多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析

多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析 多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查 分析 疾病防治中国畜牧兽医2O09年第36卷第5期 多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析 王娟萍,姚敬明,雷字平,周胜花.丁馥香,曹日亮,吴忻,孙建刚 (1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所,太原O3O032;2.山西省动物疫病预防控制中心,太原O3OO24) 摘要:为了解猪群中病毒性繁殖障碍疾病的流行状况,用多重PCR诊断方法,对太原市附近14个养猪场和门诊病例共 1O68份样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRsV),猪瘟病毒(CsFV),猪细小病毒(PPV),猪伪狂犬病病毒(PRV),猪圆 环病毒2型(PCv-2)的检测,其平均感染率分别为:PRRsV32,CsFV4O,PPV2O,PRV12%,Pcv_227.其中混合 感染2种病毒的猪群为39,感染2种病毒的猪为24.用RT—PcR试剂盒对山西省?个地市66个猪场及121个散养户 的1572份血样进行了PRRsV和CsFV的检测,结果PRRsV感染率为33,CsFV感染率为46.用间接血凝试验对61个 县38个乡136个村179户的1593份血样进行了猪瘟免疫抗体的检测,平均合格率为43.9,从而为防控此类疫病的发生,制 定综合防制 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 提供试验数据. 关键词:多重PCR;猪繁殖与呼吸综合征病毒;猪细小病毒;猪伪狂犬病病毒;猪圆环病毒2型;猪瘟病毒;繁殖障碍 中图分类号:S858.28文献标识码:A文章编号:1671—7236(2.09)O5一O152一O5 目前,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪 细小病毒(PPV),猪伪狂犬病病毒(PRV),猪圆环 病毒2型(PCV一2),猪瘟病毒(CSFV)是引发猪繁殖 障碍的主要病原(Barbara等,2O03;费恩阁等, 2004).PRRSV,PCV一2可引起感染猪免疫抑制,其 它病原乘虚而人,造成混合感染.多重PCR可以在 一 份样品中同时检测出多种病原,对多种疾病进行 同步诊断,具有快速,敏感,特异,经济等优点.为 此,笔者采用建立的多重PCR(针对PRRSV,PPV, PRV,PCV一2)以及CSFVRT—PCR试齐0盒,PRRSV EL1SA试剂盒与CSFV间接血凝试剂盒分别对山 西省猪群中的PRRSV,PPV,PRV,PCV一2,CSFV 进行检测,对病毒性繁殖障碍疾病的流行状况与发 生特点进行了调查分析,为制定综合防控措施提供 科学依据,从而使疾病得到有效控制. 收稿日期:2oO8—11—12 作者简介:王娟萍(1958一),女,山西人,本科,研究方向:畜禽传 染病及分子生物学. 基金项目:山西省科技攻关项目(Z?6O31O56). l材料与方法 1.1病毒株,组织病料,阳性对照猪繁殖与呼吸 综合征毒株(PRRSV),猪细小病毒株(PPV),猪伪 狂犬病病毒株(PRV),猪圆环病毒2型毒株(PCV一 2)由军事医学科学院军事兽医研究所提供;4种病 毒PcR阳性对照由北京世纪元亨动物疫病防疫技 术有限公司提供;临床组织病料,由课题组从疑似病 猪体内采集. 