植物脂肪酸代谢途径遗传调控的研究进展

植物脂肪酸代谢途径遗传调控的研究进展 现代生物医学进展w? 啊.biomed.net.cnProgressinModemBiome~cine2007Vo1.7No.4?6l1? 植物脂肪酸代谢途径遗传调控的研究进展 丁昕刁文一彭昕琴胡家金王祥辉熊兴华 (湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室长沙410128) 摘要目前,利用传统育种方法改良油料作物脂肪酸组分已取得巨大成功,通过有性 杂交,x.射线或EMS处理等方法都可用来 修饰存在于油菜中脂肪酸的性质.国外已培育出高棕榈酸,高或低亚油酸,高油酸 和无芥酸的油菜品种.但由于油料作物基因池 (GenePoo1)的局限性使得育种学家不得不寻找其他种质资源.随着基因克隆和遗 传转化技术的进步,通过基因工程改良油料作 物品质已成可能.本文主要介绍了植物脂肪酸的代谢途径以及通过操纵TAG的生 物合成来改变油的成分等研究,其中主要包括 脂肪酸链长度的改良,饱和度改良,增加脂肪酸含量以及新的不饱和脂肪酸的改良 等方面.不久的将来,转基因油料作物中将会 产生更有价值的脂肪酸造福于人类. 关键词:基因工程,脂肪酸的改良,遗传调控 中图分类号:$143,8文献标识码:A论文编号:1673.6273(2007)04--0611--04 AdvanceinGeneticManipulationofFattyAcidMetabolic PathwayinPlants DINGXin,DIAOWen—yi,PENGXin—q,HUJia-jin,WANGXiang—hui,XIONGXin— hua (CropgeneEngineeringkeyLaboratoryofHunanProvince,Changsha410128) ABSTRACTUsingthetraditionalbreedingmethodstochangethefattyacidcompositionino ilcropscannowbeconsidered asaproventechnique.SexualhybridizationandothertechniquessuchasX-irradiationandeth ylmethanesufonate(EMS)treatment Canmodi%thepropertiesoffattyacidsthatexistintheBrassicaspecies.Ithasallowedtheproductionofrapeseedlineswithhigh palmiticacidcontent,highorlowcontentoflinoleicacidandhigholeicacid,andalsorapeseedwithoutemcicacid.Nevertheless, limitationsintherapeseedgenepoolhavecausedplantbreederstose~chforaltemativesourcesofothercommerciallyinteresting fattyacids.Thedevelopmentofthenewgenecloningandgenetictransformationtechnologiesforgeneticmodificationinthepast twodecadeshasopenedthepossibilityofengineeringawiderangeofnewoilqualitiesinrapeseed.Metabolicpathwayoffattyacid inplantandchangesinoilcomponentsthroughmanipulatingbiosynthesisofTAGwerereviewedinthisarticle.Thesechanges