利用孕妇血浆中游离胎儿DNA行无创伤性产前诊断的研究

利用孕妇血浆中游离胎儿DNA行无创伤性产前诊断的研究 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA行无创伤性产前诊断的研 究 暨南大学硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 中文摘要 第一部分:利用改良式 PCR技术检测孕妇血浆游离胎儿 DNA 行无创性 产前无创伤性产前性别鉴定的研究 目的 利用改良式PCR技术检测孕妇血浆胎儿游离胎儿DNA,探讨无创性产前性别鉴定 的可行性。 方法 采取选择孕龄为14周~38周产前诊断或引产的孕妇25名,抽取外周静脉血2ml, 采用柱分离法提取DNA,用改良式 PCR技术检测其胎儿SRY基因。同时采集脐血或羊水, 经细胞培养后行脐血或羊水染色体核型分析检测鉴定胎儿性别。 结果25例孕妇血浆标本经改良式PCR技术检测胎儿游离胎儿DNA,依脐血或羊水染色 体核型分析鉴定染色体检测的性别为标准,17例男性胎儿孕妇血浆标本有15例出现SRY 基因扩增带;8例孕女性胎儿孕妇血浆标本均未出现SRY基因扩增带。检测男性胎儿性 别的敏感度88.24%15/17,假阴性率11.76%2/17,特异度100%;检测女性胎儿性别 的敏感度100%8/8, 假阳性率11.7%2/17,特异度88.24%;总符合率92%23/25, 最早检出孕周为14周。 结论 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA和改良式PCR技术可以快速简便地进行无创伤性 产前性别鉴定,对性连锁遗传性病疾病的产前诊断具有重要意义。 关键词 PCR;游离胎儿DNA;性别鉴定;产前诊断 I暨南大学硕士学位论文 第二部分:利用 RT-PCR 和 Cycling Probe技术检测母孕妇血浆游离胎儿DNA排除重型 β-地中海贫血(17M/-)胎儿的研究 目的通过分析孕妇外周血中的游离胎儿DNA来排除重型β-地中海贫血(17M/-)胎 儿。 方法选择行产前地中海贫血基因诊断的夫妇 6 对,孕妇孕龄为周 23 周~26 周。血 液学检查:胎儿的父亲均为 β-地中海贫血 17M/N 型,,孕妇本人为携带除 17M/N 型之 外的另一 β-地中海贫血突变类型。针对 CD17(A?T)无义突变, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 特异性引物扩 增β-珠蛋白肽链上包含该等位基因的DNA片段,通过Cycling Probe法分别 设计检测 正常基因序列和基因突变位点的两条荧光探针,分别用 FAM 和 HEX 荧光标记。结合 RT-PCR技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA,诊断胎儿是否遗传了其父亲的β-地中海 贫血17M/N碱基突变位点。,同时与脐血DNA分析的胎儿地中海贫血基因型进行对照。 结果提取的6例孕妇血浆DNA模板中有3例同时显示FAM和HEX荧光信号值阳性结 果,即这 3例孕妇的胎儿遗传了父亲β-珠蛋白肽链上CD17位点的突变碱基(A?T)。 另外3例孕妇血浆DNA模板的FAM信号值阳性,HEX信号值阴性,即所孕胎儿没有遗传 父亲的CD17位点的突变碱基。 结论利用 RT-PCR 和 Cycling Probe 技术检测孕妇外周血中的游离胎儿 DNA 能有效 地排除患重型β-地中海贫血的胎儿。 关键词Real Time PCR ;游离胎儿DNA;β-地中海贫血;产前诊断II暨南大学硕士学位论文 Abstract Part I Application of cell-free fetal DNA in maternal plasma for non-invasive prenatal diagnosis of fetal sex using by improved polymerase chain reaction techniques Abstract: Objective: To investigate the feasibility and possibility of application of cell-free fetal DNA from maternal plasma for noninvasive prenatal diagnosis of fetal sex by an improved polymerase chain reaction PCR technique Methods: Plasma cell-free fetal DNA in blood samples of 25 pregnant women at the gestational period of 14 to 38 weeks were extracted by column separation and an improved polymerase chain reaction were employed to amplify the SRY geneResults: Among the 17 women bearing male fetuses, SRY sequences were detected in 15 plasma samples after improved PCR amplification, while none of the 8 women