1.2主要试剂和引物 1.2.1试剂TaKaRaEx丁口口DNA聚合酶,Re— verseTranscriptaseXL(AMV)反转录酶,Ribonu— cleaseInhibitor(RNasin)RNA抑制剂,DNAMark— erDL200O等试剂购自宝生物工程(大连)有限公 司;Promega公司生产的总RNA抽提试剂盒,病毒 DNA抽提试剂,CSFVRT—PCR诊断试剂盒和美国 IDEXX公司生产的PRRSVEUSA诊断试剂盒等 由北京世纪元亨动物疫病防疫技术有限公司提供; 猪瘟病毒(CSFV)抗体间接血凝试剂盒由中国农业 科学院兰州兽医研究所提供;多重PCR/RT—PCR (TheAnima1DiseaseContr0lCenterofHunanPr0vince,Changsha41OOO7,China) Abstract:AbacterialwhichwasGrampositive,slendernessandirregularityinappearancewe reiso1atedfr0mapig,itsliV— erhadpuru1encenodusandlungsandthespleenwerehaematoce1e.Theiso1atedbacteriumg rewslowlyinBSA,sheep'sblood agarandchoco1ateagar,andshoweda—haemolysisinsheep'sblo0dagar.Theresults0f16SrDNAPCRsequenceandAPIbio— chemistryidentificati0nshowedthattheiso1atedbacteriumwasArc口06nfr"0g已s.TheArf口0c,er"mp0g5 caused1O0mousedeathin24,52h,andcauserabbitdeathin72hbyenterocoeliainnoculation,itshowedthatitwasViru— lentbacterium. KeywOrds:Arc06nc"户Dgs;16SrDNA;PCR;biochemistryidentification 中国畜牧兽医2oO9年第36卷第5期疾病防治?153? 系统为本课题组建立. 1.2.2引物选择PPV的2基因,PRRSV的 M,N基因,PRV的gD基因,PCV一2的()尺F2基因 为其扩增靶序列,借助计算机筛选 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 出符合多重 PCR要求的4对引物与1条反转录引物(孙明等, 2O00;Joseph等,2O05),引物由宝生物工程(大连) 有限公司合成(表1). 1.3病毒核酸的抽提按照DNA/RNA提取试剂 盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作步骤分别进行病毒核酸的提取. 1.44种病毒4重PCR反应条件PRRSV反转 录反应体系:总体积20L,DEPc灭菌水4L,16 pm0l/mLRT一弓I物4L,5×RTBuffer4L, dNTP(2.5mmol/L)2L,AMV反转录酶(10U/ L)1L,RNasin(40U/L)1L,RNA模板4L. 混匀,1O00r/min离心1min,在PCR仪上进行以下 循环:42?6Omin,98?5min,一2O?保存备用. 表1多重PCR引物序列 注:*:Y=C/ 4重PCR反应体系共20L:MgCl2(150 mol/L)2L,dNTP(2.5mmol/L)2L,1O×q Buffer2L,PPV,PRV,PCV一23种DNA病毒的 上下游引物混合液各1L(每条引物浓度20pmol/ mL),PRRSV上下游引物混合液2L(每条引物浓 度40pmol/mL),PPV模板1L,PRV模板1L, PCV一2模板1L(3种DNA模板3L),PRRSV cDNA模板4L,T口q酶(0.5U/L)2L.4重 PCR扩增条件:94?3min;94?3Os,55?30s, 72?30s,35个循环;72?延伸7min. 1.5PCR产物检测PCR产物15L与上样缓冲 液3L混合,采用1.5g/L琼脂糖凝胶,TAE电泳 缓冲液,以5V/cm,单项PCR电泳30min,多重 PCR电泳50min,在紫外凝胶成像系统中观察结果 并拍照. l_6猪瘟病毒的检测CSFV的检测按CSFV RT—PCR诊断试剂盒说明书操作. 2结果 2.1病料4种病毒4重PCR扩增结果4重PCR 扩增结果见图1. 2.2猪瘟病毒RT—PCR扩增结果猪瘟病毒RT— PCR扩增结果见图2. 2.3重点猪场发病情况及多重PCR检测结果? A场:100头规模种猪场,猪瘟免疫用细胞苗,在母 猪产仔后20d(配种前)免疫.细小病毒用细小病毒 bp 660 447 313 217 0Hl234567 图l4重PCR扩增结果 注:O,阴性对照;1,PRRSV+PCV一2+PPV+PRV;2,3,PCV一2 +PPV;4,PRRSV+PcV一2;5,7,阴性样品;M,DNA MarkerDL2OOO. l11098765432lOM 图2CSFVRT_PCR扩增结果 注:M,DNAMarkerDL2?O;O,阴性对照;1,阳性对照;2,5, 8,11,CSFV阳性;6,7,9,1O,CSFV阴性. 