RP_HPLC同时快速测定鹿茸中尿嘧啶_次黄嘌呤_尿苷含量

RP_HPLC同时快速测定鹿茸中尿嘧啶_次黄嘌呤_尿苷含量 药 物分析杂志 Ch in J Phar Ana l 2009, 29( 4) m * 575 RP- HPLC同时快速测 定鹿茸中尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷含量 周冉, 李淑芬 ** ( 天津大学化工学 院 绿色合成与转化教育部重点实验室, 天津 300072) 摘要 - 1 目的: 建立反相 高效液相色谱法同时快速测定鹿茸药材中尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷 3种 生物碱基 成分含量。方 法: R P 4 6 mm, 5 m ) , 流动相为含 0 07 醋酸的 3% 甲醇溶液, 流速 1 0 mL % 。结果: 在上述色谱条件下, 尿 嘧啶、 次黄嘌 呤和尿苷 能够得到很 好 的分离; 浓度 均在 1 7 HPLC外标法。采用 A g ilent TC C 18 色谱柱 ( 250 mm m in , 检测波长 254 nm, 柱温 25 ~ 33 3 m g 为 9 375 18 75, 75 , L- 1的范围内 与其峰面积线性关系良好, 相关系数分别为 0 9995, 0 9999, 0 9996; 最低检测限 浓 度 ( S /N = 3)分别 g L- 1 ; 平均加样回收率 ( n= 3)在 98 4% ~ 103 4% 范 围内。结 论: 本 方法分 离度好, 简便 快速, 重复性 好, 可用于鹿茸药材中尿嘧啶、 次 黄嘌呤、 尿苷 3种生物碱基成分的同时快速测定, 具有很高的实用价值。 关键词: 鹿茸; 生物碱基; 尿嘧啶; 次黄嘌 呤; 尿苷; 反相高效液相色谱法 中图分类号: R : A 文章编号: 0254- 1793( 2009) 04- 0575- 04 RP- HPLC si 917 文献标识码 ultaneous deter ination of m m * three biological base in antler velvet ZHOU R an, L I Shu- fen ** ( K ey Lab oratory for G reen C hem ical Techno log ies of th eM inistry of E du cation Schoo l of C hem ical Engineering and T echnology, , T ian jin U n ivers ity, T ian jin 300072, Ch ina) Abstract Ob jective T o estab lish anH PLC m ethod for si ultaneous and rapid deter inat io n o f th ree m a in b iolog i : m m ca l base components in clud ing urac i, hypoxanthine and uridin e in antler ve lv e. M ethod s An external standard l t : m ethod w ith Ag ilen t TC C18 column( 250 mm 4 6 mm, 5 m ) w as adopted w ith the m ob ile phase w as consisted o f m in ; T he detection - 1 3 m eth ano l- w ater so lu t ion con taining 0 07% acet ic ac id at the flow rate o f 1 0 mL % w ave leng th w as 254 nm and the co lum n w as 25 . R esu lts U raci, hypoxanth in e and urid in e w ere w ell separated : l by th is m ethod L in earities o f uraci,l hypoxanth in e and uridine w ere good( r= 0 9995 0 9999 0 9996) in the range . , , of 1 7- 33 3 m g L . T he detect io n li its( S /N = 3) w ere 9 375 18 75 and 75 m , - 1 g L - 1 for urac i, hypoxan l th in e and uridine respectiv e ly. T he average recoveries of th e three bio lo g ica l base com ponents w ere found in the , range of 98 4 - 103 4 . Conc lu sion The