bearing female fetuses had the positive results. The concordance rate of SRY gene amplification results of plasma cell-free DNA with real fetal sex was 92% Conclusion: Using cell-free fetal DNA from maternal plasma and polymerase chain reaction was a quick, effective and simple method for prenatal diagnosis of the fetal sex. It is of significance to prevent sex-linked inheritant diseases Key words: polymerase chain reaction; cell-free fetal DNA; gender determination; prenatal diagnosis III暨南大学硕士学位论文 Part II Using RT-PCR and Cycling Probe technology to make prenatal exclusion of β-thalassaemia major by examination of cell-free fetal DNA in maternal plasmaAbstract: Objective: To prenatal exclude β-thalassaemia major through the analysis of cell-free fetal DNA in maternal plasma Methods: We investigated six couples who presented for prenatal diagnosis of β- thalassaemia gestational age range 23?26 weeks, with the male partner carrying the CD17(A ?T) mutation, and the pregnant woman carrying another β-thalassaemia mutation. We designed allele specific primers and two fluorescent Cycling pProbes for the specific detection of the CD17(A ?T) mutation, using FAM and HEX fluorescence marking respectively, to detect the normal and mutated gene point mutation. To exclude β-thalassaemia major by detectation of cell-free fetal DNA in maternal plasma. The fetal genotype was confirmed by cord blood conventional prenatal diagnosis Results: After real-time PCR amplification, among the six pregnancies, the FAM and HEX fluorescent signals were displayed in three pregnant woman plasma samples, while other three samples only displayed the FAM fluorescent signals. The results suggested that, among the six pregnancies, the paternally derived CD17(A ?T)mutation was inherited by three of the fetusesConclusion: This finding displayed using RT-PCR and Cycling Probe technology can effectively excluded the diagnosis of β-thalassaemia major by examination of cell-free fetal DNA in maternal plasma Key words: Real Time PCR; cell-free fetal DNA; β-thalassaemia; prenatal diagnosisIV暨南大学硕士学位论文目 录 中文摘 要 ……………………………………………………………………………………………… (I) 英文摘 要 ………………………………………………………………………………………………(III) 目 录………………………………………………………………………………………………… (V) 前 言 ……………………………………………………………………………………………………(1) 1.1 孕妇外周血中游离胎儿 DNA 的来源 …………………………………………………………… (1) 1.2 孕妇外周血中游离胎儿 DNA 