mainlyincludethemodificationofchainlength,thealterationofsaturation,increaseoffattyacidscontentandthemeliorationofthe newmono—andpoly— unsaturatedfattyacids.Genetically-modifiedoilcropswillproducemorevaluablefattyaddStosatisfythe humanneedsinthefuture. KeyWords:Geneengineering,Improvementoffattyadd,Geneticmanipulation ChineseLibraryClassification(CLC):S143.8Documentcode:A ArticleID:1673—6273(2007)04—0611—04 前言 改良农作物品质一直是农业生物技术的主要目标之一.近 年来,随着人民生活水平的提高以及对外贸易的开拓,作物品 质改良研究日益引起人们的关注.植物油是主要的农产品之 一 ,其脂肪酸含量及组分的改良一直与人类的生活息息相关. 由于脂肪是提供人体生命活动的基本能源,而人体又不能合成 某些必需的脂肪酸,植物油便成了人体必需脂肪酸摄入的重要 来源.此外,植物油产品也有着广泛的T业用途.目前,通过改 基金项目:湖南省科技厅课题(BK0421),湖南省教育厅青年 基金课题(04B029),湖南农业大学校稳定人才基金(04WD11) 作者简介:丁昕,(1986一),男,湖南长沙人 通讯作者:熊兴华,E—mail:xiongxh6799@yahoo.corn.cn 收稿日期:2007—01—08接受日期:2007一O1—3O 变种子中脂肪酸含量来满足食用及工业需要,前人已做了大量 的研究_T作[1】,但从现有油料作物中提取的脂肪酸远远不能满 足上述需求.因此,通过调控植物脂肪酸代谢途径而获得食用 及工业用所需脂肪酸的重要性已广泛为人们所接受. 迄今为止,大约鉴定了200多种产生脂肪酸的植物,它们 在碳链长度,不饱和键的位置和数目,羟化作用和环氧化作用 等各方面存在不同[21,如在野生植物中,筛选到含量很高的长链 脂肪酸植物有Crambe,Limoanthes和Lunaria;中链脂肪酸植物 有Cuphea和Lauraceae;羟基脂肪酸植物有Lesquerella;环氧 脂肪酸植物有Vernonia,Stokesia;液体蜡脂植物有Simmondsia 等[31.但这种潜在资源要应用于作物生产中还需做大量的工作. 随着分子生物学及基因工程技术的发展,可以把一些种质资源 中有益的性状通过分子克隆,转基因技术转移到新宿主中,从 而改变植物脂类代谢方式,并取得显着的成绩. ? 612?现代生物医学进展 WWW.blomed.net.CIIProgreflflinModemBiomedicine2007Vo1.7No.4 植物油脂肪酸组分及含量改良的前期工作主要是通过传 统的育种技术进行的.如芬兰的白菜型油菜的高油酸育种始于 ,采用定向选择的方法,通过对连续四代自交个体的选 1992年 择,从起始选择材料油酸含量69%达到85~90%,其亚油酸含 量为1,3%,亚麻酸含量为3,6%,饱和脂肪酸为3,5%.德 国哥廷根大学对甘蓝型冬油菜品种wotan进行化学诱变(2% EMS)处理,也使油酸含量从65%升高到80.4%.近年来随着 分子生物学的蓬勃发展,许多调控脂肪的关键酶基因得到分离 克隆,从而改造植物脂肪酸组分含量的基因工程也迅速发展起 来了.通过操纵TAG的生物合成来改变油的成分,主要包括脂 肪酸链长度的改良,饱和度改良,增加脂肪酸含量以及新的不 饱和脂肪酸的改良.本文主要通过以下四个方面来对植物脂肪 酸代谢途径的遗传调控进行论述. l植物脂肪酸链长度的遗传代谢调控 改良脂肪酸链长度是脂肪酸基因工程的目标之一.