[doc] 彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色的研究

[doc] 彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色的研究 彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色的研究 第25卷第1期 2005年3月 林产化学与工业 ChemistryandIndustryofForestProducts V01.25No.1 Mal”.2005 彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色的研究 LUR 卢蓉,沈雪亮,夏黎明 (1.浙江大学材料与化工学院,浙江杭州310027; 2,浙江工业大学生物与环境 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院,浙江杭州310014) 摘要:采用彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)在液体深层发酵条件下产漆酶,优化后的最适 工艺条件为:以1.1s/L蔗糖与1.1L葡萄糖作为复合碳源,氮源为1.88L豆饼粉,初始 pH值4.5,培养温度30?,漆酶活力可达l8.2U/mL.漆酶的最适反应温度为60,在55? 以下酶活力均保持稳定.综合考虑漆酶作用的最适温度与热稳定性,确定该酶的适宜应用温度为55oC.利 用粗酶液对染料酸性橙进行降解脱色试验,发现氧化还原介质可明 显提高漆酶的催化能力,作用5h最高脱 色率可达96.5%,显示了漆酶在环境治理方面良好的应用前景. 关键词:白腐真菌;漆酶;深层发酵;染料脱色 中图分类号:TQ925;Q949.329文献标识码:A文章编 号:0253—2417(2005)0l一0073—04 STUDIESONLACCASEPRODUCTIONBYC,( ANDENZYMATICDECOLORATIONOFDYE LURong,SHENXue—liang一,XIALi—ming’ (1.CollegeofMaterialsScience&ChemicalEngineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China; 2.CollegeofBiological&EnvironmentalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China) Abstract:Laccaseproductionbyawhite—rotfungusCoriolusversicolorwas studiedundersubmergedfermentation condition.Theoptimalfermentationparameterswereasfollows:carbonsource1.1g/Lsucrosecombinedwith1.1g/L glucose.nitrogensource1.88g/Lbeancakepowder,culturetemperature30? andinitialpHvalue4.5.Theactivity oflaccasereached18.2U/mL.TheoptimumreactiontemperatureoflaccaseWas60oC,andlaccaseWasstablewhen theenvironmentaltemperatureWasbelow55?.Consideringthethermalsta bilityoflaccase.thesuitabletemperature fortheenzymaticapplicationWas55oC.ThelaccaseproducedbyCversicolorcouldhydrolyzeanddecolorizearomatic dye.Duringthedecolorationofacidorangedyewithlaccase,theadditionofredoxmediatorscouldobviouslyincrease thecatalyticabilityoftheenzyme.Thedecolorationrateofacidorangedyecou ldreach96.5%after5h.which showedagoodapplicationpotentialinenvironmentprotection. Keywords:white—rotfungi;laccase;submergedfermentation;dyedecoloration 漆酶(1accase,EC1.10.3.2)又称酚酶(phenolase),是一类可降解木质素 的含铜多酚氧化酶.利用 漆酶可以有效脱除纸浆中的木质素成分…,同时也可作为纸浆的漂 白助剂,降低漂白用氯,解决纸浆工 业中的环境污染问题.除了降解木质素,漆酶还可以催化氧化大量与 木质素前体结构类似的酚类化合 物和芳香胺,因此在植物纤维的改性,废水处理,染整工艺,饮料加工 等方面也具有广阔的应用前 景].