的代谢动力学特征…………………………………………………(2) 1.3 孕妇外周血中游离胎儿 DNA 在无创性产前诊断中的应用………………………………………(3) 1.4 胎儿 DNA 甲基化位点的研 究 ……………………………………………………………………(8) 1.5 本研究的目的及意 义……………………………………………………………………………(13) 第一部分 改良式 PCR技术检测孕妇血浆游离胎儿 DNA行无创性产前性别鉴定的研究……………………(14) 2.1 资料与方 法………………………………………………………………………………………(14) 2.2 结果………………………………………………………………………………………………(17) 2.3 讨论………………………………………………………………………………………………(20) 第二部分 RT-PCR 和 Cycling Probe技术检测母孕妇血浆游离胎儿 DNA 排除重型 β-地中海贫血 (17M/-)胎儿的研 究…………………………………………………………………………………(23) 3.1 资料与方 法……………………………………………………………………………………… (23) 3.2 结果……………………………………………………………………………………………… (25) 3.3 讨论……………………………………………………………………………………………… (27) 研究结 论………………………………………………………………………………………………(30) 研究创新 点…………………………………………………………………………………………… (31) 参考文 献 ………………………………………………………………………………………… (32) 附 录 ………………………………………………………………………………………………… (37) 在学期间发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 论文清 单 …………………………………………………………………………… (42) 致 谢……………………………………………………………………………………………………(43)V暨南大学硕士学位论文 前言 产前诊断又称宫内诊断或出生前诊断,是指对胎儿进行先天性缺陷和遗传性疾病 的诊断,包括相应的筛查。产前诊断技术项目包括遗传咨询、医学影像、生化免疫、 细胞遗传和分子遗传等。通过产前诊断,我们可以在胎儿出生之前应用影像学、生物 化学、细胞遗传学及分子生物学等技术,了解胎儿在宫内的生长发育状况,筛查胎儿 有无畸形,分析胎儿染色体核型有无异常,检测胎儿细胞的生化项目和基因等,为保 留生育、胎儿宫内治疗(手术、药物、基因治疗等)或选择性流产创造条件。 传统的产前诊断方法检测胎儿基因和染色体核型分析是通过直接获取绒毛、羊水、 脐血或胎儿组织来诊断胎儿疾病。这种侵袭性产前诊断技术对孕妇和胎儿均有一定的 风险,可导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等,因而难以被孕妇广泛 接受,妨碍了介入性产前诊断的应用。因此建立无创伤性、早期、快速、准确的产前 诊断方法,降低介入性产前诊断的手术风险,是产前诊断工作中的一项重大课题。 学者们从孕妇外周血中发现胎儿细胞后,开始关注利用这类细胞行无创性产前诊 断的应用价值,但因进入孕妇外周血的胎儿细胞数量稀少,分离纯化技术复杂且价格 昂贵,限制了其临床推广应用。近年来发现孕妇血浆或血清中存在大量的游离胎儿DNA, 从孕妇血浆或血清中提取胎儿DNA的量明显多于从孕妇外周血中胎儿细胞碎片中提取 胎儿DNA的量。进一步研究集中在孕妇外周血中游离胎儿DNA的临床应用方面,尤其设 想用于遗传病的产前诊断和妊娠并发症的筛查。这种循环胎儿DNA的存在为无创伤性产 前诊断提供一种新途径。 1.1 孕妇外周血中游离胎儿DNA的来源 [1] Lo 等利用传统的PCR方法,首先发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA,不久其他 1 暨南大学硕士学位论文 研究者也证实了循环胎儿DNA的存在,并已经显示出它潜在的临床应用价值。但是循环 胎儿DNA的确切来源尚不清楚。一般认为,循环胎儿DNA的来源,可能有以下几种机制: ?来源于孕妇血液中的有核细胞 其证据是在子痫前期和21三体孕妇的血液中胎 儿有核细胞(如有核胎儿红细胞,白细胞等),和血浆胎儿DNA呈平行性升高,其机制 可能是有核胎儿细胞通过胎盘屏障渗透到母体血液中,胎儿细胞被母体免疫系统迅速 破坏,而胎儿DNA留在血液中; ?循环胎儿DNA 也可能直接来源于凋亡的胎儿组织细胞 凋亡胎儿细胞的DNA经 胎盘屏障直接释放到孕妇血浆中,因为在某些高龄孕妇和子痫前期孕妇的血浆循环DNA 水平很高,同时胎儿细胞凋亡明显增多,且有证据表明循环胎儿DNA具有凋亡DNA片段 的一些特性; ?来源于胎盘滋养层细胞 研究证实在某些孕妇血浆胎儿DNA水平和血浆中绒毛 膜促性腺激素HCG成平行性升高。故推测胎儿DNA也可能是母体和胎儿界面的滋养层 细胞破坏后直接释放的结果; ?血浆中胎儿DNA升高也可能与血浆中胎儿DNA 清除率下降有关 因为子 痫前期 患者的肝脏和肾脏会发生病理改变,而一般认为肝脏和肾脏是清除胎儿DNA的主要器 官。 多数学者推测滋养细胞凋亡在随妊娠进展孕妇血浆或血清中胎儿DNA浓度增加的 机制中起重要作用,在分娩前几周的孕妇血浆中胎儿DNA水平迅速升高,与此时伴随胎 盘老化滋养细胞凋亡增加并释放大量DNA的现象相吻合。 