蜂胶灭活苗,经产母猪每年免疫1次,初产母猪还未 免疫.猪伪狂犬病用gE基因工程缺失苗全部免 疫.猪繁殖与呼吸综合征按免疫程序进行免疫. 2OO6年以来,该猪场母猪经常出现流产,2O,5O日 龄仔猪死亡,有的整窝死亡,2OO7年11月份,仔猪 死亡提前到15日龄左右,死亡率超过50.临床 ?????? 加752l ? 154?疾病防治中国畜牧兽医2O09年第36卷第5期 表现为:初产母猪所产仔猪死亡率高,仔猪表现消 瘦,水样腹泻,皮肤毛孔渗出血,用氟哌酸等治疗有 效,但停药后又复发.剖检可见胸膜肺炎,心包积 液,淋巴结,脾脏肿胀出血,淋巴结发白化脓,间质性 肺炎.2007年11月29日采集病料,用多重PCR 检i贝0PRRSV,PPV,PRV,PCV一2及用CSFVRT— PCR诊断试剂检测CSFV.检测结果表明PCV一2, PRRSV,CSFV呈阳性,确诊猪群为PCV一2, PRRSV,CSFV野毒混合感染. ?B场:100头规模种猪场.仔猪断奶后,40日 龄开始个别猪皮肤出现圆形,突起的结节,2O07年 11月29日采集病料,用多重PCR检测,PCV一2, PRRSV,PPV呈阳性,确诊猪群为PCV一2,PRRSV, PPV野毒混合感染. ?C场:母猪存栏1O0头,肥猪存栏6O0头,年 出栏2OO0头.PRV用基因缺失活毒苗免疫, PRRSV,PPV,CSFV用弱毒苗免疫.24,70日龄 仔猪出现颤抖,共济失调等神经症状,腹泻,排黄白 色稀粪,呼吸困难,颈部,腿内侧有出血点.其中有 一 头初产母猪产死胎6只,木乃伊胎4只(该猪 PCR检测PRV呈阳性).另一头经产母猪第7,8 胎早产7,8d,全部流产死亡(该母猪PCR检测 PRRSV呈阳性).2O07年11月9日采集病料,用 多重PCR检测,PRRSV,PRV呈阳性,确诊猪群为 PRRSV,PRV野毒混合感染. ?D场:母猪存栏60头,肥猪存栏3O0头,年出 栏11O0头.免疫PRV,PRRSV,PPV,CSFV和口 蹄疫疫苗.2OO7年断奶前24,40日龄仔猪出现颤 抖,腹泻,消瘦,呼吸困难,腹部有出血点,腋下淋巴 结肿大.1只50日龄仔猪剖检可见肺脏大面积肝 样变,胃出血,内容物呈暗褐色,PCR检测为PPV, PRRSV混合感染.另一头初产母猪体温升高,咳 嗽,呼吸困难,两耳呈蓝紫色,产出8只木乃伊胎和 1只特大型仔猪,仔猪因难产死亡,母猪PCR检测 PPV呈阳性.2O07年11月9日采集猪群病料,用 多重PCR检测,结果PPV,PRRSV呈阳性,表明猪 群为PPV,PRRsV野毒混合感染. ?E场:母猪存栏200头,肥猪存栏2O00头, 做过PRV,PRRSV,PPV,CSFV和口蹄疫免疫. 15,20日龄仔猪多见呼吸困难,3,4d后死亡,死 亡率5%,2O%,剖检可见肺脏有间质性肺炎,呈肝 样变,淋巴结肿胀出血,肾有弥漫性出血点,脾脏有 梗死灶,肠道黏膜出血.曾作金标抗体检测,结果表 明PCV一2呈阳性.20O7年11月9日采集病料,用 多重PCR检测,PRRSV,PCV一2,CSFV呈阳性,确 诊为3种野毒混合感染. ?F场:母猪存栏60头,肥猪出栏1OO0头,常 规免疫PRV,PRRSV,PPV,CSFV和口蹄疫疫苗. 一 初产母猪同窝产出2只活仔,5只死胎.死胎体 表青紫,腹腔黄染,出血,下颌水肿,采集病料用多重 PCR检测,结果表明PCV一2,PPV呈阳性. ?门诊病例:对2OO6年6月,20O7年12月 在山西省农业科学院畜牧兽医研究所就诊的每个 病例的发病特点做详细记录,采集病料用多重 PCR进行检测(表2).被检测猪群中混合感染情 况见表3. 表2l4个猪场及门诊病例多重PCR检测结果 猪场检测头数PcV2阳性率()PPV阳性率()PRV阳性率()PRRSV阳性率()cSFV阳 性率(%) A场 B场 C场 D场 E场 F场 G场 H场 I场 J场 K场 L场 M场 N场 门诊 合计 oOO?O们O?弘OO档?? 勰驺O"on?0o? OO?OOOO"?OOO O?O?O?骢OOOO? ?oO?o的娼oO弘?0 8 M?坞?M跚? 中国畜牧兽医2OO9年第36卷第5期疾病防治?l55? 2.4山西省猪PRRSV,CSFV的调查2007年4 月23日,27日,对山西省?