漆酶的来源包括高等植物,昆虫,细菌和真菌J,不同来源的漆酶氧 化还原性质相差很大,以白 腐菌所产漆酶的氧化还原能力最强. 彩绒革盖菌(Coriolasversicolor)是一种能迅速降解木质素的优良白 腐真菌.已有研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明该菌具 收稿日期:2003一l1一o3 作者简介:卢蓉(1980一),女,浙江杭州人,硕士生,从事生物工程研究工作 通讯作者:夏黎明,教授,博士生导师. 74林产化学与工业第25卷 有较高的漆酶生产能力,同时也发现在液体发酵条件下,碳源,氮源,温度,pH值等工艺参数对该菌产漆 酶有显着的影响.本研究着重考察了几种廉价工业碳,氮源,以及温度和pH值等发酵工艺条件对 彩绒革盖菌产漆酶的影响;在对漆酶最适反应温度及热稳定性研究的基础上,利用粗酶液对酸性橙进行 了降解脱色试验,旨在拓宽漆酶在环境治理领域中的应用. 1材料与方法 1.1菌种 彩绒革盖菌来自新西兰木材防腐研究中心,该菌又名为杂色云芝,是一种着名的白腐真菌.菌丝体 于4?下保存在斜面培养基上. 1.2原料和试剂 木糖渣,是利用玉米芯制取木糖后的纤维剩余物,用水清洗至pH值5.0左右,晾干备用,其化学成 分为:纤维素58.3%,半纤维素7.5%,木质素21.4%,其他12.8%.木屑,木材加工厂的废弃物.2,2一 连氮一双(3一乙基苯并噻唑一6一磺酸)(简称ABTS),紫尿酸(简称VAH),均为Sigma公司产品;1一羟基苯 并三唑(简称HOBT),为Acros公司产品;其他为分析纯或化学纯试剂. 1.3培养基 1.3.1种子培养基葡萄糖20g,麦芽糖5g,蛋白胨1g(斜面培养基另加琼脂20g),用水定容至1L, 调节pH值为4.5. 1.3.2发酵培养基以Doson低碳培养液”为基本培养基,碳,氮源的改变将在另文中具体指明. 1.4漆酶的制备 自试管斜面上取适量菌块接人种子培养基中,于180r/min,30?下振荡培养3d,制成液体菌种. 250mL摇瓶中装入发酵培养基50mL,以体积比4%的接种量接人液体菌种,在180r/min,30?条件下 进行发酵.发酵液于4000r/min下离心8min,上清液即为含有漆酶的粗酶液. 1.5脱色试验 脱色反应在装液量为25%的500mL三角瓶中进行.将酸性橙溶液与粗酶液按比例混合,使混合 液中漆酶的初始酶活为2.67U/mL,酸性橙浓度为0.417g/L,在 60?,pH值4.5和120r/min条件下反 应.每隔一段时间,用分光光度计在酸性橙的最大吸收波长处测定吸光度.用同样的方法在酸性橙溶 液中加入等量的灭活酶液作为空白对照. 1.6分析测定方法 1.6.1漆酶活力称取约0.0275gABTS,倒人50mL柠檬酸钠缓冲液(0.2mol/L,pH值4.5)中, 溶解后置于棕色瓶中低温保存.将适当稀释的酶液样品和ABTS溶液先在30?水浴中预热5min,然后 在1cm的比色皿中依次加入1mL稀释酶液和1mLABTS溶液,反应5min.测定在420nm下吸光值随 时间的变化值,取其线性部分,将每分钟吸光值变化一个单位定义为一个酶活力单位.测定值与稀释倍 数的乘积即为待测样品的酶活力. 1.6.2茵丝干重将含有大量菌丝的发酵液过滤,用蒸馏水洗涤菌丝2次,置于85?下烘干至恒重, 用分析天平精确称量. 1.6.3理论吸光值将染料溶液稀释到吸光值与溶液浓度成线性的范围内,用分光光度计在可见光区 测量最大吸收峰的吸光值,再乘以稀释倍数,即为该样品的理论吸光值. 1.6.4脱色率染料溶液经降解脱色后,其脱色率按下式计算:脱色率 (%):(1一A后/A前)X100 式中:前一脱色反应前溶液的吸光值;后一脱色反应后溶液的吸光值. 2结果与讨论 2.1发酵条件对漆酶生成的影晌 第1期卢蓉,等:彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色的研究75 2.1.1碳源据文献报道,限碳条件更 适合彩绒革盖菌产漆酶,作者在Doson低碳 培养基的基础上分别以淀粉,木糖渣,蔗糖, 木屑以及复合碳源(葡萄糖分别与前述4 种碳源按1:1复合)代替葡萄糖考察了碳源 对漆酶生产的影响.如表1所示,在单一碳 源的情况下,以木糖渣为碳源时漆酶的产量 并不高,这应证了漆酶不受木质素诱导的推 断J.而以葡萄糖,淀粉和蔗糖作为碳源 都能获得较高的酶产量,其中蔗糖产酶量最 高,这一结果突破了以往一直认为淀粉为最 佳碳源的观念.复合碳源的产酶量均在 原有单一碳源的基础上有所提高.其中以 蔗糖和葡萄糖作为复合碳源时产酶效果最 好,漆酶活力达到14.2U/mL,因此在以下 的实验中均采用蔗糖与葡萄糖的复合碳源. 表1不同碳,氮源对彩绒革盖菌产漆酶的影响 Table1Effectsofdifferentcarbonandnitrogensources onlaccaseproductionbyCversicolor 2.1.2氮源分别以硫酸铵(含氮21.2%),豆饼粉(含氮10%),尿素(含氮46.7%),麸皮(含氮 10%)代替酒石酸铵(含氮15.2%),考察氮源对彩绒革盖菌产漆酶的影响.