1.2 孕妇外周血中游离胎儿DNA的代谢动力学特征 研究者们通过对妊娠期、产后妇女血浆中胎儿细胞内DNA和游离胎儿DNA的比较发 [2] 现 :在早孕时,有59%的孕妇在孕5周~8周时血浆中即能检测到游离胎儿DNA,在孕7 2 暨南大学硕士学位论文 周~16周时升高明显,随后随孕周增加而平稳升高,在分娩时达到顶点。整个妊娠期 孕妇血浆中游离胎儿DNA的浓度从10.1拷贝/0.5ml至130.5拷贝/0.5ml不等。因此无 论游离胎儿DNA绝对浓度还是它与总DNA的比例,均在孕妇血浆中较高,游离胎儿DNA一 般可高至9.5倍于细胞内胎儿DNA。有研究推测胎儿DNA的代谢可能是一级消除动力学即 恒比消除。在对游离胎儿DNA的清除率的研究中,发现8位产妇中有7位在产后2小时未 检测到胎儿DNA,1位则已清除了90%,估计其半衰期平均为16.3min,并以平均2.24× 10 拷贝/min的速度向母体循环释放。血浆核酸酶在其清除中只起次要作用,肝、肾、 脾等器官作用可能更大。正是由于血浆游离胎儿DNA的这种快速清除性,所以其水平几 乎实时地反映胎儿DNA的生产和清除。游离胎儿DNA的另一个特征是它的波动性:游离 胎儿DNA的波动幅度为1.4倍~4.5倍平均2.2倍,孕妇总DNA波动幅度为1.3倍~130.5 倍平均21.5倍,说明游离胎儿DNA与总DNA各自独立地波动。孕妇外周血中游离胎儿 DNA的代谢动力学具有以下基本特征:浓度高、清除快、高敏感性、效率高且易于分析。 1.3 孕妇外周血中游离胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用 1.3.1 性别鉴定 性别决定的本质是由一些相关基因的表达和调控来决定的,Y染色体上的性别决定 [3] 区基因SRY被认为是睾丸决定因子的最佳候选基因。Hwa 收集56例孕6周~16周健康孕 妇的血样本,利用荧光TaqMan探针作标记对从血浆中萃取的DNA行SRY特异序列 (SRY-3317T)的实时定量PCR分析,其中23例孕男性胎儿孕妇中有20例的血样本检测 [4] 到SRY阳性信号,33例孕女性胎儿孕妇的血样本中则检测不到。Tungwiwat 取31例妊娠 7周~32周孕妇的外周血样本,从中萃取DNA后通过多元巢式PCR方法进行Y染色体上 198bp SRY基因特异序列和X染色体上261bp ATL1基因特异序列的扩增,其中15例孕男 3 暨南大学硕士学位论文 性胎儿孕妇的血样本中检测出198bp SRY特异序列,而其余孕女性胎儿的孕妇血样本中 只能检测出261bp ATL1特异序列,其所有的性别鉴定结果均与传统的胎儿组织分析和 新生儿分娩结果相一致。 先天性肾上腺肥大(CAH)是肾上腺21-羟酶缺陷性疾病,由于21-羟酶缺陷引起体 内雄性激素分泌过多导致女性胎儿男性化,女性胎儿通过产前地塞米松治疗能够阻止 [5] 其男性化,而男性胎儿则不需治疗,因此及早确定胎儿的性别十分重要。Rijnders 选 取45例孕8周~17周妊娠CAH风险患儿的孕妇,通过定量PCR技术检测孕妇血中胎儿DNA 的SRY基因,成功鉴定出44例孕妇所孕胎儿的性别,准确率为97.8%。因此曾经分娩过 CAH患儿的孕妇在再次怀孕时,地塞米松的治疗就可以只限制在女性胎儿中使用,同时 也避免了行有创性产前诊断鉴定胎儿性别。 1.3.2 RhD血型鉴定 母儿Rh血型不合引起同种异体免疫,可导致胎儿宫内死亡和出生后核黄疸、智力 障碍等新生儿溶血病(HDN),因此早期产前诊断和治疗由于血型不合引起的HDN具有重 [6] 要的临床意义。Rouillac 做了一次大规模的胎儿RhD基因产前诊断研究,从893例RhD 阴性孕妇的外周血中萃取DNA进行RhD基因第7和第10外显子的实时PCR扩增,其结果与 羊水细胞和新生儿红细胞分析相比较,除42例样本没有得出结果外,其余样本胎儿RhD [7] 血型测定的准确率为99.5%。Hromadnikova 选取45例妊娠11周~40周RhD阴性孕妇,通 过实时PCR检测孕妇血中萃取的DNA的RhD第7和第10外显子,RhCE第2和第5外显子,成 功鉴定出其中24例RhD阳性,17例RhC阳性和7例RhE阳性胎儿血型,均与新生儿脐血结果 一致。Brojer从255例RhD阴性孕妇血浆中萃取DNA进行RhD基因第7、第10外显子和第4 [8] 内含子的实时PCR扩增,除25例材料不足外,230例检测结果准确率为99.6%。邬晋芳 选 4 暨南大学硕士学位论文 取20例妊娠14周~40周孕妇(包括RhD阴性孕妇8例,RhD阳性孕妇12例),利用PCR技术 对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行RhD基因第10外显子特异性扩增,扩增片段长度为 186bp,并以等位基因RhCE基因为内对照,扩增片段长度为136bp。能同时扩增出186bp 和136bp两条带,判断胎儿血型为RhD阳性;扩增出136bp一条带的为RhD 阴性。8例RhD 阴性孕妇中,5例扩增出136bp一条特异性片段,3例同时扩增出136bp和186bp两条特异 性片段;12例RhD阳性孕妇血浆标本均同时扩增出了两条片段,所有RhD-PCR扩增结果 均得到脐血血清学检测结果的证实。提示利用孕妇外周血中游离胎儿DNA对胎儿RhD血 型进行诊断,是一种简便、快速、特异性较高的产前诊断方法。 