m ethod is not on ly si ple rapid and presents good reso lu t ion and re % % : m , produc ib ility but also show s a h ig h ut ility va lu e w hich has been successfully app lied to the si u ltaneous deter in a , , m m t io n of urac i,l hypoxanth in e and uridin e in ant le r velve. t K ey w ord s anter ve lv e; bio lo g ica l base urac i; hypoxanthine urid in e RP - H PLC : t ; l ; ; 鹿 茸始载于 神农 本草经 , 是传 统的名贵中 药, 来源于脊椎动物门哺乳纲鹿科动物梅花鹿或马 鹿的雄鹿 未 骨化 密生茸 毛的 幼角, 前 者称花 鹿茸 ( 黄毛茸 ), 后者习称马鹿茸 ( 青毛 茸 ) 。鹿茸味甘咸 而性温, 为大补肝肾、 峻补元阳之品, 且能固精气、 益 精髓、 强筋健骨, 故对肾阳不足、 精血亏虚所致的各 种症候皆有佳效。鹿茸中主要含有 脂类、 多糖、 多 * ** 天津市应用基础研究计划项目 ( 06Y FJ JC10500 ) M 通讯 作者 Te: ( 022) 27402720 E - ma i:l sh fl@ t ju edu cn l ; i . . 胺、 蛋白质及多肽、 激素样物质、 生物碱基等多种化 学成分。其中生物碱基是我们主要研究的抗衰老 成 分之 一, 主要包 括尿嘧 啶, 次黄嘌 呤, 尿苷 等 据报道 [ 3, 4] [ 1, 2] 。 , 这些成分对单胺氧化酶 ( MAO ) 均具有 不同程度的抑制作用, 这也是鹿 茸具有抗衰老作用 的关键。 576 药 物分析杂志 Ch in J Phar Ana l 2009, 29( 4) m 国内外有采用 H PLC 对生物碱基分离的报道。 例如, 国内有对尿嘧啶、 次黄嘌呤和尿苷 1种或 2种 碱基 成 分的 含 量 测 定 [ 5 ~ 8] 由吉林修正药业有限公司提供。 2批鹿茸均为头茬 茸, 均经吉林修正药业有限公司鉴定为梅花鹿 C er vus nipp on T emm in ck 。 2 实验方法与结果 2 1 色谱分析条件及系统适应性 TC C18 ( 250 mm - 1 ; 另 外, 李 伟 等 [ 9] 运用 H PLC法测定了地龙中次黄嘌 呤、 黄嘌呤、 尿嘧啶、 尿苷的含量, 虽然混合对照品的分离效果较好, 但是 样品谱图中次黄嘌呤和尿苷却不能实现基线分离, 而且由于提取液成分复杂, 使得尿嘧啶成分和杂质 峰间造成干扰; 罗兰等 进行了五灵脂 中 4种核 苷、 碱基类成分的 H PLC法分析研究, 但是色谱图中 次黄嘌呤、 尿苷、 黄嘌呤并没有达到基线分离; 刘丽 芳等 [ 11 ] [ 10] 色谱柱: Ag ilent m ) ; 流 动 相: 含 4 6 mm, 5 0 07 冰 醋 酸 的 3 甲醇 溶 液; 流 速: 1 0 m L % % m in ; 检测 波 长 254 nm; 柱温: 室 温; 进 样 量: 20 L。在本色谱条件下尿嘧 啶、 次黄嘌呤、 尿苷的保 留时间分别为 6 06 9 71, 10 84 m in; 理论板数以次 , 黄嘌呤计不低于 9807 尿嘧啶、 , 次黄嘌呤、 尿苷与相 邻未知色谱峰的分离度不小于 3 0 。 2 2 溶液制备 2 2 1 供试品溶液 称取干燥的鹿茸细粉 ( 过 160 目筛 ) 约 1 g, 精密称定后, 置 50 m L 具塞锥形瓶中, 加 50 乙醇 10 mL 振荡提取 45 m in 后, 离心 10 m in % ( 12000 r m in -1 运 用 岛津 Shi - pack CLC - ODS 柱, 以 m - 1 0 05 m o l L 磷酸氢二铵溶液为流动相 种 动物药中尿嘧啶、 黄嘌呤、 次黄嘌呤和脲苷 4种碱基 成分, 但是由于分离 10 杂质的干扰和黄嘌呤成分的干扰, 使 得尿嘧啶和黄嘌呤, 次黄嘌呤和杂质峰之间并不能 实现基线分离, 从而会对定量的准确性产生较大的 影响。国外对尿嘧啶、 次黄嘌呤和尿苷这 3 种成分 的分离主要有 F an等 [ 12] ), 残渣再同法处理 3次, 合并 4次 采 H PLC- 二极管阵列检测 离心液, 置于 50 mL 量瓶中, 用 50 乙醇定容, 再用 % 0 45 m 滤膜过滤, 即得。 2 2 2 混合对照品储备液 分别精密称取对照品 器结合梯度洗脱法对冬虫夏草中核酸水解后的嘌呤 [ 13] 碱和嘧啶碱进行分离, Gao 等 运用 H PLC - DAD - M S结合梯度洗脱法进行灵芝中核苷和碱基的定 量分析, 但这些方法复杂, 设备成本高, 而且梯度洗 脱对设备要求较高, 操作复杂。