第9章酶促反应动力学一、化学动力学基础二、底物浓度对酶反应速率的影响三、酶的抑制作用四、温度对酶反应的影响五、pH对酶反应的影响六、激活剂对酶反应的影响(kineticsofenzyme-catalyzedreaction)教学
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研究酶促反应动力学的意义酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提供实验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规律。教学ppt二、底物浓度对酶反应速率的影响教学ppt酶反应速率对底物浓度作图教学ppt中间复合物学说为了解释这个现象，Henri和Wurtz提出了酶－底物复合物学说。该学说认为，当酶催化反应时，酶首先与底物结合，生成酶－底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下式
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示：S+EES→P+E教学ppt酶底物中间复合物存在的证据电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复合物。酶与底物结合后光谱发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同(半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧)。教学ppt（1）平衡学说（Henri，Michaelis和Menten方程）1902年Henri和Brown提出了酶催化的反应机理1913年Michaelis和Menten完善了这个理论，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。教学ppt平衡学说推导反应速度方程的假设前提在推导动力学方程时，有几点假设：①第一步迅速平衡，第二步慢，即k3<
>[E]，[S]>>[ES]。③酶以E和ES两种状态存在。教学ppt根据平衡学说推导速度方程设Vf为E与S结合的速度，Vr为ES解离的速度，则Vf＝k1([E]0－[ES])([S]－[ES])Vr＝k2[ES]∵平衡时Vf＝Vr∴k1([E]0－[ES])([S]－[ES])＝k2[ES]又∵[S]>>[ES]∴[S]－[ES]≈[S]教学ppt根据平衡学说推导速度方程k1([E]0－[ES])[S]＝k2[ES]解出[ES]得令，则教学ppt根据平衡学说推导速度方程由于V=k3[ES]，代入前式得因为当所有的E都成为ES时，可达最大反应速度，即Vm=k3[E]0，所以这就是米氏方程。教学ppt米氏方程米氏方程是一个双曲线方程，若以[S]为自变量，V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。教学ppt（2）稳态理论1925年，Briggs和Haldane提出了稳态（steadystate）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正：在反应式中，k3值不小，后一步骤不是限速步骤。所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的酶－底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然后保持不变，即处于稳态水平，此时ES的解离和分解速率之和等于ES的形成速率，教学ppt根据稳态学说推导速度方程产生[ES]的速率消耗[ES]的速率稳态时所以教学ppt根据稳态学说推导速度方程移项得令，代入上式得将上式中的[ES]解出得此[ES]即为稳态时的复合物浓度。教学ppt根据稳态学说推导速度方程因为酶反应速率与[ES]成正比，即所以又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即，代入上式得（稳态法）（快速平衡法）教学ppt两个米氏方程的区别这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是Ks，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是Km。Ks是[ES]的解离平衡常数教学ppt米氏方程的几个特点从米氏方程中可以看出：当[S]<>Km时，，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；当[S]=Km时，，所以，Km的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。教学ppt米氏方程曲线教学ppt米氏常数的意义①Km是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反应条件下，对于一定的底物，Km是定值。②Km可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中Km最小的底物是天然底物。③当k3<>Km时，V=Vm=k3[E]0，此时对底物来说是零级反应，对酶来说是一级反应，k3是一级反应速率常数，k3表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（又称为转换数），这时的k3又可以写成kcat，kcat越大，说明酶的催化效率越高。教学pptkcat/Km的意义Kcat/Km表示酶的催化效率，Kcat/Km越大，催化效率越高。，其最大值极限是k1，而k1是酶与底物结合的速率常数，此常数受到底物在溶液中扩散速度的影响。教学ppt作图法求Km和Vm值（Lineweaver-Burk双倒数作图法）将米氏方程两边取倒数得在一系列[S]下测出相应的反应速率v，以对作图，可得出Km和Vm值。教学ppt米氏方程的双倒数图教学ppt多底物的酶促反应动力学（酶促反应按底物分子数的分类）底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单向单底物假单底物异构酶裂合酶水解酶ABAB+CA-B+H2OAOH+BH5%12%26%双底物氧化还原酶转移酶AH2＋BA+BH2A2++B3+A3++B2+A+BXAX+B27%24%三底物连接酶A+B+ATPAB+ADP+PiA+B+ATPAB+AMP+PPi6%教学ppt多底物反应按动力学机制分类（序列反应）底物的结合和产物的释放有一定的顺序：E+A+B→EAB→EPQ→E+P+Q产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反应又可以分为两种类型。教学ppt有序反应（orderedreaction）其中P是B转变的产物，Q是A转变的产物。如脱氢酶的辅酶NAD(P)+相当于A，NAD(P)H相当于Q。教学ppt随机反应（randomreaction）如肌酸激酶催化肌酸与ATP反应生成磷酸肌酸和ADP。教学ppt乒乓反应（pingpongreaction）如转氨酶催化转氨反应：氨基酸1＋酮酸2——→酮酸1＋氨基酸2ABPQ教学ppt三、酶的抑制作用因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。教学ppt抑制程度的表示
方法