1.3.3 胎儿非整倍体产前诊断 [9] Zhong 通过实时定量PCR测得孕非整倍体胎儿孕妇外周血中胎儿DNA平均为185.8 基因当量(GE)/ml,正常孕妇外周血中平均为81.9 GE/ml,p0.005。尤其在孕21-三 [10] 体胎儿时,孕妇血中胎儿DNA含量增高更为显著。Lee 选取11例孕21-三体男性胎儿孕 妇的储存血清标本与正常孕妇的作对照,通过实时PCR定量分析前者胎儿DNA为41.2 GE/ml,后者为24.2 GE/ml,p0.002,孕21-三体的孕妇血中胎儿DNA含量是孕整倍体 胎儿的1.7倍。表明通过定量分析孕妇血中胎儿DNA进行非整倍体胎儿的筛 查是可行的。 1.3.4 地中海贫血产前诊断 地中海贫血是一种由珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白链合成减少或缺乏所引起 的遗传性溶血性贫血病,发病率高,主要分布在地中海国家及亚洲地区,我国的广西 壮族自治区、广东省和海南省为高发区。常见的有α-地中海贫血和β-地中海贫血, α-地中海贫血重型患者绝大多数死于宫内,β-地中海贫血重型患者绝大多数死于儿 5 暨南大学硕士学位论文 童期。该病危害大,严重影响儿童健康和人口素质的提高。[11] Li 选取32例孕10周~12周妊娠β-地中海贫血风险患儿的孕妇,对从孕妇血中富 集的胎儿DNA分析4种常见的点突变:IVSI-1、IVSI-6、 IVSI-110和密码子39。通过凝 胶电泳和PCR的扩增,对β球蛋白突变体等位基因作等位基因特异性实时PCR的检测, 成功检测出7例IVSI-1突变中的6例,16例密码子39突变中的13例,4例IVSI-6突变和5 [12] 例IVSI-110突变则全部检出,灵敏度为100%,特异度为93.8%。Chiu 设计等 位基因特 异性引物和荧光探针,通过实时PCR技术检测孕妇血中胎儿DNA的β球蛋白基因突变密 码子41/42(-CTTT),成功地完成了对8例有患β-地中海贫血风险胎儿的产前诊断,所 测胎儿基因型与传统检测方法结果相符。 1.3.5 软骨发育不全产前诊断 软骨发育不全是一种软骨内骨化缺陷的先天性发育异常,是人类侏儒症最常见的 原因。它是由人体的第3号成纤维细胞生长因子受体(FGFR3)基因发生突变所引起的 短肢畸形,基因突变点多位于编码FGFR3的l138bp处,受累者表现为肢根型短肢侏儒症。 [13] 国外有研究报道 通过琼脂糖凝胶电泳和TD-PCR方法检测孕妇血中胎儿DNA的FGFR3基 因突变来诊断胎儿软骨发育不全。应用PCR及限制性片断长度多态性分析,成功实施了 对孕妇血浆中胎儿来源突变基因的检测,从而使对该病进行单基因非侵入性产前诊断 成为可能。 1.3.6 子痫前期预测 妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病,分为妊娠期高血压、轻度子痫前期、重 度子痫前期、慢性高血压并发子痫前期、妊娠合并慢性高血压。其中子痫前期是妊娠 6 暨南大学硕士学位论文 过程中发生卒中的风险因素,合胞体滋养层的小片段脱落进入孕妇血循环刺激炎症应 [14] 答被认为是其潜在的原因。Levine 测得子痫前期孕妇在出现临床症状或体征之前其 外周血中游离胎儿DNA含量就高于同孕龄正常孕妇对照组,孕17周~28周孕妇血中胎儿 DNA含量病例组为36 GE/ml,对照组为16 GE/ml,p0.001;孕29周~41周胎儿DNA含量 病例组为176 GE/ml,对照组为75 GE/ml,p0.001。并且在子痫前期发作后其孕妇血 [15] 中胎儿DNA含量较发作前显著增高。Cotter 选取88例先前无症状而后来发生子痫前期 的孕妇,并与176例同孕龄正常孕妇作对照,利用实时PCR定量检测孕妇血中游离胎儿 DNA,发现胎儿DNA含量增高的孕妇较正常者发生子痫前期的风险高8倍,孕 妇血中胎儿 [16] DNA含量与子痫前期发生的风险率成等级相关。陶红 选取30例子痫前期孕妇和30例正 常孕妇,两组孕妇分别于孕20周、孕晚期、分娩后1 、3 、6 小时取外周血,采用荧光 定量PCR检测外周血中SRY基因分析胎儿DNA水平(B超确定两组孕妇所妊娠的胎儿均为 男性)。结果显示:?病例组孕20周时的胎儿DNA水平为316?61 copy/ml,对照组孕 妇为165?43 copy/ml,p0.01 ;?病例组孕晚期胎儿DNA水平为970?413copy/ml, 对照组孕妇为319?99copy/ml,p0.01;?子痫前期组产后1、3、6 小时胎儿DNA水 平分别为139?45、76?31、44?13 copy/ml,对照组分别为33?13、9?5、 0 copy/ml,p0.01。提示孕妇外周血胎儿DNA水平变化是一项预测和诊断子痫前期发 病与疾病程度的新指标,具有较高的临床应用价值。 1.3.7 早产预测 早产占分娩总数的5%~15%,常由于围产期窒息、颅内出血、畸形导致新生儿期死 [17] 亡,因此防止早产是降低围产儿死亡率和提高新生儿素质的主要 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 之一。Leung 等 选取20例孕26周~34周发生自发性早产的孕妇与20例同孕龄的正常孕妇作对照,通过 7 暨南大学硕士学位论文 实时定量PCR检测孕妇血中胎儿DNA含量,测得早产组的胎儿DNA含量平均为124.8 copy/ml,对照组为65.8 copy/ml,早产组较对照组明显升高,p0.042,提示孕妇血 中胎儿DNA水平可以用来预测早产的发生。