另外, 对于鹿茸中生 物碱基成分分析 的 H PLC 法仅仅限于梁志敏等 对单一碱基成分次黄嘌呤的分析和杨秀伟等 [ 14] [ 15] 尿嘧啶、 次黄嘌呤和尿苷各 17 mg, 分别置于 10 mL 量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 然后各精密量取 1 mL, 置于同一 10 mL 量瓶中, 加水至刻度, 即得。 2 3 线性关系 与最 低检测 限的 考察 精密量 取 2 2 2 项下混合对照品储备液 0 1 0 2 0 4 0 6 , , , , 0 8 1 0 2 0 mL, 分别置于 10 mL 量瓶中, 加水至刻 , , 度, 摇匀, 即得不同浓度的系列混合对照品溶液。分 别进样 20 L, 色谱图见图 1- A。以对照品浓度对 峰面积作图。结果经回归分析, 尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷回归方程分别为: Y= 1 Y= 2 10 X + 783 3 r = 0 9995 10 X - 5 435 10 6 7 3 7 运 用正相氨基柱以缓冲盐做流动相对上述 3种生物碱 基进行分离的报道。而同时测定鹿茸药材中上述 3 种生物碱基成分的 RP - HPLC 方法学研究, 未见文 献报道。本文采用 RP - H PLC 方法, 能成功地对鹿 茸生物碱基成分中的极性较为相近的尿嘧啶、 次黄嘌 呤以及尿苷同时进行定量分析, 并达到满意的分离 度。此方法的优点在于方法操作简单、 快速, 对设备 要求低, 既排除了样品中其他杂质的干扰, 又避免了 大量缓冲盐溶液的介入而对色谱柱寿命的 影响, 从而 为鹿茸中抗衰老成分的分析提供了可靠的方法。 1 仪器与试药 1 1 仪器 L abA lliance series 高效液相色谱泵, L abA lliance M odel 500紫外检测器, Anstar色谱工作 站, 北京赛德利斯有限公司 BP210S电子天平。 1 2 试药 对照品尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷 ( S igm a, 纯度均 > 99 ) ; 甲醇 (色谱纯 ) 、 % 乙醇 ( 分析纯 ) 、 冰 醋酸 (分析纯 )均购于天津大学科威公司。 1 3 鹿茸药材 鹿茸样品为 2个不同批次, 第 1批 由天津市神草医药动物养殖有限公司提供, 第 2批 r= 0 9999 Y = 7 10 X - 642 7 r = 0 9996 3种生物罨?成分进样浓度均在 1 7~ 33 3 mg L 范围内呈良好的线性关系。以信噪比为 3确定 本方法中尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷 3种生物碱基成分 的最低检测限分别为 9 375 18 75 75 g L 。 , , 2 4 精密度试验 在上述色谱条件下, 精密量取混 合对照品溶液 20 L, 连续进样 5次, 以峰面积计算 尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷 RSD ( n = 5) 分别为 1 3 , % 1 4 , 1 6 。 % % 2 5 重复性试验 取鹿茸样品细粉 1 g 精密称定, , 按 2 2 1 项下方法制成供试品溶液, 平行 5份, 各 取 20 L 进样测定。结果尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷含 - 1 - 1 药 物分析杂志 Ch in J Phar Ana l 2009, 29( 4) m 577 2 8 样品含量的测定 取 2个批次的鹿茸药材细 粉 ( 160目 ), 按 2 2 1 项下方法制成供试品溶液, 进 样测定峰面 积 ( n = 3), 由线性方 程计算得 尿嘧 啶、 次黄嘌呤和尿苷的含量, 见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 2 。结果表明第 2 批鹿茸药材中尿嘧啶、 次黄嘌呤 2 种成分的含量明 显低于 第 1批鹿茸药材, 而尿苷的含量则 2批相差 不大。 表 2 不同批次鹿茸药材中 3 种生物碱基 成分的含量 ( m g g- 1, n = 3) Tab 2 Conten ts of three b iological base in an tler ve lvet sam p le s for d ifferent batches 样品 尿嘧啶 ( urac il) 0 4055 0 2911 次黄嘌呤 ( hypoxanthine) 0 5049 0 3010 尿苷 ( uridine) 0 4818 0 5474 图 1 鹿茸 生物碱基对照品 ( A )和第 1批样品 ( B ) 色谱图 Fig 1 HPLC ch rom atogram s of referen ce sub stance of b iological bases in an tler velvet( A ) and f irst b atch sam p le ( B ) 1 尿嘧啶 ( u racil) . 