植物 中,FAS合成的最终产物通常是由16或18个碳原子为主的中 链脂肪酸,它既可作为食物又可用于工业生产.因此,人们在改 良脂肪酸链长度方面做了大量工作. Lauricacid,C12:0)是制造表面活性 中链脂肪酸如月桂酸( 剂,肥皂,洗涤剂等的重要原料.在椰子油和棕榈油中含有丰富 的月桂酸卿.据统计,每年都有几百万吨的该类脂肪酸从这些植 物中提取出来用于洗涤剂的加工生产.Pollard等(1991)问在加 州月桂树(Umbellulariacalifomica)中发现了使其富含月桂酸 的12:0.ACP硫酯酶,该酶使酰基因达到l2碳长度时便终止了 聚合反应.Davies等(1991)[7】将这种酶进行纯化,发现它是由 两条34KD的多肽链组成.他们根据其氨基酸序列合成cDNA 探针,在月桂树种子子叶的cDNA文库中分离到编码该酶的基 因(ucFatB1).Volker等(1996)[8】将此基因与芜菁种子贮藏 蛋白启动子融合,导人拟南芥.结果,在转基因植物中,12: 0-ACP硫酯酶活性与对照植物相比提高了70倍,而对照植物 的酶活性是以18:1-ACP硫酯酶为主.同时还发现低活度14: 0-ACP的水解活性在转基因植株中同样提高了7倍.成熟种子 的脂类分析表明:未转化植株不存在月桂酸,而所有转基因拟 南芥中脂肪酸总含量不变,说明中链脂肪酸积累导致其它脂肪 酸含量降低.在油菜的转基因研究中,也获得相似结果:油菜种 子中月桂酸含量最高达60%. 对超长链脂肪酸(Verylongchainfattyacids,VLCFAs)的 研究主要集中在芥酸(Emcicacid,C22:lA3),它具有耐高温, 不易挥发又易于凝集的特性.人体对芥酸吸收缓慢,利用率低, 且易导致人体冠心病,脂肪肝的发生,因此,人们一直在培育低 芥酸或零芥酸的油菜品种.目前,工业上的芥酸的生产主要以 普通菜油为原料,但其芥酸含量较低(30%~50%),若利用生物 技术手段将芥酸含量从50%提高到90%,则会大大降低芥酸生 产成本,获得良好经济效益. 近年对拟南芥VLCFA突变体的遗传研究认为脂肪酸延 长受三个基因的调控f1删: (1)FAE1基因决定18:0,18:1和20:1脂肪酸的延长, James等(1995)m俐用玉米转座子从拟南芥中克隆了FAE1基 因,将其转化到芥酸含量极低的烟草和油菜中,均发现芥酸的 积累.Millar等(1997)t埘发现转FAE1基因拷贝数越高,芥酸的 含量就越高. (2)Lassner等(1996)f1从希蒙得木(Simmodsiachinensis) 植物种子的cDNA文库中分离了p-酮酯酰基CoA合酶基 因,由于它能催化18碳链以上的脂肪酸聚合反应,将其导人油 菜可使油菜种子中芥酸含量的明显增加,但芥酸含量不会超过 55%. (3)Metz等(1996)?发现在油菜中溶血磷脂酸酰基转移酶 (LPAAT)对十八碳底物具有优先选择权,而对超长链脂肪酸亲 和性极低,其理想的最高值仅66%.因此,必须通过将能在 Sn-2位置上插入芥酸的LPAAT基因转化油菜来进一步提高 芥酸的含量.Lassner等(1995)f1,Broun等(1995)【1相继在池 花属(Limnanthes)植物中克隆了LPAAT基因,但转化油菜发 现,Sn.2位置上芥酸含量增加,但其芥酸总量并未增加.这说明 芥酸在Sn.2位置上的增加是在Sn.1和Sn.3位置上芥酸含量 减少的基础上形成的.Laurent等(1992)B61对油菜,旱金莲,大 豆,玉米,棕榈和草地泡沫(Limnanthesalba)等油料植物种子成 熟过程的研究就曾发现只有草地泡沫植物的LPAAT酶可使芥 酸CoA与1.芥酸3-磷酸甘油酯生成二芥酰磷酸并进一步生 成三芥酰甘油酯.若能将草地泡沫的LPAAT基因转入高芥酸 油菜,理论上可产生90%以上芥酸的油菜新材料. 2植物脂肪酸饱和度的遗传代谢调控 植物油作为主要的食用油,人们希望提高不饱和脂肪酸的 含量,降低饱和脂肪的含量.