【doc】 芦丁拮抗血小板活化因子与受体结合的作用

【doc】 芦丁拮抗血小板活化因子与受体结合的作用 芦丁拮抗血小板活化因子与受体结合的作 用 ?390?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月 芦丁拮抗血小板活化因子与受体结合的作用 金呜,臧宝霞,吴伟,陈文梅,朴永哲,李金荣 (北京市心肺血管疾病研究所一首都医科大学附属北京安贞医院药理研究室,北京100029) 摘要:目的观察芦丁对血小板活化因子(PAF)与受体结合的拮抗作用.方法以放射配基结合试验观察 [H]PAF与家兔血小板受体特异性结合的作用;体外以分光光度法测定PAF介导血小板黏附的强度;以Fura一2 荧光分光光度法测定PAF介导的兔多形核白细胞(PMNs)内钙离子浓度的升高.结果芦丁可浓度依赖地抑制 1,2,4nmol/L[3HIPAF与血小板受体的特异性结合,其Ic.分别为7.3,8.7,17.2mmol/L;芦丁可明显抑制 PAF介导的血小板黏附,ICso为1.51mmol/L;芦丁浓度为68.2,546/zmol/L时可浓度依赖地抑制PAF介导的 PMNs内游离钙浓度的升高.结论芦丁具有抗PAF作用,为一种新的PAF受体拮抗剂. 关键词:芦丁;血小板活化因子(PAF);受体结合试验;血小板黏附;多形 核白细胞(PMNs) 中图分类号:R282.71;R286.3文献标识码:A文章编 号:0253—2670(2005)03—0390—03 Inhibitionofrutinonbindingofplateletactivatingfactorandreceptor JINMing,ZANGBao—xia,WUWei,CHENWen—mei,PIAOYong—zhe, LIJin—rong (DepartmentofPharmacology,BeijingInstituteofHeart,LungandBloodVesselDiseases--Beijing AnzhenHospitalofCapitalUniversityofMedicalScience,Beijing100029,China) Abstract:ObjectiveToobservetheplateletactivatingfactor(PAF)一 receptorbindingantagonistic effectofrutin.MethodsThespecificbindingof[.HIPAFtorabbitplateletreceptorwasinvestigatedby radioligandbindingassay(RLBA).PlateletadhesioninducedbyPAFwasmeasuredwithspectropho— tometryinvitro.Rabbitpolymorphonucleocytes(PMNs)innerfreecalciumconcentrationincrementof rabbitinducedbyPAFwasassayedbyFura一 2fluorescenttechnique.ResultsThespecificbindinginhibi— tionofrutinwasfoundtobeconcentration—dependent,theIC5oofrutininthe concentrationsof[.H3PAF 1,2,4nmol/Lwas7.3,8.7,and17.2mmol/L,respectively.ThePAF—induced reactionsofrabbit plateletadhesionwereinhibitedbyrutininIC5obeing1.51mmol/L.PMNsinnerfreecalciumconcentra— tionincrementinducedbvPAFwasinhibitedbyrutinintheconcentrationof68.2—546ttmol/Linacon— centration—dependentmanner.ConclusionThespecificreceptorbindingofPAFcanbeantagonizedby rutinwhichisanewreceptorantagonisttOPAF. Keywords:rutin;plateletactivatingfactor(PAF);receptorbindingassay;plateletadhesion;poly— morphonucleocytes(PMNs) 芦丁(rutin)别名云香苷,维生素P,是黄酮醇 苷类化合物,广泛存在于多种植物中.