定量PCR中RON乍用
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曲线实验的标准偏差(SD),将其与1uI反应混合液被ddH20取代的实孩滸w热痰军隔宀上曲一确保您获得均一的定量PCR实验结果。某些不含有Rox?均一化参比染料，或是无法在整个实验过程中使用参比染料的定:.——JrJrJr量PCR平台，常常试图，在定量带来以下多方面好处:5AWithRC'X贬低使用参比染料的价值。PCR反应过程中Rox?染料是一种非常有价值的工具，能?校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发X.?为故障
分析
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提供一项强有力的诊断工具:/冷凝而导致的信号改变;每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响;Ct值。?均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异;SBWiikAik<美国应用生物系统公司(Apstems)?均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复认识到均一化工具(Rox?参比染料)的好处，并在所有AB定，所有AB生产的Real-TiPCR仪上优化，以便实验人员充分利用Rox?参比染料所带来的好处。此外mePCRMasterMix试剂液都预掺入最合适量的Rox?参比染料，从而确保每次实验每个反应都获得最好的结果。ox?校正单次反应运行中的信号改变在理想反应条件下，
报告
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荧光染料的信号值起始于基线，当反应体系中存在合适的靶分子时，报告荧光染團5：重复RNAseP标准品，及模拟移液错误样本(T对反应混合液被ddH2O取代h绘制扩增曲线-数料会随着PCR反应的进行，产生岀一条典型的扩增曲线，仪器软件通过扩增曲线计算结果。如果扩增曲据分析时分别使用Rox™(5A)和不用Rox™(5B),证明Rojc™可以楼正由轻徹起始样本浓度或反应体积错溟线只是简单地根据报告染料的荧光信号而绘制，将会难以区分样品的真实差异和随机反应条件带来的人为而造成的差异，差异。现实中，有许多事件可能影响报告荧光染料的表现：泡沫会形成荧光信号尖峰；蒸发或冷凝会造成反应体系浓度改变，导致不同反应批次间荧光信号值增强或减弱(见图1)。这类事件会同时影响报告荧光染料和Rox?参比染料，所以使用AB的定量试剂与仪器时，根据Rn值绘制扩增曲线，采集的是报告荧光染料减去Rox?参比染料的荧光差值，任何潜在的人为误差因素都被均一化，从而排除在最终结果之外。上结果再次证明了使用Rox™#比染料分析Real-TimePCR实验数据时的优势。图1:多组分图显示Rox?信号和报告染料信号一同抬起，结果指示存在蒸发Rox?提供强大的故障分析工具Rox?参比染料作为故障分析工具的价值同样不应被低估。如果一个反应失败了，依靠Rox?参比染料确保在反应过程中有持续不变的信号标准十分重要。Rox?信号可以提供反应设置的信息提示：无Rox?信号，很明确地表明没有放置MasterMix试剂；异常大的信号值强度差异，提示可能放置了2倍反应体系；Rox?信号不规则变化，提示可能存在仪器故障。AB公司的技术支持在故障排除工作中总会使用Rox?参比染料，以帮助在更短时间内获得更多信息量的
检测
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结果。Rox?均一化反应体积差异以下实验数据证明了Rox?参比染料在校正移液误差所导致的反应间均方差上的价值，同时也证明AB定量PCR仪器在使用或不使用Rox?参比染料都能获得很好的性能表现和精确性。实验一：获得高精确性不一定需要Rox?从ABRNasePInstrumentverificationPlate中取出反应混合液，分别移液入对应的Fast96孔板中。在AB7500FastReal-TimePCR仪上运行这块板。数据分析分别采用2组模式，一组为正常的减去Rox?参比染料，另一组将参比染料设置成“None”，从而显示使用Rox?信号均一化处理数据的价值。技术重复（24次重复）的结果显示，使用Rox?和不使用Rox?都得到了很好的结果。使用Rox?一组的Ct值SD（标准偏差）0.042，不使用Rox?一组的Ct值SD（标准偏差）0.108（见图2）。图2:技术重复的扩增曲线，分别采用Rox?校正（2A）和不采用Rox?校正（2B），显示重复的结果聚合紧密,散布很小。实验二：Rox?均一化处理校正移液错误通过系统地减少从RNasePPlate中移出的样品，加入分子纯级水补齐体系，来模拟移液错误对运行精确性的影响。图2描绘了实验一中的原体积样本，以及3个移液错误重复：分别含0.5,1.0和1.5卩lofddH20（样本体积相应减少）。数据分析时使用Rox?参比染料校正初始浓度差异（由移液错误导致的），得到的Ct值SD（标准偏差）为0.075;而不使用Rox?参比染料校正的Ct值SD（标准偏差）为0.174（见图3）。图3:技术重复与3重模拟样本移液错误份别用0.5,1.0和1.5卩lddH2O替代等量样本模板）的扩增曲线。使用Rox?可以校正起样本始体积（或浓度）的轻微差异（3A），而不使用Rox?时可以明显看到轻微的散布（3B）。实验三：Rox?均一化处理确保定量反应精确性相似地，直接从RNAsePPIate中移出反应混合液进行重复实验绘制标准曲线，比较使用Rox?和不使用Rox?分析时的精确性差异(见图4)，结果R2值分别是0.997和0.99。图4：重复RNAseP标准品的扩增曲线，数据分析时分别用Rox?(4A)和不用Rox?(4B)，结果表现都很好。当反应体系中部分样品被1卩lddH20替代，Rox?均一化处理能够校正此类小错误，而当分析不包含Rox?参比染料校正时，各个标准组中很明显地出现了更大的点散布(见图5和表1)。CopyNumberCtSDACrSD'*ROX1W-ROXir/Standards12502500500010000200000.D8500.10250J2M015410.03720.11550.09350.0544Q01530.1215001750.0242007030039201062Staridards+1.0pl12502500500010000200000.07680.242001020019010.1345032B50.1279亠+3800749曲血01652O.OSB1a1940二為
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