个市22个县59个猪 场(户)未免疫PRRSV疫苗的3O8份猪血清,用美 国IDEXX公司提供的ELISA试剂盒进行『l PRRSV抗体检测.阳性样品108份(S/P值? 0.4),平均阳性率达35.O6.由于猪群未免疫 PRRSV疫苗,血清抗体阳性,表明猪群已被 PRRSV野毒感染(表4). 表4PRRSVELISA抗体检测结果 为进一步了解猪群中CSFV与PRRSV的感染 状况及相互关系,笔者于2O08年4月,6月对山西 省11个地市进行了猪瘟,猪繁殖与呼吸综合征的 RT—PCR检测和CsFV免疫后抗体监测,检测结果 见表5,6. 表5猪瘟,猪繁殖与呼吸综合征RT_PCR检测结果 地区检测总数(份)PRRsV阳性率()cFsV阳性率() 太原 晋城 阳泉 朔州 晋中 长治 运城 忻州 临汾 吕梁 大同 总计 表6猪瘟免疫抗体间接血凝试验检测结果 地区检测数(份)合格数(份)合格率() 太原 晋城 阳泉 朔州 吕梁 大同 忻州 临汾 晋中 运城 长治 总计 3讨论与 小结 学校三防设施建设情况幼儿园教研工作小结高血压知识讲座小结防范电信网络诈骗宣传幼儿园师德小结 表2为2OO6年,2O07年太原市周边猪场病毒 性繁殖障碍疾病的发生感染情况,结果表明CSFV 阳性率为40,PRRSV阳性率为32,PCV一2阳 性率为27,PPV阳性率为2O,PRV阳性率为 12.从表4,6可见,20O6年10月,2O07年12 月,山西省某些地区猪群病毒性繁殖障碍疾病感染 非常严重,11个地市中,有5个地区感染率为46.7, 63.3,另5个地区感染率为1O,37.到2O08 年4月,山西省猪群中猪繁殖与呼吸综合征的感染 率仍然较高,PRRSV的RT—PCR平均阳性率为 32,其中5个地市的平均阳性率为44,59, 占所检测地市的45.5,可见猪群病毒性繁殖障碍 疾病普遍流行,对养猪业造成了严重损失,必须加强 对这类疾病的防控. 表3为检测猪群病毒性繁殖障碍疾病的混合感 染状况,感染1种病毒的猪群为56,感染2种病 毒的为39,感染3种病毒的为2O;感染1种病 毒的猪为45,感染2种病毒的为24,感染3种 病毒的为12.可见山西省猪群中感染2种以上 病毒的情况较普遍,约占猪群的39%.在临床上常 见CSFV,PRRSV,PRV,PCV一2,PPV,猪流感病毒 等2,3种病毒混合感染,并继发支原体和细菌性疾 病.混合感染明显加剧了病猪的临床症状,提高了 猪群的发病率和死亡率,同时加大了防控的难度. 由于PRRsV,PcV一2,PRV等都是严重的免疫 抑制性疾病,病毒损害了肺部的巨噬细胞和淋巴细 胞,引起T淋巴细胞和B淋巴细胞发生改变,造成 机体免疫抑制,尤其是干扰猪瘟等疫苗的免疫应答, 导致免疫失败,抵抗力低下,成为当前猪病防控最大 的威胁.国外许多研究结果发现,在有PCV一2感染 -? 的情况下,CSFV疫苗的功效可能被完全抑制, PRRSV的临床症状会加重,其它的继发感染现象 535)4949,??m的 弱蛇8m加 ? 156?疾病防治中国畜牧兽医2O09年第36卷第5期 增多,这主要是由于PCV一2的去淋巴细胞化作用造 成了机体的免疫抑制(赵建增等,2O08). 从表5可见,山西省猪群病毒性繁殖障碍疾病 中猪瘟的感染率最严重,RT—PCR平均阳性率为 46,其中8个地市的猪瘟抗原平均阳性率在 45,71,占全省11个地市的72.7.从表6 可见,山西省猪群中猪瘟疫苗的免疫抗体水平参差 不齐,猪群免疫抗体合格率为11.9,87,差异 较大,平均合格率只有43.9%,大大低于87的标 准.56的猪场猪瘟免疫不合格,这与CSFVRT— PCR平均阳性率为46相符.造成猪瘟流行的重 要原因,除隐性感染母猪的带毒垂直传播造成仔猪 感染外,猪群感染免疫抑制性疾病,造成机体不能产 生正常的免疫应答,以及免疫程序不合理和使用疫 苗不科学,抗体水平低,根本抵抗不了猪瘟野毒的侵 袭也是其感染的主要原因.非典型性猪瘟,隐性带 毒尤其是母猪带毒,持续感染和免疫失败是养猪生 产中普遍存在和有待解决的问题,也是今后研究猪 瘟防控的重点. 在养猪生产中,做好各项饲养管理的同时,还必 须做好猪群的疫情监测,发现疫情,要及时隔离观 察治疗.对一些恶性疾病,尤其是种猪带毒感染 垢,可垂直传播的疾病,要及时淘汰感染猪.根据 实际情况,制定科学的免疫程序,注意疫苗免疫过 程的 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化,并做好免疫抗体水平的监测,对免疫 失败的要及时加强免疫,使猪群得到合理,安全, 有效的防疫,要特别重视免疫抑制性疾病的防控, 以确保猪群的生物安全. 