芦丁具有多种 生物学活性,可降低毛细血管通透性,具有抗炎,抗 氧化,抗病毒,镇痛等作用.前期研究发现红花的水 溶性成分红花总黄色素及其中含量较高的单体成分 羟基红花黄色素A有拮抗血小板活化因子 (plateletactivatingfactor,PAF)与受体结合的作 用[1],为新的PAF拮抗剂;又发现红花醇提物的 几种成分,如芦丁等有抗PAF的作用,可抑制PAF 介导的兔血小板聚集,5一羟色胺(5一HT)释放及血 小板内钙离子浓度升高[3].本实验观察了芦丁对 PAF与兔血小板受体特异性结合的影响,以期从细 胞到分子水平阐明芦丁抗PAF的作用机制. 1材料 1.1药品与试剂:芦丁(CH..0.,纯度>98,中 国药品生物制品检定所),以二甲基亚砜(DMS0) 配成所需浓度;牛血清白蛋白(BSA,上海丽珠东风 生物技术有限公司);[.H]PAF(Amersham公 司),比活度5.59×10.GBq/mmol,浓度6.62× 10mol/L甲苯一乙醇(1:1)液,加3倍体积无水 收稿日期:2004—06—27 基金项目:国家自然科学基金(39670884);北京市自然科学基金(7013034) 作者简介:金鸣(1957一),男,北京人,北京市心肺血管疾病研究所一首都医科大学附属北京安贞医院药理研究室主任,研究员,硕士生 导师,1992年7胄博士毕业于北京中医药大学中西医结合生化专业,研究方向为中药红花活血化瘀作用机制. Tel;(010)64456308E—mail:jinzang@public3.bta.net.ca 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月.391. 乙醇配成1.66×10mol/L储备液,一30?保存, 临用前加pH7.4无钙TTBSA(NaCl140mmol/L, KCl2.7mmol/L,NaH2PO40.4mmol/L,MgC12 2mmol/L,NaHCo312mmol/L,Tris—HC110 mmol/L,dextrose6.2mmol/L,BSA0.25%)配 成所需浓度;PAF(Sigma公司),储存液一20?保 存;明胶(gelatin,Sigma公司);Fura一2/AM(Sigma 公司),以DMSo配成1mmol/L溶液,分装后 一 3?保存;四氯四碘荧光素钠(北京化工厂); 2,5一二苯基嗯唑(PPO,香港Fisher公司);1,4一 双一E2一(5-苯基嚼唑)]一苯(POPOP,Fluka公司); 其他试剂均为国产分析纯. 1.2动物:新西兰家兔,雄性,体重2,3,购自 中国药品生物制品检定所,为一级合格动物. 1.3仪器:美国LKBWallac1219RACKBETA型 液体闪烁计数器;日本HITACHIF一2000型荧光分 光光度计;Chrono--log型血小板聚集仪,美中互利 公司;UV755B型分光光度计,上海分析仪器总厂; 24孔聚苯乙烯细胞培养板,CorningCostar公司. 2方法 2.1芦丁抑制[.H]PAF与兔洗涤血小板 (washedrabbitplatelets,WRP)受体特异性结合 试验:参照本室方法进行[3].家兔腹主动脉取血, ACD抗凝,制得WRP沉淀,加入pH7.4无钙 TTBSA溶液使血小板悬浮,并调节血小板浓度3× 10”/L.冰浴加样,取WRP悬液0.17mL,加入不 同浓度(3.0,48.0mmol/L)的芦丁10DMSo 溶液(药物管)或10DMSO溶液(空白管)各 0.01mL,无钙TTBSA0.01mL,再加[.H3PAF一 无钙TTBSA溶液0.01L为总结合反应管,以 10000倍于[.H3PAF浓度的未标记的PAF一无钙 TTBSA溶液0.01mL代替上述体系的无钙TTB— SA为非特异性结合管,此反应液混匀后37?结合 反应20min,以红光GF系列玻璃纤维滤纸于细胞 收集器迅速过滤反应液,滤后以冷生理盐水冲洗滤 纸5遍,滤纸80?