从表1可以看出,采用无机 氮硫酸铵和酒石酸铵时酶活都不高,当以豆饼粉和尿素为氮源时,漆酶产量较高,特别是豆饼粉,其漆酶 活力可达18.2U/mL.由于豆饼粉价格便宜,购买方便,用其作为氮源可大大节约生产成本,有利于工 业化生产. 2.1.3初始pH值对彩绒革盖菌在不同初始pH 值(3.0—6.0)条件下的生长和产酶情况进行了研 究(表2).结果发现,该菌在酸性环境(pH值4.0 , 5.0)下生长较好,产酶能力较强,尤其当pH值为 4.5时,彩绒革盖菌的菌丝量(每150mL发酵液的 菌丝干重,mg)与漆酶产量均达到最大值,分别为 90.9mg和18.2U/mL,故确定发酵液的适宜初始 pH值为4.5. 2.1.4培养温度分别在26,28,30,32和34?的 表2初始pH值对彩绒革盖菌生长和产酶的影响 Table2EffectsofinitialpHvalueOrlgrowthof ,versicolorandlaccaseproduction 培养温度下,利用彩绒革盖菌发酵生产漆酶,实验结果表明,相应的140 漆酶活力分别为11.8,15.9,18.2,14.1和8.4U/mL.温度为30oC120 时漆酶产量达到最大,温度过低会抑制菌丝的生长,影响漆酶的合’i 成;温度过高则会对菌体分泌漆酶有一定的抑制作用.蓥60 2.2漆酶的酶学性质蹩4u 2.2.1酶反应的最适温度在pH值为4.5的环境中,将彩绒革盖0 菌生产的漆酶分别置于20,75?的不同温度下测定活力,以30? 下测得的酶活力定为100%.实验结果发现(图1),20,60?范围 内,漆酶活力随着温度的上升而上升,但上升幅度逐渐趋缓,在60?幽 时达到最大值.超过60?后,漆酶活力迅速下降,75?时酶基本失, 活. 温度对漆酶活力的影响 Effectoftemp.onlaccase activity 76林产化学与工业第25卷 2.2.2酶的热稳定性保持环境的pH值为4.5,将漆酶分别置于不 同温度下保温2h,然后在30c【=下测定各自的剩余酶活力,将热处理 前在30c【=下测得的酶活力定为100%(图2).在55c【=以下酶活力基 本保持稳定,60c【=时有所下降,高于60c【=酶活力迅速下降.综合考虑 漆酶的最适反应温度与热稳定性,选取55c【=为实际应用的最佳作用 温度. 2.3漆酶的应用 受漆酶降解木质素的启发,国内外学者开始研究其对与木质素前 体结构类似的酚类和芳香胺等有机物质的降解情况.作者考察了漆 酶对染料酸性橙的降解脱色能力,以及添加不同氧化还原介质对 脱色效果(484nm)的影响(图3).结果表明,彩绒革盖菌发酵所 得的粗酶液可直接用于酸性橙脱色,5h后的脱色率为44.9%. 当配合一定量的氧化还原介质一起使用时,则脱色率有不同程度 的提高.在参比的几种氧化还原介质中,以7.0mmolfLHOBT的 效果最佳,在5h内可使酸性橙溶液的吸光值由最初的14.7降至 0.52,脱色率高达96.5%;3.5mmolfL香草醛次之,脱色率为 76.1%;而0.5mmolfLVAH的促进效果不明显,与只使用粗酶液 的结果相近,脱色率为49.8%.由此可见,漆酶在一些小分子氧 化还原介体的协助下具有更强的催化氧化能力.由于不同介体 对漆酶催化能力的促进作用有很大区别,因而寻找一种高效,廉 价,应用面广的介体将是漆酶应用研究领域的新热点. 3结论 3.1彩绒革盖菌产漆酶的适宜条件为:复合碳源1.1g/L蔗糖和 1.1g/L葡萄糖,氮源1.88g/L豆饼粉,初始pH值4.5,培养温度 图2漆酶的热稳定性 Fig.2Thermalstabilityoflaccase 16 14 12 1O 8 6 4 2 0123456 时问/h 一 口一空白对照control;一?一漆酶(2.67 U/mL)无介质laccasewithoutredoxmediators; 一 ?一漆酶+紫尿酸(0.5mmol/L)laccase+ violuricacidhydrate;一0一漆酶+香草醛 (3.5retool/L)laccase+vanillin;一?一漆酶 +1一羟基苯并三唑(7.0retool/L)laccase+1一 hydroxybenzotriazole 图3氧化还原介质对酸性橙脱色的影响 Fig.3Effectsofredoxmediatorondecolo. rizationofacidorange7bylaccase 30c【=,漆酶活力最高可达18.2U/mL.同时发现漆酶不受木质素诱导. 3.2综合考虑漆酶的最适反应温度与热稳定性,选取55c【=作为漆酶 应用的最佳温度. 3.3漆酶对酸性橙具有明显的脱色作用,添加微量的小分子物质作为 氧化还原介质可显着提高漆酶的 催化氧化能力,以7.0mmolfLHOBT最佳,作用5h后脱色率可达 96.5%,这在染料废水的治理上具有 良好的应用前景. 参考文献: [1]SEALEYJ,RAGAUSKASAJ.Investigationoflaccase/N-hydroxybenzotriazoledelignificationofkraftpulp[J].WoodChemTechnol,1998,18 (4):4O3—4l6. 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