猪精液冷冻技术

猪精液冷冻技术 猪精液冷冻技术 广东畜牧兽医科技2010年(第35卷)第4期畜牧技术?21? 猪精液冷冻技术 李志鹏,陈兴宏,张静 (广东宝兴农牧科技有限公司,广东兴宁514571) 中图分类号:S814.3文献标识码:A文章编号:1005—8567(2010)04—0021—03 精液冷冻保存技术(Semenfreezing)是将精 液特殊处理后,通过液氮(-196?),干冰(-79?) 或其它冷源冷冻,超低温保存,使精液达到长期保 存.精液冷冻保存技术的主要原理是精子在冷冻 状态下,代谢几乎停止,生命保持相对静止状态, 升温后又能复苏而不失去受精能力. 精液冷冻保存技术解决了精液难以长期保存 的问题,其优点为:?使精液不受时间,地域和种 畜生命限制,便于开展省际,国际间运输和品种交 流,极大地提高优良公畜利用率,加速品种育成和 改良;?引进国外高性能公猪冻精取代引进活体 公猪,可节省外汇支出;?对优良种畜在短期进行 后裔测定,保留和恢复某一品种或个体优良遗传 特性;?冷冻精液通过后裔测定或疾病检测,保障 保护 遗传进展的稳定和生物安全;?建立基因库,地方品种和珍稀濒危品种资源.因此具有重要的 应用潜力和广阔的应用前景[]. 1猪精液冷冻保存技术研究简况 Ivanov在1926—1927年首次尝试进行猪冷冻 精液保存技术研究及冻精人工授精,之后,Milo— vanov等在1930—1936年进行同样试验,并最早成 功地配制了猪精液冷冻的稀释液(葡萄糖一硫酸盐 和葡萄糖,酒石酸盐).早期的猪精液冷冻试验结 果表明,冷冻后的精液中,只有一部分精子能够存 活,并且冷冻保存比液态保存对猪精子的损伤更严 重,因为温度下降对猪精子质膜,超微结构和生化 组成造成损伤.1949年,甘油对精子的抗冻保护作 用被发现,推动了猪精液冷冻保存技术发展.1956 年,Polge[31首次报道成功得到冻精人工授精出生 的仔猪.1975年,Pursel发明简便的猪精液冷冻 和解冻方法,并在同年报道通过对23头青年母猪 进行颗粒状冷冻精液解冻后人工授精,1l头于配 种后48h后剖检,配种受胎率为45.45%,另外12 头于配种后25,30d后剖检,配种受胎率为 收稿日期:2010—03—16 83.33%.但由于受胎率和产仔数都明显低于本交, 直到2000年,全世界冻精的应用估计还不到猪人 工授精总量的1%[5].从外国进口的冷冻精液大多用 于扩大本国猪品种的遗传资源和进行杂交改良同. 虽然猪精液冷冻保存技术发展缓慢,但国内外 有关专家始终在不懈探索.随着各种新的检测手段 的建立,可检测到精子细胞质膜化学组成变化,通 透性改变,表面基因的不同以及各种冷冻损伤,为 分析各种因素的影响提供了更确凿的科学依据. 2002年,Thurston等m分析了质膜表面基因限制性 片段多态性,发现其中16个片段对冷冻结果影响 较大.从而可看出个体差异对冷冻效果的影响. 2006年,Ricker等[8]用傅氏转换红外光谱仪 QIR)和扫描电镜(SE检测到在低温下质膜膜相 的变化.由于膜相变化,引起了膜通透性改变,活力 下降,信号通路改变,直至引起细胞死亡.Brouwer 等[9]监测和定位了脂质过氧化物的代谢;Fraser 等[10]用改良的中性彗星实验评价DNA的损伤.DNA 的完整对于自然受精和人工授精的受精率,胚胎的 正常发育,胎儿和后代的生长至关重要. 2猪精子冷冻特点和冷冻机理 2.1猪精子冷冻特点猪的精液与其他哺乳动 物存在较大差异,其精液量大,精子对冷休克特别 敏感.影响精子质膜流动性和抗冷休克能力的因 素包括:精子膜上胆固醇和磷脂的比例,烃链的饱 和程度,蛋白质和磷脂的比例等[11].