海洛因依赖对大鼠胃窦胃泌素、生长抑素阳性细胞的影响

海洛因依赖对大鼠胃窦胃泌素、生长抑素阳性细胞的影响 海洛因依赖对大鼠胃窦胃泌素、生长抑素阳 性细胞的影响 第38卷第5期 2007年1O月 解剖 ACTAANATOMICASINICA Vo1.38.No.5 0ct.0O7 海洛因依赖对大鼠胃窦胃泌素,生长抑素 阳性细胞的影响 夏白娟梁文妹 (贵阳医学院组织学与胚胎学教研室,贵阳550004) [摘要]目的探讨海洛因依赖对大鼠胃窦胃泌素(Gas),生长抑素(ss)阳性细胞的影响,以及Gas,SS在海洛 因依赖时的可能作用.方法应用免疫组织化学SABC法和图像分析技术.结果1.与正常组和盐水对照组 相比,海洛因依赖大鼠胃窦内的Gas阳性细胞数量增加(P<O.05),染色强度随依赖时间逐渐增强,平均灰度值明 显低于空白及盐水对照组(P<O.05),且随依赖时间的延长呈下降的趋势,38d时最低.2.海洛因依赖组大鼠胃窦 ss阳性细胞染色强度增强,细胞数量显着高于空白和盐水对照组(P<O.05),平均灰度值低于空白及盐水对照组 (P<O.05).结论大鼠胃窦Gas,SS阳性细胞可能通过增加细胞数量和增加Gas,SS的合成来参与大鼠海洛因 依赖的调节过程. [关键词】胃泌素;生长抑素;胃窦;海洛因依赖;免疫组织化学;大鼠 [中图分类号]R329.1[文献标识码]A[文章编号]0529.1356(2007)05—577 EFFECTSoFHERoINDEPENDENCEoNGas,SSPoSITIVE CELLSINGASTRICANTRUMoFRATS XIABai—juan,LIANGWen—mei (DepartmentofHistologyandEmbryology,GuiyangMedialCollege,Guiyang550004,China) [Abstract]ObjectiveToexploretheeffectsofheroindependenceonthegastrin(Gas),somatostatin(SS)positivecells ingastricantrumofratsandcomprehendthepossiblefunctionsofGas,SSduringheroindependence.Methods lmmunohistochemicalSABCmethodandimagineanalysistechniquewereemployed.Results1.Comparedwiththenormalcontrol group(NCG)andsMinecontrolgroup(SCG),thenumberofGaspositivecellsincreased(P<O.05),theintensityofstaining steppedupgraduaHywiththepassageoftimeduringdependence.Theresultsofimagineanalysisshowedthatthemeangreydegree ofGaspositivecellshadthetrendofdescent.anditWaslowerthanthatintheNCGandSCGwiththelowestdegreeonthe38th day.2.TheintensityofstainingandthenumberofSSpositivecellsingastricantruminheroindependencegroup(HDG) increasedobviouslycomparedwiththatinNCGandSCG(P<O.05)duringheroindependence,themeangreydegreestepped downremarkablythanthatinNCGandSCG.ConclusionTheGas,SSpositivecellsingastricantrumofratsparticipateinthe regulationcourseduringheroindependencebyincreasingthecellnumberandenhancingGasandSSsynthesis. [Keywords]Gastrin;Somatostatin;Gastricantrum;Heroindependence;lmmunohistochemistry;Rats 胃窦黏膜散在分布着种类繁多,功能各异的内 分泌细胞.