2 次黄嘌呤 ( hypoxanth ine) . 3 尿苷 ( u rid ine) . ( sam ple) 第 1批 ( No 1) 第 2批 ( No 2) 量平均值 ( n= 5) 分别为 0 3981 0 4983 0 4812 mg , , - 1 g ; RSD 分别为 1 4 , 1 1 , 1 9 。 % % % 2 6 稳定性试验 取鹿茸样品 细粉 1 g, 精密称定, 按 2 2 1 项下方法制成供试品溶液, 每隔 2 h取 20 L进样, 以 峰面积计算尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷 RSD ( n= 7)分别为 1 3 , 1 1 , 2 0 , 测得峰面 积变化 % % % 趋势不明显, 说明供试品溶液在 12 h内稳定。 2 7 加样回收率试验 - 1 3 讨论 3 1 样品提取条件的选择 为了尽可能取已知尿嘧啶、 次黄嘌呤、 地完全提 取药材中的目标成分, 分别考察了 6种浓 度 ( 0 , % 20 , 50 , 70 , 85 , 100 ) 的乙醇溶液以及 4种 % % % % % 提取方法 ( 超声提取、 热回流提取、 振荡提取、 索氏 提取 ) , 结果表明以 50 乙醇振荡提取的提取率最 % 高。在此基础上, 又对 提取溶剂用量、 提取时间和提 取次数分别进行了考察, 结果表明采用 10倍量的溶 次, 每次 45 m in 便可将目标成分基本提取 , 完全; 再增加溶剂用量和提剂提取 4 取次数, 提取率均不再变 化。故最终确定用 10倍量的 50 乙醇溶液振荡提 % 取 4次, 每次 45 m in 为最适宜的提取方法。 3 2 流动相的选择 比较了不同比例甲醇 - 水、 加 入一定缓冲盐的甲醇 - 水、 加入不同比例醋酸的甲 醇 - 水流动相系统, 结果表明在甲醇 - 水比例为 3 97的系统中, 色谱峰的峰形较好, 基线平稳, 但是 尿苷成分出峰太快, 次黄嘌呤与尿苷不能得到很好 的分离; 只有在加入 0 07% 的 醋酸后的系统中, 不 仅峰形得到改善, 而且实现了 3种生物碱基成分基 尿苷含 量分别为 0 4050 0 5049 0 4818 m g g 的 , , 鹿茸药材 0 5 g 共 9份, 平均分为 3组, 每组分别加 入 尿 嘧 啶、 黄 嘌 呤、 苷 浓 度 分 别 为 0 405 次 尿 , 0 505 0 481 m g mL 的对照品混合溶液 0 4 0 5 , , mL, 0 6 mL, 按 2 2 1 项下方法制成所需 溶液, 进 样测定, 计算尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷的测得值和平 均回收率见表 1 。 结果表明, 各浓度下加样回收率 的稳定性均较好, 该测定方法测定结果较准确。 表 1 3种 生物碱基成分回收率试验结果 ( n = 3) Tab 1 R esults of recovery experim en ts for th ree b io logical base 组分 ( com ponent) 尿嘧啶 ( uracil) 次黄嘌呤 ( hypoxanthine) 尿苷 ( urid ine) 样品中含量 ( content o f sam ple) /m g 0 2025 0 2025 0 2025 0 2525 0 2525 0 2525 0 2409 0 2409 0 2409 加入对照品量 ( add ition am ount of reference substance ) /m g 0 1620 0 2025 0 2430 0 2020 0 2525 0 3029 0 1927 0 2409 0 2891 平均回收率 ( av erage recovery ) / % 100 4 102 4 98 6 98 9 98 4 100 5 103 4 102 9 100 4 RSD /% 2 4 1 5 2 4 0 6 1 3 1 4 3 4 4 3 1 5 - 1 线较好的分离, 故选用含 0 07 醋酸的 3 甲醇溶 % % 液系统为流动相。在此条件下, 尿嘧啶、 次黄嘌呤、 与 尿苷均得到了较好的分离 ( 见图 1) 。 3 3 - 1 流 动相 流速 的 选择 在 流 速小 于 1 mL m in , 检测波长为 254 nm, 柱温为室温的 条件下, 尿嘧啶、 次黄嘌呤、 尿苷 3种生物碱基成分不仅出峰 时间晚, 而且次黄嘌呤和尿苷不能得到分离。而在 选择流动相流速为 1 mL m in 时, 3种成分能够在 14 m in 内快速同时得到分离。因此选择流动相的适 - 1 578 -1 药 物分析杂志 Ch in J Phar Ana l 2009, 29( 4) m 3 WAN G Ben - x iang( 王本 祥 ) , CHEN X iao- guang( 陈晓 光 ) . 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