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（1）相对活力分数（残余活力分数）（2）相对活力百分数（残余活力百分数）（3）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）（4）抑制百分数教学ppt抑制作用的类型1．不可逆抑制作用（irreversibleinhibition）抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2．可逆抑制作用（reversibleinhibition）抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。教学ppt可逆抑制作用的3种类型（1）竞争性抑制（competitiveinhibition）I和S竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。教学ppt竞争性抑制剂举例教学ppt可逆抑制作用的3种类型（2）非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）I与S可以分别与酶结合，谁先结合都可以，形成ESI三元复合物，但ESI中的S不能转变成产物。这类抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位结合。教学ppt竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理教学ppt可逆抑制作用的3种类型（3）反竞争性抑制剂（uncompetitiveinhibition）I只与ES结合，只有ES能分解出产物，ESI中的S不能转变成产物。由于I的存在促进了E和S的结合，所以称为反竞争性抑制。ES+I→ESI——→P+E+I×教学ppt可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别①在反应系统中加入一定量的抑制剂，以及不同量的酶，测定反应速率与酶量的关系。斜率较小的直线是可逆抑制剂，不通过原点但斜率与对照相同的是不可逆抑制剂。1.control2.irreversibleinhibitor3.reversibleinhibitor教学ppt可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别②在反应系统中加入不同量的酶及抑制剂，作不同抑制剂浓度下反应速率对酶量的直线。可逆抑制剂得到的是一组通过原点但斜率不同的直线，不可逆抑制剂得到的是一组不通过原点但斜率与对照相同的平行线。教学ppt一些重要的不可逆抑制剂（1）非专一性不可逆抑制剂①有机磷化合物②有机汞、有机砷化合物③重金属盐④烷化试剂⑤氰化物、硫化物和CO⑥青霉素（2）专一性不可逆抑制剂①Ks型不可逆抑制剂②Kcat型不可逆抑制剂教学ppt有机磷化合物很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰胆碱积累，引起神经中毒症状。所以这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒剂夺取下来，使酶恢复活力，达到解毒的作用。教学ppt有机磷化合物教学ppt解磷定的解毒机理教学ppt有机汞化合物有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。教学ppt有机砷化合物有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。路易斯毒气教学ppt为了六十一个阶级兄弟教学ppt重金属盐Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，能够修饰酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。烷化试剂教学ppt氰化物、硫化物和CO氰化物能与细胞色素氧化酶中的Fe2+结合，使酶失活不能呼吸。CO与血红蛋白结合阻止氧运输。硫化物能与多种含金属的酶形成较为稳定的络合物，使酶失活。糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。青霉素教学ppt青霉素的抗菌机理教学pptKs型不可逆抑制剂此类抑制剂结构与底物类似，并带有高反应性基团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的Ks型抑制剂教学pptKcat型不可逆抑制剂此类抑制剂不但结构与底物类似，而且需要经酶催化反应后才产生高反应性基团，比Ks型不可逆抑制剂专一性更强。β-卤代-D-丙氨酸磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶教学ppt可逆抑制剂（底物的类似物）合成叶酸的组分磺胺药物竞争抑制二氢叶酸合成酶的活性蝶呤对氨基苯甲酸谷氨酸叶酸（磺胺药物）教学ppt可逆抑制剂（过渡态底物类似物）过渡态底物类似物抑制力更强，因为酶对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强得多。多种酶催化反应时的过渡态底物过渡态底物类似物教学ppt可逆抑制剂（过渡态底物类似物）教学ppt可逆抑制剂（过渡态底物类似物）教学ppt四、温度对酶反应的影响在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞内酶的最适反应温度在35～40℃，植物细胞中的酶可达40～50℃，也有一些生长在堆肥、温泉中的微生物酶的最适温度更高，如TaqDNA聚合酶的最适温度可高达70℃。需要注意的是，最适温度值不是酶的特征性常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。教学ppt温度对酶反应速率的影响教学ppt五、pH对酶反应的影响酶的活力受环境pH的影响，存在一个最适反应pH。酶的最适反应pH也不是一个特征性常数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变。教学ppt4种酶的pH-酶活性曲线胃蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胰蛋白酶教学pptpH影响酶活力的原因pH影响酶活力的原因有以下几方面：①过酸或过碱使酶变性失活。②pH偏离最适pH不多时，酶分子中及底物分子中各可解离基团的解离状态发生了变化，不利于底物与酶的结合及催化反应。③由于酶分子可解离基团的解离状态发生了改变，导致酶分子构象发生改变，不利于底物与酶的结合及催化反应。教学ppt最适反应pH示意图教学ppt六、激活剂对酶反应的影响有些物质与酶结合后可以提高酶活力，这些物质称为酶的激活剂（activator）或活化剂，它们大部分是无机离子或小分子化合物，少数是大分子物质如蛋白质。作为激活剂的金属离子有K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+等，它们与酶蛋白结合后，或稳定酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。教学ppt激活剂对酶反应的影响不同的激活剂激活不同的酶，有些激活剂激活一种酶，却又抑制另一种酶。激活剂的浓度也对其效应有影响，一定浓度时起激活作用，超过这个浓度又起抑制作用。在机体内有许多调节酶活力的方式，其中抑制剂和激活剂的调节属于最快速的方式。教学ppt
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