有胃泌素(gastrin,Gas)细胞,生长抑素 (somatostatin,ss)细胞等.Gas不仅有明显的促进胃 酸分泌的作用,而且对胃肠道黏膜的生长有着较强 的调节,营养作用….ss广泛存在于胃肠道,除了 对胃肠道的运动和分泌有普遍的抑制作用外,对胃 [收稿日期] [基金项目] [作者简介] 2006—09—13[修回日期]2007—02—12 贵州省优秀科技教育人才省长专项基金资助项目 (黔科教办2001—3);贵州省教育厅科研基金资助 项目(黔教科1999) 夏白娟(1977一),女(汉族),四川省荣县人,医学 硕士,讲师. *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) E—mall:wenmeiliang@126.comTel:(0851)6909539 肠道细胞还有保护作用,是胃黏膜细胞保护的重要 因子.并与机体的免疫功能有关.已有资料表 明,海洛因依赖可造成全身多个系统的损害.本 课题组的研究也表明,在海洛因依赖期间,胰岛A,B 细胞的形态学及分泌功能均呈现变化.然而,海 洛因依赖对消化道内分泌细胞形态及其功能影响尚 未见报道. 本实验通过建立海洛因成瘾大鼠模型,应用免 疫组织化学方法观察大鼠在海洛因依赖期间胃窦 Gas,SS阳性细胞的形态,数量,染色强度的改变及 其相互关系,了解胃肠激素在海洛因依赖时的可能 作用,以期为探讨毒品依赖形成机制提供一定的形 态学依据. 解剖38卷,5期 材料和方法 1.动物分组 成年sD大鼠66只,体重180,220g,由贵阳医 学院实验动物中心提供.按配对原则随机分为空白 对照组(NCG)6只,盐水对照组(SCG)及海洛因依赖 组(HDG)各30只,每组雌雄各半,雌雄分笼. 2.模型制作 用已建立的方法制作动物模型:海洛因依赖组 按体重逐日递增皮下注射海洛因药液(纯度为 61.48%,由贵州省公安厅提供),首日剂量为3mg/ kg,2次/d(上午8时,下午3时),连续注射9d至成 瘾,第9d剂量为27mg/kg.此后成瘾大鼠每日上午 8时注射一次剂量维持为27mg/kg,直至取材;盐水 对照组按体重每日注射与实验组相当剂量的生理盐 水;正常组不予任何处理,按时喂养. 3.免疫组织化学SABC法 盐水对照组及海洛因依赖组大鼠分别于第10, 17,24,31,38d处死,每次处死6只,雌雄各半,空白 对照组同期取1只处死取材.大鼠用3%戊巴比妥 钠腹腔注射麻醉,经心脏用生理盐水灌洗,Bouin液 灌注固定后,取胃窦组织.Bouin液再固定,常规石 蜡包埋,制成4ptm厚的连续切片.免疫组织化学单 染法每例观察切片3张以上,切片间隔56ptm.按照 免疫组织化学SABC法进行染色.主要步骤:10% 甲醇.过氧化氢室温下10min,正常山羊血清(1:50) 室温下30min,I抗(分别使用兔抗Gas血清,工作浓 度1:1000,北京大学医学部生理学教研室提供;兔 抗ss血清,工作浓度1:2000,第二军医大学提供) 4?孵育过夜,羊抗兔IgG37?孵育20min,SABC复 合物37?孵育20min,DAB.H2O液显色,苏木精复 染细胞核,中性树胶封片.阴性对照采用PBS缓冲 液代替一抗. 4.细胞计数 随机选取第10,17,24,31,38d海洛因依赖组与 盐水对照组各时间点雌雄大鼠胃窦切片5张,正常 组胃窦切片各1张,在×40物镜下,每张切片随机 选取5个视野,分别计数每个视野内的有核Gas,SS 阳性细胞数. 5.图像分析及统计学处理 随机选取第10,17,24,31,38d海洛因依赖组与 盐水对照组各时间点雌雄大鼠胃窦切片5张,正常 组胃窦切片各1张,应用BioMias图像分析系统 (LEICA公司)进行检测.在×40物镜下,每张切片 随机选取5个视野,分别测得Gas,SS阳性细胞的平 均灰度值.应用SPSS12.0软件包对所得的数据用t 检验进行统计学处理. 结果 1.大鼠胃窦Gas阳性细胞的免疫组织化学观察 光镜下各组大鼠胃窦内均可见Gas阳性细胞 (图1,4),免疫反应产物呈棕色颗粒状,位于胞浆 内.Gas阳性细胞存在于幽门腺,分布于上皮细胞 间.