【doc】在线血液透析滤过液中细菌内毒素定量法研究

【doc】在线血液透析滤过液中细菌内毒素定量法研究 在线血液透析滤过液中细菌内毒素定量法 研究 ?242?南方医科大学(JSouthMedUniv)2006;26(2) 在线血液透析滤过液中细菌内毒素定量法研究 劳海燕,林秋晓,杨敏,梁馨苓,史伟,李慧,冯聚锦(广东省人民医院药学部,广东广州510080; 广东药学院,广东广州510240;湛江安度斯生物有限公司,广东湛江524000) 摘要:目的应用动态比浊法鲎实验定量测定血液透析滤过液中的细菌内毒素含量.方法对血液透析滤过液中定量添 加标准内毒素进行干扰预试验,将血液透析滤过液原液及稀释成5,l0,20倍液,定量添加标准内毒素,其回收率分别为 58.17%,106.7%,99.00%和98.79%;从中筛选出最佳的稀释倍数为l0倍,进行3个批号血液透析滤过液(040408, 0405ll,040527)正式干扰试验,血液透析滤过液中定量添加标准内毒素,其回收率分别为76.32%,99.00%和96.24%. 结果标准内毒素使用1.00,0.125,0.0l56Eu/ml,将血液透析滤过液稀释成l0倍,滤过液中定量添加标准内毒素,回收 率均为50%~200%,认为血液透析滤过液对试验无干扰作用,可用于样品检查.结论动态比浊法可以测定血液透析滤 过液的细菌内毒素含量. 关键词:动态比浊法鲎试验:血液透析滤过液:细菌内毒素;干扰试验 中图分类号:R927.12:R459.5文献标识码:A文章编号:l673-4254(2006)02.0242.03 Kineticturbidimetriclimulusassayofbacterialendotoxininthereplacementsolutionof on.1inehemodiafiltration LAOHai?yan,LINQiu?xiao',YANGMin,LIANGXin-ling,SHIWei',LIHui,FENGJu-jin DepartmentofPharmacy,People'SHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510080,C hina;2GuangdongCollegeofPharmacy, Guangzhou510240,China;3ZhanjiangA&CBiologicalLtd.,Zhanjiang524000,China Abstract:0bjeetiveTodeterminebacterialendotoxininthereplacementsolutionofon.1inehemodiafiltration(on-lineHDF) usingkineticturbidimetriclimulustest.MethodsandResultsValidationtestwasperformedwiththereplacementsolutionof on.1ineHDFinwhichquantifiedstand~dendotoxinwasadded.Therecoveryratesofendotoxinfromthereplacementsolu. tionanditsdilutionsat1/5,1/10,andl,20were58.17%,106.7%,99.00%and98.79%,respectively,suggestingthattheopti- maldilutionwasatl/10.Standardendotoxinwasaddedintothereplacementsolutionofon-1ineHDFof3batches(040408. 0405ll,040527),andtherecoveryratesintheirdilutionatl/l0were76.32%,99.00%and96_24%.respectively.Thestandard endotoxinintheworkingcurvewas1.00,0.125,and0.0l56Eu/ml(endotoxinunit/m1),andthedilutionatl/10ofthereplace. mentsolutioniSeffectivetoeliminatetheinterferenceinlimulustest.ConclusionKineticturbidimetriclimulustestprovidea meanstodetectendotoxininthereplacementsolutionofon-lineHDF. Keywords:kineticturbidimetriclimulustest;replacementsolution;on.1inehemodiafiltration;bacterialendotoxin:inhibition enhancement 血液透析滤过液是新型在线血液透析的置换液, 是在血液透析滤过治疗中从透析液中获得,经过双重 过滤,直接输入患者体内….血液透析滤过液接触的 半透膜是高透量膜,这种膜有较大的洞.以及较高的 水分超过滤率,厚度为10,20Ixm.膜上的孔径平均为 3nnl,所以只允许相对分子质量为15000以下的小 分子和部分中分子物质通过.而相对分子质量大于 35000的大分子物质不能通过.蛋白质,致热原,病 毒,细菌及血细胞等都是不可透出的.但内毒素分解 体的相对分子质量仅为2000,20000,因此,透析液 收稿日期:2005.07.19 基金项目:广东省科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2003c33704) SupportedbyScienceandTechnologyResearchProgramofGuangdong Province(2003C33704) 作者简介:劳海燕,昌0主任药师,硕士研究生导师.主要从事临床药学 研究,E-mail:laohaiyan1208@vip.sina.corn 中的G'小分子热源物质有可能通过正常的透析膜. 对长期需要接受透析治疗的患者更为容易出现高水 平的内毒素,而高水平的内毒素可致热原反应,慢性 炎症[21,故需严格控制透析液中的内毒素含量.