牛精子对冷休 克不敏感而猪精子对冷休克敏感,主要原因:第 一 ,精子膜上磷脂组分,主要调节膜流动性稳态的 磷脂,磷脂酰胆碱在猪精子中的含量低于牛精 /磷脂及胆固醇分布, 子:第二,精子膜上胆固醇 猪精子胆固醇/磷脂较低,胆固醇分布量外膜大 于内膜.内膜对冷休克敏感,降温过程中,膜磷脂 的侧移受到限制,使膜磷脂从液晶相转为凝胶相; 同时,由于膜上磷脂相变温度不同,导致膜成份侧 ? 22?畜牧技术猪精液冷冻技术一李志鹏,等 移和重排,膜表面脂质分离,蛋白质不可逆凝集; 另外,精子膜状态的改变导致游离Caz+从细胞外 流入细胞内,刺激依赖Caz的细胞提前获能(也称 假成熟)『1.此外,受猪精子遗传特点影响,冻精的 体外活力和解冻后受精等能力存在个体差异性. 2.2猪精子冷冻机制冷冻过程是精细胞脱水 过程,此过程中细胞受到化学性和物理性损伤:第 一 ,化学性损伤:冷冻过程中细胞外溶液形成部分 冰晶,使未结冰部分形成高渗溶液,精子内水分向 外渗透,导致精子脱水,淹渍而失去活力;第二,物 理性损伤:冰晶对细胞膜及细胞内部结构产生机 械性损伤,导致细胞死亡.冷冻过程中,细胞内形 成的冰晶的大小和数量影响细胞受损伤程度,微 晶状态的冰晶不会损伤细胞,而对精细胞造成物 理性损伤的大冰晶会导致细胞损伤或死亡『1. 3影响猪冷冻精液因素 3.1稀释液和冷冻保护剂在温度变化过程中, 精液对精子的保护能力是有限的.为此,进行精液 冷冻保存时要配合稀释液.稀释液是精子的营养 剂和保护剂,通常由能量物质(糖类),低温保护剂 (蛋白质,脂蛋白等),防冻保护剂(甘油,二甲基亚 砜等),添加剂(十二烷基硫酸酯等),维持渗透压 物质(柠檬酸钠,Tris等)和抗菌素(青霉素,链霉 素等)组成. (1)糖类和缓冲物质:稀释液中使用的糖类主 要有葡萄糖,果糖,乳糖.胡健宏等n4发现,在传统 Tris一柠檬酸一葡萄糖稀释液基础上添加25%海 藻糖,能显着(P<O.05)改善和提高猪精液的冷冻 效果,解冻后猪精子活力,活率,线粒体活性,质膜 以及顶体完整性分别提高41.38%,46.34%, 44.56%,43.51%和64.09%. (2)卵黄:卵黄中保护精予的有效成分是低密 度脂蛋白(LDL).保护作用机制存在三组假说.一种 假说认为LDL与精子膜结合通过稳定膜而起保护 作用.另一种假说认为LDL中的磷脂通过在精子表 面形成一层保护膜或者替换在冷冻过程中丢失的 膜磷脂保护精子.第三种假想是LDL与精浆中的有 害阳离子肽类竞争结合精子膜而发挥保护作用[15]. (3)甘油:是精液冷冻过程中最重要和最常用 的冷冻保护剂,冷冻过程中,精细胞主要受到冰晶 的物理和化学损伤使精细胞处于脱水状态,导致 细胞死亡,甘油的理化特性使其能减少冰晶对细 胞的损伤.但甘油对精子有毒害作用,所以甘油添 加浓度,添加温度和平衡时间直接影响猪精子冷 冻后的存活率.2006年,姜兴刚等[1圈研究表明添加 2%和4%甘油对猪精子冷冻保护作用显着(P<0.05) 高于添加6%和8%甘油组.1996年,Fiser等?刀对保 存在0.5mL细管中的猪精液用不同甘油浓度 (0,6%)和不同平衡时间进行研究,结果表明:在 5?下平衡4h后进行冷冻,解冻后精子活率和活 动精子的顶体完整率最高. (4)其他添加物质:为了提高猪精液的冷冻效 果,研究者尝试在稀释液中添加各类物质以改善精 子外环境的理化特性,提高冻精解冻后受精率.常 用的添加物有十二烷基硫酸酯及其类似物,2一羟 脯氨酰一一环化糊精,透明质酸,N一乙酰基-D- 葡糖胺,a一维生素等.