参考文献 1王泽洲,于勇,吴越,等.猪生殖障碍疾病的研究概况[J].中国兽 . 医科技,2007,37(9):823,826. 2孙明,李卫红,高显明,等.应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关 病毒的检测I.JEV,PPV,PRRsV,PRV多联PcR引物设计[J]. 中国兽医,2OO0,2O(1):1O,14. 3闫晓玲,魏玉明,祁发娴,等.规模养猪繁殖障碍性疾病,呼吸道疾 病混合感染的诊断与防制[J].中国畜牧兽医,2o07,34(11):l12 , l14. 4赵建增,赵亚荣,邢海云,等.我国部分地区猪病的流行状态研究 [C].中国畜牧兽医学会动物传染病分会第三届猪病防控学术研 讨会论文集,2008,4,6. 5高志强,郭鑫,杨汉春,等.猪繁殖与呼吸综合征缺失变异株的基 因组特征[J].畜牧兽医,2005,36(6):578,584. 6AllanGM,McNe|l1yF,KennedyS,etaI.Isolati0nofp0rcinecir— covirus-likevirusesfrompigswithawastingdiseaseintheUSA andEurope口].JVetDiagnInvest,1998,1O(1):3,1O. InVestigationandAnalysis6nMultiplexPCRf0rP0rcine Repr0ductiveFailureCausedbVViruses WANGJuan—ping,YAOJing—ming,LEIYu—ping,ZHOUSheng—hua, DINGFu—xiang,CAORi—liang,WUXin,SUNJian—gang (1.ShanXjInstituteofAnima1HusbandryandVeterinaryMedicine,TaiyuanO3OO32,China; 2.ShanxiVeterinaryPreventi0nandTreatmentStation,TaiyuanO3OO24,China) Abstract:Inordertoinvestigatetheprevalenceofporcinereproductivefailurecausedbyviruses,1O68patientsamples from14pigfarmsinthevicinityofTaiyuanweredetectedusingmultip1exPCRdiagnosticmethods.Theaverageinfection,rate ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),classica1swinefevervirus(CSFV),porcineparvovirus (PPV),pseudorabiesvirus(PRV)andporcinecircovirustype2(PCV一 2)were32,4O,2O,12,27,respectively. Morethantwovirusesmixedinfecti0nwas39,twovirusinfectionwas24.1572bloodsamplesweredetectedusingRT— PCRkitsforPRRSVRNAandCSFVRNAin11cities0fShanxiprovincefrom66pigfarmsand12lfree-rangepigfarm households.TheresultsshowedthatPRRSVinfectionratewas33.CSFVinfectionratewas46.1593bloodsampleswere detectedtoindentifyimmuneantibodytiterofCSFV,theaveragequalifiedratewas43.9.Itpr0 videsexperimentaldatafor workingoutcomprehensivemeasurestopreventandcontr0ltheepidemicdiseases. Keyw0rds:multip1exPCR;PRRSV;PPV;PRV;PCV一2;CSFV;reproductivefa订ure