在线 血液透析滤过治疗是大量的置换液(>30L)在机器生 成后缓慢注入体循环,因此血液透析滤过液中内毒素 的监测尤其重要.动态比浊法鲎试验是优良的内毒素 定量检测技术,本试验利用该法对血液透析滤过液中 内毒素进行监控,减少热原反应的发生,是降低血液 透析滤过治疗后炎症反应低发生的保证. 1试验材料和仪器 细菌内毒素检查用水(0401130,50ml/瓶,湛江 安度斯生物有限公司);动态比浊法鲎试剂(0310310, h=0.03Eu/ml,1.25mY瓶,湛江安度斯生物有限公 司);细菌内毒素国家参考标准品(2003—10,200Eu/ 第2期劳海燕,等.在线血液透析滤过液中细菌内毒素定量法研究?243? 瓶.中国药品生物制品检定所);血液透析滤过液 (040408,04051l,040527,广东省人民医院血液净化 中心);EDS.99细菌内毒素检测仪(北京金山川科技 发展有限公司);所用玻璃仪器皿经250?至少2h 除去外源性内毒素. 2方法与结果 2.1方法 本试验按"供试品干扰试验"方法:]进行,各试验 参数如下:血液透析液内毒素限值L=0.5Eu/mlE引,最 大有效稀释倍数(MaximumValidDilution,MVD) = L/h.动态比浊法鲎试验:入为标准曲线最低浓度,本试验中h=0.0156Eu/ml,MVD=32. 2.2结果 2.2.1标准曲线制作及可靠性用细菌内毒素检查 用水稀释细菌内毒素国家参考标准品.使其细菌内毒 素最终浓度分别为1.O0,0.125,0.0156Eu/ml,各取 0.100m1分别加到预先加有0.100ml鲎试剂反应管 内,混合均匀,插入EDS.99细菌内毒素检测仪内进 行检测.其中每一浓度重复2管,并同时作阴性对照 2管. 2.2.2干扰试验 2-2.2.1干扰预试验血液透析滤过液最大稀释倍数 为32.将血液透析滤过液稀释5,lO,2O倍,每个稀释 倍数的样品分别取0.100ml及0.100ml鲎试剂作样 品的阴性对照管检查(NPC);取0.100rnl的高一倍浓 度样品(如样品稀释l0倍时,需加入稀释5倍的样品 0.100m1)加0.100ml鲎试剂再加入0.100ml0.25 Eu/ml的强化内毒素作为样品的阳性对照(PPC),而 原液的PPC则是取0.100ml样品加0.100ml鲎试剂 再加入lOl1.25Eu/ml的强化内毒素而制成.PPC 中强化的内毒素浓度0.125Eu/ml,在标准曲线的中点 浓度.将溶液分别平行2组,插入EDS.99细菌内毒 素检测仪内进行检测.另外还按标准曲线制作方法制 备标准曲线及阴性对照(NC).回收率%:(PPC实测 值.NPC实测值)/强化内毒素浓度X100%[-4].其标准 曲线为:LgT=2.78363.0.38551LgC,其相关系数IrI = 0.99049>0.98,反应时间在647,3282S,而阴性对照 管反应时间>3600S,故标准曲线成立.动态比浊法干 扰试验,是以样品的添加内毒素平均回收率来判断, 若回收率在5O%,200%范围内, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明样品溶液对鲎试 剂反应无干扰影响….结果(表1)可见,血液透析滤过 液原液及稀释倍数在2O以内时,其干扰试验添加内 毒素的回收率均在有效范围50%,200%之间l3'.表 明血液透析滤过液的稀释倍数在20以内无干扰 2.2.2.2干扰试验由于稀释倍数为1O时.其回收率 表1干扰预试验 Tab.1Pre?interferenceexperiments Dillltion contentttmeconcen E t 耐 rat ? ion裟l~u/…m1)re印cover.yIs){t,0),0) NPC:Negativeproductcontrol;PPC:Positiveproductcontrol CV:Coefficientofvariation 最为接近100%,故在日常检查中选用稀释lO倍.为 确证血液透析滤过液稀释lO倍的有效性,进行3个 批号血液透析滤过液(040318,040408,0405l1)正式 干扰试验.以血液透析滤过液稀释10倍样品检查,其 他具体操作参照预试验.将溶液分别平行2组.插入 EDS.99细菌内毒素检测仪内进行检测:样品040408 的其标准曲线为:LogT=2.78172.0.33794LogC,其相关 系数lrl=O.99543>0.98,反应时间在616,2589S,而 阴性对照管反应时间>3600S,故标准曲线成立:样品 0405ll的标准曲线为:Lo=2.78363.0.38551LogC, , 其相关系数IrI:0.99049>0.98,反应时间在6473282S,而阴性对照管反应时间>3600S,故标准曲线 成立;样品040527的标准曲线为:LogT=2.80082. 0.34366Lo?gC,其相关系数IrI=0.99023>0.98,反应 时间在665,2837S.而阴性对照管反应时间>3600S, 故标准曲线成立.结果(表2)可见,3个批号血液透析 滤过液稀释lO倍,其干扰试验添加内毒素回收率均在 有效范围5O%,200%之间,对鲎试验没有干扰作用. 2.2-3定量检测根据干扰试验结果,对3个批号血 透析液稀释lO倍溶液进行定量检测,结果见表3. 3讨论 血液透析滤过液是透析液经过双重滤过器所得, 所含内毒素含量比透析液低很多:血液透析滤过液能 直接进入人体,而透析液则不能;而且患者对血液透 析滤过治疗效果和耐受性显着优于血液透析,透析并 发症和不适证发生率显着低于血液透析.血液透析滤 ,D2.微球蛋白水 过治疗后血清肌酐清除率,尿素氮 平显着降低,KT/V明显增高. 在操作时应该先吸取供试品,然后加入阴性对照 ? 244?南方医科大学(JSouthMedUniv)第26卷 (上接241页) [1]李双凌,王东信,吴新民.开胸术后罗哌卡因.芬太尼硬膜外的镇 痛效应及对肺功能的影响[J].中华麻醉学杂志,2002,22(8): 505.6. 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