利用基因工程手段降低饱和脂肪 酸含量主要有以下三方面的工作: (1)通过提高催化聚合反应酶基因的表达水平,可制约棕 榈酰硫酯酶的活性,提高硬脂酰ACP含量.Bleibaum等(1993) ?利用B.酮脂酰基ACP合酶基因(KASII)在油菜种子中超 表达抑制棕榈酸合成并降低了棕榈酸的含量. (2)Yadar等(1993)?通过竞争抑制方法降低饱和脂肪酸 酰基硫酯酶,即将另,种活性更强的硫酯酶基因转入植物,以 抑制棕榈酰或硬脂酰硫酯酶的活性,降低了饱和脂肪酸含量. (3)通过提高脱饱和酶基因的表达水平,促使饱和脂肪酸 向不饱和脂肪的转变.Graybum等(1992)f1从酵母和小鼠中克 隆了硬脂酰CoA脱饱和酶基因,并转化烟草,结果饱和脂肪酸 含量明显降低,不饱和脂肪酸含量升高.由于高硬脂酸的油脂 可应用于生产人造奶油和用作可可油的替代品,其基因工程调 (1992)从芜菁(Brassica 控方面也做了大量工作.Knutzon等 rapa)中克隆了硬脂酰ACP去饱和酶cDNA,并构建了种子特 异性的反义结构,转化芜菁和油菜.结果一些转基因种子中硬 脂酸占总脂肪酸比例由12%上升到40%,同时油酸含量降低. 由于多不饱和脂肪酸如亚麻酸(18:3)易氧化的缺点,人们 希望植物生产单不饱和脂肪酸如油酸(18:1),而且高油酸的植 物油在工业上也具很高的应用价值,如用油酸生产的杜鹃花酸 是许多工业产品的必要原料(Topter,1995)91]等.Hiz等(1995) 利用油酸脱饱和酶(FAD2)反义抑制技术,使油菜的油酸含 量达到83%,这种转基因油菜与另一种油酸含量78%的突变体 油菜杂交,结果培育出油酸含量达87%的油菜新品种.Stout- jesdijk等(2000)卿通过构建携带油酸脱饱和酶的共抑制质粒 并转化甘蓝型油菜和B.juncea品种,通过使其内源油酸脱饱和 酶沉默而使其油酸含量分别升高到89%和73%. 现代生物医学进展www.biomed.net.cnProgressinMod皇旦皇皇!v'!!!!:鱼: 3植物种子含油量的遗传代谢调控 为了提高油料作物种子本身肪脂酸的含量,提高其产油 率,需对某些关键步骤进行调控,以提高TAGs的合成速率.大 量研究表明:乙酰CoA羧化酶(AcetylcoenzymeAcarboxylase, ACCase)是脂肪酸合成过程的限速酶.在质体中,ACCase是由 四个亚基形成的异聚体酶;而在细胞质中,HO—ACCase则是一 个大于220KD的二聚体,它催化产生的丙二酰CoA用于超长 链脂肪酸的延伸.El前,增加种子油含量主要有三方面的研究: (1)Roesler等(1997)[242将拟南芥编码的HO—ACCase的ACC1 基因与叶绿体RUBISCO小亚基的转运肽序列相连,并导入油 菜,转运肽.HO.ACCase融合基因在种子中超表达,所产生的 HO.ACCase以活性酶的形式被转移到叶绿体中.对分离的质 体进行体外酶学分析发现:胚中表达的转移肽-HO-ACCase融 ,2倍.转基 合蛋白的活性比质体本身具有的ACCase要高1 因油菜的油酸有所增加,产油率比对照提高5%,Rowsler认为 将细胞质活动的HO.ACCase定位在质体,既保护了它不受细 胞质中蛋白质代谢的影响,同时HO—ACCase也不受控制质体 ACCase活性调节的抑制作用,这都是可能导致转基因植株产 油率高的原因. (2)Zou等(1997)2251研究酵母LPAAT在油菜和拟南芥中 的表达认为,酵母的SLC1基因编码具LPAAT活性的蛋白质, 且其突变基因SLC1—1的产物对长链脂肪酸有更大的偏好性, 将突变基因转入油菜和拟南芥后发现TAG的sn一2位置上超 长链脂肪酸增加而且种子中总脂肪酸的含量升高.而Lassner 等(1995)1t4]曾将meadowfoam中编码LPAAT的基因导入油 菜,只发现:TAG的sn.2位置上芥酸含量增加,总的含油量并 未增加.