细胞胞体较大,呈锥体形或烧瓶状,基底部较 宽,顶部细长,直达腺腔.阴性对照切片未见阳性细 胞. 与正常组相比,盐水对照组各时间点Gas阳性 细胞的分布,数量及染色强度无明显变化(表1,图 2),且盐水组内各时间点之间也无明显差异.海洛 因依赖组大鼠胃窦Gas阳性细胞分布基本同盐水及 正常组,但细胞数量增多(表1),且随依赖时间的延 长Gas阳性细胞的反应强度逐渐增强,到第38d时 尤其显着,Gas阳性细胞胞质内的反应产物呈深棕 色(图3,4). 表1有核Gas阳性细胞数,视野的比较(牙4-s) Table1ThecomparisonofGaspositivecellswithvisiblenucleusperfieldofview(4-s) #与NCG和SCG比较P<0.05;?HDG组内比较,P<0.05 #AscomparedwithNCGandSCG,P<0.05;?asthecoIIpsoninHDG,P<0.05 将各实验组Gas阳性细胞结果进行图像分析发 现,正常组与盐水对照组Gas阳性细胞的平均灰度 值的差异无统计学意义(图5).而海洛因依赖组 Gas阳性细胞的平均灰度值较正常和盐水对照组显 着降低(P<0.05),且与依赖时间有关;海洛因依赖 组各时间点之间Gas阳性细胞的平均灰度值也有显 着性差异(P<0.05). 2.大鼠胃窦SS阳性细胞的免疫组织化学观察 光镜下,大鼠胃窦SS阳性细胞免疫反应产物呈 棕黄色或棕黑色细颗粒状,存在于胞浆内.阴性对 照切片未见阳性反应细胞.正常组大鼠胃窦SS阳 性细胞多分散分布于胃窦黏膜腺体中下1/3处,位 夏白娟等.海洛因依赖对大鼠胃窦胃泌素,生长抑素阳性细胞的影响 于其他上皮细胞之间(图6).SS阳性细胞形态多 样,呈蝌蚪形,锥体形或不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 形,基底部较宽,顶部 细长,有时可见伸出一个长突起与邻近的其他细胞 接触或直达腺腔(图7a,7d). 与正常组比较,盐水对照组ss阳性细胞的分 布,数量及染色强度均无明显变化,且盐水组各时间 点之间也无明显差异(表2,图8).海洛因依赖组大 鼠胃窦ss阳性细胞的分布与盐水及正常组大致相 同,但细胞数量增多(表2),且随着依赖时间的延 长,ss阳性细胞逐渐增多,在31d时出现高峰,较其 他时间点上的差异具有显着性(P<0.05),并且免 疫染色强度逐渐增强(图9,10).如图11所示,正常 组与盐水对照组ss阳性细胞的平均灰度值之间的 差异无统计学意义;盐水组各时间点之间差异也无 显着性,而海洛因依赖组ss阳性细胞的平均灰度值 较正常和盐水对照组显着降低(P<0.05). 表2有核Ss阳性细胞数,视野的比较(i?s) Table2TheconlpaxisorlofSSpositivecellswithvisiblenucleusperfieldofview(露?s) #与NCG和SCG比较,P<0.o5;AHDG组内比较,P<0.05 #AscPawithNCGandSCG,P<0.05;AAsthecomparisoninHDG,P<0.o5 ;100 名 墓50 0 1Od17(t24d31d38d 海洛因依赣天数 Daysofheroindependence 图5Gas阳性细胞的平均灰度值 Fig.5Valuesofthe11~sngreydegreeofGaspositivecells 容 磊 130 125 120 l15 l10 105 100 10d17d24d31d38d 海洛因依赣天数 圜 Daysofheroindependence 图11SS阳性细胞的平均灰度值 Fig.1lValuesofthemeshgreydegreeofSSpositivecells 讨论 1.海洛因依赖大鼠胃窦Gas阳性细胞的形态及功 能改变 实验证明,给予外源性的五肽胃泌素对大鼠应 激性溃疡,慢性实验性溃疡有保护和促进愈合的作 用J.另有研究报道,萎缩性胃炎者通过调节,可 使胃窦部Gas阳性细胞分泌胃泌素增多,胃酸分泌 量增加,以维持胃窦黏膜的正常厚度.说明无论是 内源性的还是外源性的胃泌素都是促进和维持胃肠 黏膜正常生长的重要因素.