李青旺等踟在猪精液冷冻 稀释液中添加400mg/L安钠咖,精子冻后活率和 生存指数显着高于对照和添加VC两组(P<O.01). 3-2精液平衡2006年,姜兴刚等[16]研究表明平 衡时间为60min和90min时,精子活力显着[1高 于平衡时间为0,30min和120min组,且60min 组精子活力最高. 3.3冷冻目前,猪精液冷冻的方法基本有两 种,即Beltsville和Westendorf法.前者是将富 含精子的部分采集后与精清持留2h,然后离心, 降温3h后在干冰上制成0.15,0.20mL的颗粒 冻精;后者是将精液按1:2稀释,然后在稀释液中 降温,最后制备成细管冻精.后来研究者根据研究 结果对细管冻精进行了改进,如2mL细管冻精,5 mL塑料袋和5mL大管等剂型. Fiser等n1996年对猪精液的研究中表明甘 油浓度和冷冻速度之间的相互影响非常重要.他 们对冷冻速度从1?/min到1500?/min的范围 对猪精子存活曲线进行了研究,发现降低甘油浓 度可获得较好的冷冻速度.有效的冷冻需达到三 个因素的最佳组合:甘油浓度,冷冻速率和解冻速 率,而这三个因素都与冷冻分装的细管型号有关. 1995,PurselV等[1町研究表明,不同剂型最佳组 合分别为:0.25mL细管采用50?/min,1.5%甘油 浓度;0.5mL细管采用3O?/min,3%甘油浓度;5 mL大型细管采用16?/min,3.3%甘油浓度. 3.4解冻解冻操作程序与冷冻过程是相对应 的,解冻效果受冷冻速率影响.理论上讲,快冻应 该快融,其程度视不同类型细胞而略有差异.精子 的冷冻损伤主要是因冷冻过程中未达到最佳冷冻 猪精液冷冻技术一李志鹏,等畜牧技术?23? 速率引起.以最佳冷冻速率冷冻精子,而后提高解 冻速率可增加解冻后精子活率和顶体完整率. C6rdova—Izquierdo等[删研究5mL细管冷 冻猪精液,两种不同解冻温度42?,50?经40s 解冻后的精子质量.结果表明,42"C解冻后精子活 率显着(P<O.05)低于50?,二者的顶体完整率, 穿卵率,单精入卵率和多精入卵率相似. 3.5冷冻剂型在猪精液冷冻保存研究中,分装 型号有:颗粒,5mL大型细管,5IIlL平管或平胶 袋,4-5mL铝袋等.Wongtawan等]将猪精液分别 用0.5mL细管,2.8mL多聚平管(4个0.7mL平 管组成)冷冻猪精液,解冻后精子活力分别为 0.428,0.443.5mL细管,平管和塑料袋冻精含有 1头份精子数量,可减少精液分装和解冻时间,使 输精操作更简便,省时,因此,值得更深入研究. 3.6保存猪冷冻精液的保存必须使其全部浸 入液氮中,使用过程中为了缩短冷冻精液离开液 氮时间,将液氮罐放在距离解冻设备或水浴锅最 近的位置.冷冻精液暴露于空气中超过5s导致精 液品质下降,因此,整个过程控制在5s内. 4发展前景 细胞生物学及低温生物学 随着分子生物学, 的不断渗透与结合,猪冷冻精液保存技术将日趋 成熟,生产实践中,提高优良公猪利用率,减少疾 病传播,保护地方优良品种和珍稀濒危品种资源, 加快育种进程,提高母猪受胎率和增加产仔数等 方面具有重要意义,因此具有重要的研究价值和 广阔的市场前景. 参考文献: [1]周佳勃,岳奎忠,孙兴参,等.猪精液冷冻技术的研究进展 [J].中国兽医,2002,22(3):295-299. [2]禚艳书,王坚,刘铁铮.猪精液冷冻保存研究进展[J].江苏农 业科学,2006,(3):136-140. 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