故Zou等人认为TAG的sn一2位酯酰基形成是TAG 合成的调控步骤,而酵母的LPAAT则不属于此调控系统,这与 上面HO.ACCase基因在质体中表达产生高ACCase活性机制 类似. (3)陈锦清等(1999,2000)首先提出底物竞争调控籽粒 蛋白质/油脂含量比率的反义PEP技术路线."底物竞争"假说 认为:籽粒的主要贮藏物质油脂,蛋白质均来自葡萄糖酵解产 物.丙酮酸,两者之间存在底物竞争,其平衡点取决于两类物 质代谢的关键酶,丙酮酸羧化酶(PEPCase)和乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)的相对活性.PEPCase催化丙酮酸合成草酰乙酸 进入蛋白质代谢;ACCase催化丙酮酸合成乙酰辅酶A进入脂 肪代谢.通过构建反义PEP基因表达载体转化油菜,转基因油 菜比对照含油量高64,l8%,最高含油量达495%. 4植物新的不饱和脂肪酸的遗传代谢调控 目前,人类发现某些植物与真菌作为储藏脂质积累了各种 特殊的脂肪酸.有些特殊的脂肪酸有很高的价值,只是生产这 些脂肪酸的有机体不能适合大规模的繁殖与培养.因此,科 学家们把注意力集中到相关的编码酶基因,若将它们转入栽培 作物中生产新的脂肪酸,那么,转基因油料作物产生的特殊脂 肪酸就可用于工业和医药等方面1. 多聚不饱和脂肪酸(PUFAs:具有由特殊的去饱和酶形成 的两个或多个双键的长链脂肪酸)由于阐明了它们的生物作用 而进入了生物医药和营养领域.PUFAs在动,植物中广泛存在, 它们是细胞膜的主要成分,并在某些特殊的细胞中充当信号分 子或激素分子,并可调节细胞的流动性,尤其在显花植物的种 子中是储藏的三酰甘油的主要组分,商业上生产的PUFAs主 要来自种子油,矿物油和某些哺乳动物.预计将来的PUFAs市 场这些来源将供不应求,因为哺乳动物是不能合成某些重要的 脂肪酸如亚油酸和a.亚麻酸,它们必须由饮食提供. linolenicacid,C18:3A6'9,)和花生四烯 (1)V一亚麻酸(V— 酸(Octadecatetraenoicacid,C18:4A6,9,12,15)是动物和人体营养 所必需的重要的多聚不饱和脂肪酸,临床医学证明食用v.亚 麻酸对于类风湿性关节炎,高血压,高血脂,糖尿病等的治疗有 益;花生四烯酸则对于血小板凝集有关的心血管疾病和血栓病 的治疗有效.在工业上,V-亚麻酸可用于制造化妆品,花生四 烯酸则可用于速干胶片,特殊蜡质以及塑料的生产.在一些低 等植物(如苔藓,蓝藻,藻类,真菌等),这两种脂肪酸比较常见. 一 些高等植物(紫草科,虎耳草科等)体内也含有生成v.亚麻 酸和花生四烯酸所必需的A6一脱饱和酶.而许多油料作物由于 体内缺乏A6一脱饱和酶而不含v-亚麻酸和花生四烯酸.若能 使A6-脱饱和酶在油料作物体内表达,则可以将其种子中含量 丰富的亚油酸和a一亚油酸转变为v-亚麻酸和花生四烯酸. Reddy等(1996)[29]从蓝藻中克隆到A6一脱饱和酶基因,此基因 与其它脂肪酸脱饱和酶基因具同源性.将其与35S启动子相连 导入烟草,结果在转基因烟草种子中未 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 到v一亚麻酸和花 生四烯酸,但叶的提取物中则发现了这两种脂肪酸,原因是其 基因的表达剂量低的缘故.Sayanova等(1997)[蚓通过EST分析 及cDNA文库筛选,从高等植物琉璃苣(Boragoofficinalis)中 克隆了全长的A6一脱氢酶基因,将其与不同启动子相连转化烟 草与拟南芥,转基因植物中均检测到了v.亚麻酸和花生四烯 酸,并且,在向日葵的2s清蛋白启动子调控下的此基因可在拟 南芥中高频率地表达,其种子中v.亚麻酸含量达C18脂肪酸 总量的10%. (2)岩芹酸(Petroselinicacid,C18:1A6)是胡萝卜种子和芫 荽种子中含量较高的一种脂肪酸.由于它与油酸在双键位置上 的不同而导致其熔点分别为33"C和12"C.