正常情况下,胃泌素和 胃酸的分泌在多种因素的调节下保持动态平衡.当 机体受持续的外界刺激导致胃泌素分泌增加或减少 时,该动态平衡受到破坏,导致相应的胃肠道损伤. 而海洛因依赖者胃炎,溃疡等发病率较高,胃肠道功 能紊乱.本实验结果表明,海洛因依赖大鼠胃窦部 Gas阳性细胞数量增多,染色强度随依赖时间的延 长而增强,平均灰度值降低,提示在海洛因依赖期 间,胃窦黏膜分泌胃泌素增加.推测海洛因依赖引 起胃酸分泌增加的机制与Gas阳性细胞数量增加和 功能增强有一定关系,提示Gas阳性细胞可能参与 了海洛因依赖期间受损胃黏膜的愈合和修复. 2.海洛因依赖大鼠胃窦SS阳性细胞的形态及功能 改变 ss可以减轻动物实验性胃黏膜损伤,对大鼠胃 黏膜有保护作用,能预防大鼠胃黏膜的糜烂和溃疡 的发生,可作为胃黏膜局部的防御性物质.SS在 胃溃疡期间参与了自愈过程的调节...另有报道 指出,ss能激活鸦片受体,而阿片肽通过作用于 受体,又可反馈抑制ss的释放,表明ss与内源性 阿片肽有密切关系.本研究发现,SS阳性细胞数量 增加,免疫组织化学染色强度较对照组和盐水组明 显增强,提示海洛因依赖可导致胃窦SS阳性细胞数 量和功能改变,分泌功能明显增强.由此推测,本实 验中ss的变化直接或通过其他因素间接参与了海 洛因依赖期间对胃肠黏膜的保护作用. 通常情况下,Gas和SS处于相互作用和相互协 调状态.本实验观察到海洛因依赖期间Gas和SSE 都明显增高,推测其可能的机理除海洛因对机体的 直接作用以外,还可能是由于Gas分泌增强后,反馈 激活机体的保护功能,导致ss分泌增加.提示在海 洛因依赖期间大鼠胃窦可能通过某些调节机制影响 嘶: ? 580?解剖38卷,5期 图1正常大鼠胃窦Gas阳性细胞SABC法×400图2盐水组第17d大鼠胃窦Gas 阳性细胞SABC法×400图3海洛因依赖组第 10d大鼠胃窦Gas阳性细胞SABC法×400图4海洛因依赖组第38d大鼠胃窦 Gas阳性细胞SABC法×400图6正常大鼠胃窦ss 阳性细胞SABC法×4OO图7a—d形态各异的大鼠胃窦SS阳性细胞SABC法× 1000图8盐水组第10d大鼠胃窦SS阳性细胞 SABC法×4OO图9海洛因依赖组第17d大鼠胃窦ss阳性细胞SABC法×4OO 图1O海洛因依赖组第31d大鼠胃窦ss阳性细胞 SABC法×4OO Fig.1TheratgastricantrumGaspositivecellsinNCGSABC× 400Fig.2TheratgastricantrumGaspositivecellson17thdayinSCGSABC ×4OOFig.3TheratgastricantrumGaspositivecellson10thdayinHDGSABC× 4OOFig.4TheratgastricantrumGaspositivecellson38thdayin HDGSABC×4OOFig.6TheratgastricantrumSSpositivecellsinNCGSABC× 4OOFig.7ThemorphologyofratgastricantrumSSpositive ceilsSABC×1000Fig.8TheratgastricantrumSSpositivecellson10thdayinSCGSABC× 400Fig.9TheratgastricantrumSSpositivecells on17tlldayinSCGSABC× 4OOFig.10TheratgastricantmmSSpositivecellson31thdayinSCGSABC×4OO Gas,SS阳性细胞的增殖及其分泌Gas,SS含量增多, 从而参与了海洛因依赖对机体损伤的调节. 参考文献 【1lJohnsonLR.Newaspectsofthetrophicactionofgastrointestinal homoneslJJ.Gastroenterology,1977,72(4pt.2):788—792. 12JPappM.Pancreaticcytoprotection:newapproacheslJj.ActaPhysiol Hung,1992,80(1-4):339. 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