ELISA法测酶浓度对测定甲胎蛋白 修正
设计实验： 不同浓度抗AFP-HRP对ELISA实验的影响
-----第二小组 陈静 伍媚 陈晋 颜平 杨薇 杨冬 毛晓雪 张畅玲 【实验原理】
在微孔板上包被纯化的甲胎蛋白抗体（抗AFP），加入待测血清和酶标抗体（抗AFP-HRP），血清中的AFP与微孔板上的抗AFP和不同量抗AFP-HRP结合，洗涤分离后，加入酶底物系统
进行显色反应。
由于我们采用的是一步法，所以酶标AFP抗体的量很重要。酶标抗体会和微孔板上的AFP抗体结合AFP（虽然表位不同），但是不同浓度的酶标AFP抗体会对结果造成不同的影响，
高酶标抗体浓度不仅可能会引起非特异性反应，还可以使显色加深，这对于定量来说是不好
的。低浓度酶标抗体又可能会使灵敏性降低。
【试剂与器材】
试剂：高浓度AFP阳性标本、低浓度AFP阳性标本、抗AFP包被的酶标板、AFP阳性对照、
AFP阴性对照、抗AFP-HRP试剂、浓缩洗涤液、显色液A液、显色液B液、终止液。 器材：加样器、温箱、洗板机、酶标仪。
【测定程序】
? 实剂准备 用前30分将酶标试剂盒从冰箱取出平衡至室温。
? 编号 将对应微孔按需编号，每板应设阴性对照孔2孔、阳性对照孔2孔、空白
对照2孔。其余42个空做高、低两个组AFP浓度，每组AFP浓度里面又做5种不
同浓度的抗AFP-HRP试验（10、30、50、70、90）（具体见后面分布图）。
? 加样 除空白孔外，阴性对照孔各加50微升AFP阴性对照、阳性对照孔各加50
微升AFP阳性对照、高浓度的21个孔各加50微升高浓度AFP标本、低浓度的21
个孔各加50微升低浓度AFP标本。
? 加酶标抗体 除空白孔外，阴性对照孔各加50微升抗AFP-HRP标本，阳性对照
孔各加50微升抗AFP-HRP标本，试验个孔按图示。
? 温育 用封板膜封板后置37度温育30分钟
? 配液 将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水或去离子水20倍稀释。
? 洗涤 小心揭掉封板膜，洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
? 显色 每孔加显色剂A.B各50UL（或各一滴），轻轻振荡混匀，37C避光显色15min.
? 比色测定 每孔加终止液50微升，轻轻振荡混匀，设定酶标仪主波长450纳米，
次波长630纳米双波长检测，测定个孔A值。
【结果判断】：
1阳性判定CO值计算 阳性判定值=阴性对照孔A均值Nc*2.1
2阴性判定 样品A值＜CO值为AFP阴性
3阳性判定 样品A值?CO值为AFP阳性
【结果处理】
根据统计学
方法
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：根据?An/N计算出各个不同抗AFP-HRP浓度的A的平均值，然后以抗AFP-HRP浓度为坐标横轴，平均吸光度A为纵轴。作出随抗AFP-HRP浓度变化的A-C曲线。再根据A-C曲线找出到达最大吸光度的最低抗AFP-HRP浓度。
因为ELISA的最终显色反应，即使酶标抗体浓度变化很小，也可引起试验结果很大的波
动。可以从A-C曲线中得到A值是否受抗AFP-HRP的影响，当到达最适抗AFP-HRP浓度后A值的情况。
【结果预期】
在50左右微升抗AFP-HRP试剂之前，A值随抗AFP-HRP的浓度的增加而增高，然后曲
线逐渐变缓几乎呈水平线。整个曲线呈S型。从此可以得出结论：在未达到最适酶标抗体浓
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度前A值随酶标抗体浓度增加而升高，在到达最适酶标抗体后A值几乎不变。 【质量控制】
未加终止剂前：空白对照孔呈无色、阴性对照孔呈无色、阳性对照孔呈蓝色 加终止剂后：空白对照孔呈无色、阴性对照孔呈无色、阳性对照孔呈黄色 【注意事项】1，血清或血浆包括用EDTA，柠檬酸钠或肝素等抗凝剂采集的血浆均可使用。
采集后尽早进行实验，可在2~8C储存7天。不要使用任何热处理过的样品。 2，不能检测含叠氮钠抑制辣根过氧化物酶的活性。
3，试剂盒从冷藏环境中取出再室温平衡15-30min后方可使用。实验前将液体轻轻振荡混匀，
未用完的微孔条用自封袋密封2-8C保存。
4，封板膜不能重复使用，不同批次酶标板，酶标试剂和阴阳性对照不可混用，不能与其它
厂家试剂混用，试剂在有效期内使用。
5，加样品和液体试剂时必须用加液器加注，并经常校对其准确性。加入不同样品或不同试
剂组分时，应更换加样器吸头，以防止出现交叉污染。
6，酶标板洗涤时各孔需加满洗液，以防止孔口有游离不能洗净。应设定30-60秒的洗液浸泡试剂。在洗板结束后，必须立即进行下一步，不可以使酶标板孔干燥。 7，显色时必须先加显色剂A液后加显色剂B液，以免显色过低。
8，AFP抗原测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。读取结果是，应擦干酶标板底部，且
孔内不能有气泡。不要触碰孔底的外壁，指印或划痕都可能影响A值。 9，所有样品，废液和废弃物都应按传染物处理。
10，终止液为2M硫酸，使用时应注意安全。
【影响因素】
1试剂盒的质量
2待测标本AFP的含量
背景资料
【AFP】：是儿胎发育早期，由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，分子量70KD，电泳是位于白蛋白和ɑ1球蛋白之间，在胎儿13周AFP占血浆蛋白总量的1/3。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平（低于30μmg/L）。胎儿出生后不久即逐渐消失，通常成人血清中AFP的含量极低，参考值＜20ūɡ/l。
AFP含量明显升高见于：?原发性肝癌，68.8％的患者AFP升高，常＞300ūɡ/l，但部分患者AFP始终不升高。近年来大量临床发现，部分肝硬化病人会长期出现AFP达到上千，蛋多年都没有肝癌的迹象；同时发现约20％的晚期肝癌病人，知道病故前，AFP仍不超过10.?病毒性肝炎与肝硬化，患者血清中AFP科有不同程度的增高，但一般在300微升每升以下，岁受损肝细胞的恢复，患者血清AFP的含量尊见下降直至恢复正常；?生殖系统肿瘤和胚胎
性肿瘤，如睾丸瘤，畸胎瘤等；?妊娠，父女妊娠3个月后，血清AFP异常升高，应考虑有胎儿神经管缺损畸形的可能性。
【检测方法】；常见的有：酶联免疫法(ELISA优点：检测AFP快速、简便、实效、成本低廉)，化学发光免疫法(CLIA优点：快速、精确、重现性好、试剂安全无毒、病理高值化学发光明
显优于ELISA)，放射免疫法（RIA）。
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