故人造黄油常用含 岩芹酸丰富的植物油,同时,岩芹酸裂解可产生月桂酸和已二 酸(Adipicacid),后者是制造尼龙不可缺的原料.Cahoon等 (1992)通过对芫荽胚胎cDNA文库的筛选,克隆了生成岩芹 酸的关键酶基因?4一棕榈酰ACP脱饱和酶(A4-parmi. toyl—ACPdesaturase)基因,将其导入烟草愈伤组织,结果检测到 岩芹酸,其占总脂肪酸的4%. (3)蓖麻酸(12一羟基油酸,Ricinoleicacid,C18:1A9)是蓖麻籽 中含量很高的一种羟化脂肪酸,约占蓖麻总量的85%.由于羟 化脂肪酸含量高的油脂,其粘滞性也高,所以被用于生产增塑 剂,尼龙及防水剂的原料.目前蓖麻油是羟化脂肪酸的唯一商 业来源,但由于其生长条件苛刻,且蓖麻油含一些有害物质,因 此,蓖麻并不是一种理想的油料作物.Broun等(1997)its]利用 EST分析及cDNA文库筛选技术,克隆了蓖麻脂肪酸羟化酶基 因,将其在35S启动子调控下导入烟草,仅在其种子中检测到 占总脂肪酸O.1%的蓖麻酸.后又将此基因分别在35S和种子 特异启动子的调控下导入拟南芥,结果转基因拟南芥的蓖麻酸 含量远高于转基因烟草,并且种子中还含有另外几种羟化脂肪 酸.在种子特异启动子调控下的蓖麻酸最高含量达8%,所有羟 ? 614?现代生物医学进展 www.biomed.net.oilProgressinModernBiomedicine2007Vo1.7No.4 化脂肪酸占总脂肪酸含量的17%. 近来,国外有大量的以修饰植物脂类组分为目标的研究报 道,且有大量编码.各种不同脂肪酸脱饱和酶的基因被克隆,并 暂时建立了各种脱饱和酶之间的亲缘关系.在对脱饱和酶基因 在异源宿主中表达研究中也出现了一些未曾预想的结果,但这 有助于我们更进一步的理解植物的脂类代谢.我相信,不远的 将来,在转基因的油料种子中将产生特殊的更有价值的脂肪酸 并进入市场. 5结语 近年来,随着分子遗传学及生理学的深入发展,人们对脂 肪酸的代谢及三酰甘油合成的途径有了更深入的认识.研究表 明:贮藏脂的生物合成和膜脂的形成是受不同遗传机制控制 的,即使它们的早期阶段具有一个共同的生命合成途径,但贮 藏脂的脂肪酸组成的变化并不会影响膜脂的组分,因此植物贮 藏脂的生物合成途径特别适合于植物分子遗传操作. 当前,我们要获得基因工程的脂肪酸,首先得利用已有资 源,克隆出脂肪酸代谢调控中大批关键酶的基因.其克隆方法 有以下三种:从纯化酶蛋白着手,根据酶蛋白氨基酸序列推断 该酶基因的部分核苷酸序列,并以此为探针在相应的cDNA文 库中分离出目的基因;对T.DNA标签及表达序列标签(EST) 进行分析,以克隆出控制该性状的基因;或从某一性状的突变 体人手,通过与野生型比较,利用差异筛选技术,对两者的cD- NA文库进行分析,从而找出与此表型有关的基因.然后通过 转基因的方法来改变脂肪酸的链长,含量,双键的数量等,主要 是采用向植物中转入新的酶基因或超表达已有的酶基因来提 高某种脂肪酸含量,或经过反义技术减少酶基因的表达来控制 某种脂肪酸的含量.目前,转化工作大多集中在单基因的导入 研究,而实际上脂肪酸含量变化与多基因的协同作用分不开. 通过多基因导入的调控还刚起步,这更需要对植物脂肪酸代谢 途径的各个步骤有更清楚的了解. 总之,脂肪酸调控的基因工程目的就是改变其组分和含 量,以生产出符合各种用途的脂肪酸.我们有理由相信在二十 一 世纪,"设计的油"在转基因植物中的生产变为现实,并不断 满足食用,化学和药物工业的巨大需求. 参考文献(References) …MACKENZIESL.Currentdevelopmentsinthemodificationof oilseedcomposition叫.OutlookonA,1995,24:213—218. 【2JVANDERLOOFJ,FoxBGandSomervilleC.Unusualfattyacids. 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