烘1h至干后,取出各管对应的 滤纸片分别置5mL甲苯闪烁液(0.4PP0, 0.02POPOP甲苯溶液)中,以LKB液体闪烁计 数器测定各管放射性计数.计算各浓度芦丁抑制 [.H]PAF与其受体特异性结合的抑制率. 抑制率一(空白实验总结合管计数值一芦丁实验总结合 管计数值)/(空白实验总结合管计数值一芦丁实验非特异性 结合管计数值)×100 2.2芦丁抑制PAF介导WRP黏附试验:参照文 献方法口制备WRP—TTBSA悬液,调节WRP浓度 为7×10”/L.血小板黏附实验参照文献方法.进行 改进.实验分为溶剂空白孑L,PAF对照孑L及药物孔, 于24孑L细胞培养板的孑L中,分别加入0.01mL DMSo(溶剂空白孑L与PAF对照孑L)或不同浓度 芦丁DMSO溶液(药物孑L);各加入1.91×10-7 mol/LPAF—TTBSA溶液0.01mL,溶剂空白孔以 等体积TTBSA溶液代替PAF—TTBSA溶液;各孔 分别加入0.48mLWRP悬液后,将此细胞培养板 于37?温育5min,使WRP与细胞培养板壁黏 附,弃上清液,各孑L以磷酸盐缓冲液(NaC1145 mmol/L,Na2HPO46.7mmol/L,NaH2PO43.3 mmol/L,简称PBS)轻洗3遍后,加入0.25四氯 四碘荧光素钠一PBS溶液0.5mL,37?染色5 min,再以PBS轻洗5遍;各孑L加入PBS一无水乙醇 (1:1)1mL,37?30min使黏附的血小板破膜; 吸取各孑L中的破膜液于波长570nm处测定吸光度 ()值,以PBS一无水乙醇做比色空白. 2.3芦丁抑制兔多形核白细胞(polymorphonu— clearleukocytes,PMNs)内游离Ca浓度的升高: PMNs悬液制备参照文献方法【6进行改进.全血与 3明胶盐水溶液以3:1混匀沉降红细胞,取上清 液,500×g离心5min,得PMNs沉淀,将其中红细 胞低渗破膜后,500×g再次离心5min,沉淀洗涤 后HepesE63缓冲液混悬并调整细胞数为3×10./L. 改进文献方法D测定细胞内游离Ca浓度.PMNs Fura一2负载改为室温40min,负载后500×g离心 5min.测定时取Fura一2负载的PMNs—Hepes悬液 569L于石英比色皿中,依次加入0一mol/LCa— Cl:6L,DMSO(PAF对照管)或不同浓度的芦丁 DMSO溶液(PAF+药物管)10L,1.9×10 mol/LPAF—Hepes液15L,总体积600L.使用 HITACHIF一2O00荧光分光光度计测定PMNs内 游离Ca浓度的变化,参照文献方法[3计算加入芦 丁后FE34E38值以对应该状态下PMNs内游 离Ca抖浓度. 2.4数据处理:用统计软件包SPSS10.0以方差 分析及q检验分析各组均值差异的显着性. 3结果 3.1芦丁抑制[.H3PAF与WRP受体的特异性 结合:芦丁可明显拮抗[.H]PAF与WRP受体特 异性结合,不同浓度芦丁抑制1,2,4nmol/L[.H3 PAF与受体的特异性结合均可见明显的量效关系. IC.分别为7.3,8.7,17.2mmol/L.结果见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1. .392’中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005 年3月 3?2芦丁抑制PAF介导的WRP黏附:芦丁可体 外浓度依赖性地抑制PAF介导的WRP黏附作用: 其IC5o为1.51mmol/L.结果见表2. 3.3芦丁抑制PAF介导兔PMNs内游离Caz+浓 度升高:与对照组比较,芦丁68.2vmol/L时即可 明显降低FE34./FE38.值,提示芦丁可明显抑制PAF (3.2×10mol/L)介导兔PMNs内游离Ca抖浓 度升高,并呈浓度依赖性.见表3. 