国药品生物制品检定所）高良姜素对照品（批号：111699-200501；中国药品生物制品检定所）。 2 方法与结果 2.1 混合对照品储备液制备 于5 mL容量瓶内精密称量2.50 mg干燥减压后恒重的高良姜素对照品，于10 mL容量瓶内称量2.07 mg山柰素对照品，甲醇定容混匀后，于25 mL容量瓶内分别吸取1 mL两种对照品溶液，混合对照品浓度为0.00828 mg/ mL。 2.2 供试品溶液制备 精密称量5 g述达格-4药材，放入250 mL圆底烧瓶内，将50%的乙醇100 mL精密加入，进行2次回流提取，2 h/次，用脱脂棉趁热粗滤，将两次提取液合并，溶剂无醇味后回收，对入蒸馏水稀释至15 mL；经大孔树脂柱纯化，收集乙醇洗脱液，溶剂回收，25 mL容量瓶内定容70%乙醇，摇匀，即为有效部位样品溶液，25 mL容量瓶内吸取1 mL此溶液，定容70%乙醇，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜滤过。 2.3 色谱条件及系统适用性试验 流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液，检测波长286 nm，梯度洗脱0 min～20 min，34%A→37%A；20 min～60 min，37%A），流速1.0 mL/min，色谱柱为Diamosil C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱温30°C，进样量20 μL。在以上色谱条件下，山柰素、高良姜素与相邻色谱峰的分离度均≥1.5，对称因子在0.95~1.05之间，理论板数均≥7 000。色谱图见下图1。 1 山奈素 2 高良姜素 2.4 线性关系考察 分别取混合对照品溶液分别进样2.0 μL、4.0 μL、6.0 μL、8.0 μL、10.0 μL、20.0 μL在以上色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液质量X（μg）为横坐标绘制标准曲线，达到山柰素、高良姜素的回归方程分别为：Y=6469053.8311X-1420.7869 γ=0.9999（山柰素线性方程）；Y=9011119.0984X-26100.0164 γ=0.9999（高良姜素线性方程）；山柰素的线性范围为0.01656～0.1656 μg，高良姜素线性范围为0.04～0.40 μg。 2.5 精密度试验 在以上色谱条件下，选择同一供试品溶液连续6次进样，测得山柰素、高良姜素的峰面积的RSD（n=6）分别为0.90%、2.52%。 2.6 重复性试验 同一供试品溶液制备6份，按以上色谱条件检测。 2.7 统计方法 采用SPSS17.0软件系统分析所有数据，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，计数资料采用χ2检验。山柰素、高良姜素的平均含量分别为0.43%、1.21%；RSD分别为1.43%、0.94%，见表1。 2.8 稳定性试验 在以上色谱条件下，同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h重复进样，检测山柰素、高良姜素的峰面积的RSD（n=8）分别为0.79%、2.40%，说明24 h内供试品溶液的稳定性较佳。 2.9 加样回收率试验 精密称量2.5 g述达格-4药材6份，进行有效部位样品溶液制备，在25 mL容量瓶内分别吸取1 mL样品溶液，加入0.0245 mg山柰素、0.0588 mg高良姜素标准品，25 mL容量瓶内定容70%乙醇，混匀后用0.45 μm微孔滤膜滤过，按以上色谱条件检测，计算RSD及回收率。山柰素、高良姜素的回收率平均值分为98.92%、99.92%，RSD为2.33%、2.09%，见表2。 3 样品含量测定 取样品3批，3份/批，按以上方法制备供试品溶液，液相色谱仪内注入20 μL供试品溶液，记录峰面积，药物中山柰素、高良姜素含量测定依据外标一点法。见表3。 3讨论 3.1 选择测定波长 选择测定波长时，高良姜素、山柰素分别在282 nm、286 nm、290 nm处可最大吸收[4]，但经研究二者在286 nm处吸收效果最佳[5]，所以测定波长选定为286 nm。 3.2 选择流动相 在对流动相的系统选择中，高良姜素在乙腈—磷酸水系统中的分离效果较佳[6]。 3.3 选择对照品 分析对照样品时，发现黄酮为复方述达格—4有效部位的主要药理成分，山柰素、高良姜素的药理活性较强[7]。山柰素可发挥抗变态反应、抗炎功能，影响人胃癌细胞原位移植裸鼠中的和一表达[8]；而高良姜素可显著防护小鼠酒精型胃溃疡及大鼠结扎性胃溃疡，同时抗炎、抗病毒、抗畸形[9]。 该研究蒙药复方述达格-4有效部位高良姜素2与中山奈素应用高效液相色谱法检测，结果显示：重复性试验中，山柰素、高良姜素的平均含量分为为0.43%、1.21%；RSD分别为1.43%、0.94%；加样回收率试验评估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分为为98.92%、99.92%，RSD为2.33%、2.09%，说明高效液相色谱检测法的重复性较佳，简便准确，可为蒙药复方述达格—4质量控制提供依据。 参考文献 [1] 董玉，贾鑫，马强.蒙药复方述达格-4不同配伍对总黄酮和高良姜素含量的影响[J].内蒙古大学学报:自然科学版，2012，43(5):173-174. [2] 贾鑫，武娜，董玉.高效液相色谱法测定蒙药复方述达格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量[J].内蒙古医学院学报，2011，33(3):702-703. [3] 梁选革，张若燕，刘莉丽.红花注射液中槲皮素和山柰素含量的高效液相色谱测定[J].时珍国医国药，2012，23(10):153-156. [4] 杜小伟，王京辉，肖斯婷，等.高效液相色谱法测定不同来源罗布麻叶中槲皮素和山柰素的含量[J].四川医学，2010，31(5):234-236. [5] Brovia V，Ricciardi A，Barbeito L.N-Acetyl-aspartylglutamate (NAAG) in human cerebrospinal fluid: Determination by?high performance liquid chromatography， and influence of biological variables[J]. Amino Acidsm，2013，9(2):175-184. [6] 孟宪波.HPLC测定凤眼草中槲皮素与山柰素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(8):122-123. [7] 吴琼，林一帆，王常丽，等.HPLC测定冬胃颗粒中高良姜素的含量[J].中国药师，2012，15(9):217-218. [8] 李建梅，霍仕霞，高莉，等.不同纯度高良姜素的药代动力学比较研究[J].中国药理学通报，2012，28(9):164-165. [9] 李慧，许亮，徐保利，等.HPLC测定地锦草中没食子酸、槲皮素及山柰素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(7):233-234. （收稿日期：2014-04-17） 1