他们还观察到12例在孕24周~33周发生先兆 流产但经抗分娩药物治疗有效且保胎至足月分娩的孕妇,其外周血中胎儿DNA含量平均 为46.3 copy/ml,8例使用抗分娩药物治疗无效发生早产的孕妇的外周血中胎儿DNA含 量平均为119.3 copy/ml,有效组显著低于无效组,p0.017。因此检测孕妇血中胎儿 DNA水平可以用来评估抗分娩药物的疗效,帮助临床医生区分真性和假性早产。 孕妇外周血中存在相对较为丰富的游离胎儿DNA,经PCR扩增后,足以用于性连锁 遗传性疾病、Rh血型、地中海贫血等基因病的诊断和染色体异常的筛查,为 无创性产 前诊断提供了一种更为便捷和准确的方法,有着及其广泛而且深远的应用价值。 1.4 胎儿DNA甲基化位点的研究 1.4.1 胎儿DNA甲基化CpG岛 表观遗传学的重要研究内容之一就是DNA甲基化。在哺乳动物中,DNA甲基化主要 [18] 发生在CpG双核苷酸序列的胞嘧啶上 。与其他双核苷酸序列相比,这种序列在基因组 中出现的频率很低(小于1%,而平均为6%);但是在基因组的某些区域,CpG序列的密 度很高,达均值的5倍以上,这些CpG聚集区域被形象的称为CpG岛。 随着孕妇外周血液中胎儿核酸的发现和研究的深入,DNA甲基化作为一种潜在的通 [19] 用检测标志物越来越受到研究者们的重视。文献报道 对妊娠妇女的外周血浆DNA和对 照样品DNA进行了甲基化检测分析,通过对 21 号染色体上AIRE基因的甲基化状态的分 析检测发现:在孕妇的外周血浆中特别是在孕晚期妇女的样品中AIRE基因存在着明显 的甲基化,而在对照样品中没有明显甲基化现象发生。甲基化特异的PCR分析获得了类 8 暨南大学硕士学位论文 似的结论。该实验表明,胎儿出生后,DNA出现了脱甲基化变化,DNA甲基化现象可以 用无创性产前诊断的研究;甲基化的AIRE基因可以作为一种潜在的通用标志物应用于 无创性产前诊断。 1.4.2 亚硫酸盐修饰反应的机制及问题 采用亚硫酸氢盐对 DNA 进行化学修饰的方法,为 DNA 甲基化研究提供了一种全新 的思路,其原理是单链DNA中未发生甲基化的胞嘧啶残基可被亚硫酸氢盐脱氨基而转变 成尿嘧啶残基,而甲基化的胞嘧啶残基将不发生改变。利用PCR 对所需要的基因序列进 行扩增,将尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,然后对 PCR 产物进行测序分析并与未经修饰的 基因序列进行比较,这样甲基化和未甲基化DNA序列的差异性即可在经亚硫酸氢盐修饰 后利用不同的引物区分开来,从而判断特定基因位点是否发生了甲基化。 m C 与亚硫酸氢钠的反应可以迅速鉴别出任何序列的 5C, 是众多序列特异性 甲基 化检测方法的基础。单链DNA中的C 通过磺酸基作用脱氨基,形成U。(见图1)图 1:重亚硫酸盐处理过程示意图 (DNA 经重亚硫酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶不变,未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶) 该修饰反应分为下列几个步骤: DNA 变性:DNA 变性是该修饰反应最重要的前提, 一旦 C 开始脱氨基, 碱基不再 配对, DNA变性温度下降。在修饰反应的高盐浓度条件下,DNA易退火形成不完全配对 9 暨南大学硕士学位论文 双链, 使修饰不完全。人们尝试过各种各样的改进方法, 试图减少DNA的退火过程, 比 如先消化 DNA 再进行修饰反应, 或将变性的 DNA 冻结在低熔点琼脂糖中以阻止其退火, 然后在琼脂糖中进行修饰反应。该方法还能极大地减少DNA的丢失。 脱嘌呤问题: 酸催化的脱嘌呤反应会引起DNA的降解, 以致模板序列严重破坏而 难以扩增。在非常精确的酸环境下pH 5 , 脱嘌呤进行得最缓慢。过夜处理能够保证 m C 的完全修饰, 然而过长的孵育并不可取。实际上约5% 的5C在过夜处理 中会脱氨基, m 使PCR 产物中5C 的代表值降低。 链特异性 PCR ssPCR :如果CpG 中的胞嘧啶未甲基化, 那么经亚硫酸氢钠处理 后, 胞嘧啶转化成尿嘧啶, 原有的 DNA 双链不再配对, 形成两条单链。两条链分别可 作为模板进行扩增。由于转化后的模板只含有 A、T、G 三种主要碱基, 且以单链状态 存在, 使单链稳定性下降, 容易降解和形成二级结构。适当延长引物长度平均25 bp 和使用热启动沉降PCR 有利于提高产量和特异性。热启动PCR 的使用能够大大减少引 物二聚体的形成, 使用各种需热活化的 Taq 聚合酶或在 95?恒温条件下加入普通 Taq 聚合酶都能够达到热启动的目的。沉降PCR 是在扩增开始时选择高于Tm 的退火温度, 确保引物首先与特异性模板杂交, 随着扩增的进行, 退火温度逐渐降低并最终低于非 特异性杂交的 Tm 值, 此时目的扩增产物数量已经在可扩增模板中占绝对优势, 并且 以几何数量增长, 在此后的循环中对资源的消耗大大超过非特异性 PCR 产 物, 从而既 能有效扩增出目的产物, 又能提高产物特异性。用于显示亚硫酸氢钠修饰结果最精确 的方法是DNA 测序, 可以将ssPCR 产物克隆测序, 也可直接测序。通过测序掌握了与 表达密切相关的关键性 CpG 位点后, 可选择便利的 COBRA 或灵敏的甲基化特异性 PCR MSP 法来显示这些CpG 位点的甲基化状态。 [20] 甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR): Herman等1996年 10 暨南大学硕士学位论文 在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。它将DNA先用重亚硫酸盐处理,这样 未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变,随后行引物特异性的PCR。MS-PCR 中设计两对引物,并要求:?引物末端均设计至检测位点结束;?两对引物分别只能 与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对,即一对结合处理后的甲基化DNA链,另一对结合 处理后的非甲基化DNA链。检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能 扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化DNA链的 [21][22] 引物扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(见图2) 。 图 2:甲基特异性的 PCR 扩增(MS-PCR)示意图 (DNA 经重亚硫酸盐处理后,以处理后的产物作为模板,加入甲基化特异性的引物(primer?)或 非甲基化的引物(primer?),进行特异性的扩增,只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物 的片段才能扩增出产物。 ) 11 暨南大学硕士学位论文 1.4.3 胎儿 DNA 甲基化位点的应用 近年来,随着对遗传病分子基础认识的不断深入,检测特异基因突变的技术能力的 不断提高,为发展以DNA检测为基础的产前诊断提供了理论和技术基础,对胎儿DNA 进 行遗传分析已成为常规检测手段。传统的进行产前诊断获取胎儿组织的样本包括羊膜 腔穿刺、绒毛膜取样、脐静脉取血等均具有创伤性,对胎儿和孕妇都有一定的危险性。 肿瘤患者血浆中已经证实存在肿瘤来源的DNA 引起人们对外周血循环中游离核酸的生 物学及其在诊断方面的应用价值产生了极大兴趣,人们推测妊娠期妇女外周血中也有 可能出现相似现象。随着研究的不断深入,孕妇外周血中的胎儿DNA 的发现开创了非侵 入性产前诊断的新的可能性,孕妇血浆和血清中相对高纯度和相对浓缩的胎儿DNA 促 进了非侵入性产前诊断的临床应用,非侵入性产前检测已能做到明确胎儿Rh 血型,诊 断强直性肌营养不良、软骨发育不全和某些染色体易位等疾病。但以往对孕妇外周血 中游离胎儿核酸的应用大多局限在检测胎儿从父亲一方继承来的基因或突变,且检测 的胎儿基因必须能与母亲DNA 序列显著区分开来,这种限制性的存在是由于孕妇血浆 和血清中的胎儿DNA 处于一种母体DNA 背景过多的环境中,这种制约导致了: ?对于 一个双等位多态性,杂合多态性的胎儿DNA 不能在母体内决定性表达; ?检测到胎儿 [23] 从母亲继承的等位基因被认为是不可能的 。目前,人们对表观遗传学的生物学作用非 常关注,而表观遗传学最具特征的就是DNA 甲基化,由此人们推论利用母亲 和胎儿的 [24] DNA 甲基化的差异性 来突破上面提到的在孕妇血浆中检测胎儿DNA 的局限性。 人们尝试利用更敏感的检测方法如等位基因-特异性PCR 和实时甲基化特异性PCR , [25] 这两种方法均有可能增加以血浆为基础的表观遗传学分析的灵敏性 ,尤其是实时甲 基化特异性PCR 开创了在孕妇血浆中定量检测胎儿特异性甲基化等位基因的可能。如 果将从孕妇血浆中检测胎儿DNA作为一个常规产前诊断工具,就必然会涉及到血循环中 12 暨南大学硕士学位论文 胎儿DNA 基因标记物的问题。到目前为止,人们对于标记物的设计大多集中在利用母亲 和胎儿之间的基因多态性,从生物学角度考虑,利用组织特异性甲基化标记物可直接分 析是何种类型的胎儿细胞释放胎儿DNA 入孕妇血浆。表观遗传学DNA 甲基化技术也可 应用于与基因组印记有关的紊乱,对与甲基化有关的染色体非整倍性疾病的诊断也会 发挥一定作用。随着人们认识到母胎之间的交换是一个相互影响的过程,表观遗传学 DNA 甲基化技术或许可在分析细胞和DNA 在母体与胎儿之间是如何转移的分析过程中 起到一定作用,也可用于分析其它类型的嵌合现象如移植后的造血嵌合性。随着对人类 基因组认识的不断提高以及DNA 甲基化分析技术的不断发展,希望在不久的将来可利 用的胎儿表观遗传学标记物的数量会迅速增长以及DNA 甲基化技术与传统的基因诊断 技术协同应用于非创伤性产前诊断。 1.5 本研究的目的及意义 本课题选择妊娠妇女为研究对象,采用分子生物学方法探讨利用孕妇血浆中游离 胎儿DNA行无创伤性产前诊断的可行性。研究通过利用PCR扩增、电泳法检测孕妇血浆 中的游离胎儿DNA来鉴定胎儿性别;通过利用Cycling探针、实时PCR技术检测孕妇血浆 中的游离胎儿DNA来排除重型β地中海贫血胎儿;同时获取胎儿脐血或羊水细胞检测结 果作为确定标准。探讨通过重亚硫酸盐处理技术检测胎儿DNA的甲基化特异性位点,及 今后用于定量分析孕妇血浆中游离胎儿DNA来诊断21-三体综合征胎儿的可行性,这些 均具有极其重要的临床意义。 13 暨南大学硕士学位论文 第一部分 改良式PCR技术检测孕妇血浆游离胎儿DNA行无创性产前性别鉴定的 研究 2.1 资料与方法 2.1.1 研究对象 选择2006年9月至2007年4月在深圳市人民医院产科门诊就诊要求引产和产前诊断 的孕妇25例,孕龄为14周~38周,年龄23岁~37岁。