表1芦丁对E~H-]PAF与WRP受体的特异性结合 的抑制作用(士s,n一3) Table1InhibitoryeffectofrutinonPHIPAFspecial bindingtoWRPreceptor(土s,n一3) 与对照组比较:一P<O.O1…P<O.001 P<O.01…P<O.001”05controlgroup 表2芦丁对PAF(3.82×10_’mol/L)介导的WRP黏附 的抑制作用(士s,n一3) Table2InhibitoryeffectofrutinonWRPadhesionindu— cedbyPAF(3.82×10一’mol/L)(士s,n一3) 与PAf’对照组比较:…P<O.001 …P<O.0011ff$PAFcontrolgroup 4讨论 PAF为迄今所知最强的血小板激活剂及重要 的炎症介质之一,可由血小板,白细胞,内皮细胞等 多种细胞合成,它可作用于多种细胞受体,产生广泛 的生物效应.PAF激活靶细胞膜上特异性受体,受 体偶联G蛋白,激活磷脂酶C(PLC),可催化细胞 表3芦丁对PAF(3.2X10一.mol/L)介导的兔PMNs 内游离Ca浓度升高的抑制作用(?s,n一3) Table3InhibitoryeffectofrutinonPMNs[Ca]I concentrationincrementinducedbyPAF (3.2×10一.mol/L)(士s,n一3) 与PAF对照组比较:…P<0.001 …P<O.001”OSPAFcontrolgroup 膜上4,5一二磷酸磷脂酰肌醇水解产生三磷酸肌醇 (IP.)和二酰基甘油(DG).IP.可诱导细胞内钙库 释放Ca抖并促使胞外Ca内流,引起细胞内Ca. 浓度升高;DG可激活蛋白激酶C,使靶蛋白磷酸 化,触发血小板,白细胞的黏附,聚集与释放,促进血 液循环障碍.血栓形成,动脉粥样硬化,炎症反应及 缺血再灌注自由基损伤等诸多心脑血管疾病的发病 过程均与PAF介导密切相关,因此拮抗PAF的作 用,为目前缓解缺血性心脑血管疾病的重要途径. 本实验结果表明芦丁可浓度依赖地拮抗PAF 与兔血小板膜受体的特异性结合,抑制PAF介导 兔血小板黏附与PMNs内游离Ca抖浓度升高,表 明芦丁抗PAF的作用机制是通过抑制PAF受体 活化,进而阻断PAF诱发的反应,芦丁为一种PAF 受体拮抗剂.红花为常用活血化瘀药,其提取物具抗 血栓,抗心肌缺血,改善微循环,抗氧化等心血管药 理作用.芦丁抑制PAF作用对红花活血化瘀作用 具一定意义,该成分为红花活血化瘀有效成分之一, 阐明红花成分抗PAF的作用机制对探讨红花活血 化瘀作用的实质具有重要意义. References: [13JinM.Studyontheplateletactivatingfactorreceptorinhibi- tionofsafflworyellow[J].ChinPharmJ(ae国药学杂志), 2001,36(3):167—169. [2]ZangBX.Theantagonisticeffectofhydroxysafflworyellow Aagainstplateletactivatingfactor[J].ActaPharmSin(药 学),2002,37(9):696—699. [33ChenWM.Studyontheinhibitioneffectofrutinagainst plateletactivationinducedbyplateletactivatingfactor[J]. ChinJIntegratedTraditChinWestMed(中国中西医结合杂 志),2002,22(4):283—285. [4]ChenWM.Studyontheinhibitioneffectofflavonesfrom C.tinctoriusL.againstplateletactivationinducedbyplatelet activatingfactor[J].ActaPharmSin(药学),2001,36 (12):881—885. [53WuW.InhibitioneffectofflavonesfromC.tinaari=sL. againstPMNsaggregationandadhesioninducedbyplatelet activatingfactor[J].ChinPharmJ(中国药学杂志),2002, 37(10):743—745. [63ChenWM.Inhibitioneffectofquercetinagainstplateletand PMNsinnercalciumlevelelevationinducedbyplateletacti— vatingfactor[J].ChinPharmJ(ae国药学杂志),2002,37 (6):455—456.