设一例未婚且无妊娠史的女性及 和一例男性分别作为阴性和阳性对照,及空白对照(双蒸水)。此外,选取深圳市人民 医院产科病房正常足月临产孕妇5例, 孕龄为38周~41周,比较其分娩前后孕妇血浆胎 儿DNA含量。 2.1.2 PCR检测方法 2.1.2.1 样本的制备 抽取孕妇外周静脉血2ml,EDTA抗凝,离心3000r/min,10min,小心吸取上层血浆 于高压灭菌的1.5mlEppendrof管中,14000r/min,再次离心10min,吸取上层血浆入灭 菌的EP管中,冻存于-20?冰箱。 2.1.2.2 血浆中游离DNA的提取、浓度和纯度测定 待冻存的血浆完全解冻后,采用柱分离法提取DNA。每份标本取400?l血浆,使用 QIAamp Blood Mini Kit试剂盒德国Qiagen公司,严格按说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作,最后将每份血 浆DNA溶解于50?l的AE洗脱液中,-20?保存。DNA浓度和纯度在Ultrospec 1100proAmersham Biosciences进行测定。 14 暨南大学硕士学位论文 2.1.2.3 引物设计及合成 [26] SRY基因是性别决定中最重要的基因,在1990年首先由Sinclair等 从人类Y染色 [27] 体上分离出来,并经Koopman等 转基因小鼠实验证实。SRY基因位于Y染色体短臂1区1 带3亚带上,它是睾丸决定因子testisdetermining factor, TDF的最佳候选基因, 已被许多实验证实。SRY蛋白含有204个氨基酸,其中约80个氨基酸区域即HMG盒是SRY 基因编码蛋白质的唯一功能区。 Homo sapiens chromosome Y,complete sequence: (NC000024 NCBI) 1 gttgaggggg tgttgagggc ggagaaatgc aagtttcatt acaaaagtta acgtaacaaa61 gaatctggta gaagtgagtt ttggatagta aaataagttt cgaactctgg cacctttcaa 121 ttttgtcgca ctctccttgt ttttgacaat gcaatcatat gcttctgcta tgttaagcgt 181 attcaacagc gatgattaca gtccagctgt gcaagagaat attcccgctc tccggagaag 241 ctcttccttc ctttgcactg aaagctgtaa ctctaagtat cagtgtgaaa cgggagaaaa 301 cagtaaaggc aacgtccagg atagagtgaa gcgacccatg aacgcattca tcgtgtggtc 361 tcgcgatcag aggcgcaaga tggctctaga gaatcccaga atgcgaaact cagagatcag 421 caagcagctg ggataccagt ggaaaatgct tactgaagcc gaaaaatggc cattcttcca 481 ggaggcacag aaattacagg ccatgcacag agagaaatac ccgaattata agtatcgacc 541 tcgtcggaag gcgaagatgc tgccgaagaa ttgcagtttg cttcccgcag atcccgcttc 601 ggtactctgc agcgaagtgc aactggacaa caggttgtac agggatgact gtacgaaagc 661 cacacactca agaatggagc accagctagg ccacttaccg cccatcaacg cagccagctc 721 accgcagcaa cgggaccgct acagccactg gacaaagctg taggacaatc gggtaacatt 781 ggctacaaag acctacctag atgctccttt ttacgataac ttacagccct cactttctta 841 tgtttagttt caatattgtt ttcttttctc tggctaataa aggccttatt catttca SRY扩增引物序列为: 正向引物 5’-CTAAGTATCAGTGTGAAACGG-3’ 反向引物 5’-ACAGTCATCCCTGTACAACCTG -3’15 暨南大学硕士学位论文 扩增产物片段大小为380bp;引物序列由上海生工生物工程公司合成;引物 参照文 [28] 献 合成。 2.1.2.4 PCR反应 PCR反应条件1: PCR扩增反应体系总体积为50?l,其中10×Buffer内含5 ?l, dNTP 5?l,正反 向引物各0.8?l10pmol/?l,DNA模板10?l,Taq酶0.3?l,MgCl 4 ?l,加水补足至总 2 体积50?l。PCR反应扩增条件:94 ?预变性1 min,然后以94 ? 10 s、57 ? 10 s和 72 ? 1 min进行35个循环,最后72 ?延伸10 min。在LightCyclerRochePCR仪进行 反应。最后取PCR产物8?l和2?l上样缓冲液(溴酚蓝指示剂)混匀后在1.5%琼脂糖凝胶 中以100伏电压电泳40min。 PCR反应条件2: PCR扩增反应体系总体积为20?l,其中5×Buffer内含MgCl4 ?l, dNTP 2?l, 正 2 反向引物各1?