羊痘研究概况

羊痘研究概况 动物医学进展,2007,28(9):95—98 ProgressinVeterinaryMedicine 羊痘研究概况 蔺润霞 (甘肃省动物防疫总站.甘肃兰州730046) 摘要:羊痘病毒基因组庞大,约有150kb,包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列;绵羊痘 病毒和山羊痘病毒基因组彼此十分相似,约有96的核苷酸完全相同.p32蛋白是目前世界各地分离鉴定 的所有羊痘病毒株共有的且特异性很强的结构蛋白,在诊断和预防方面具有重要的应用价值.虽然羊痘从 临床症状和宿主特异性上很容易做出诊断,但进一步的实验室确诊还是必要的,现已有多种检测方法和诊 断试剂.控制该病最有效的方法是使用疫苗对易感动物进行免疫接种.文章从病原学,诊断和预防控制等 方面对羊痘进行综述. 关键词:羊痘病毒;p32蛋白;诊断;疫苗 中图分类号:$852.659.1文献标识码:A文章编号:1007—5038(2007)09—0095—04 羊痘(Capripox)是由山羊痘病毒属 (Capripoxvirus,CPV)的痘病毒引起的羊的一种 急性,热性,接触性传染病,包括绵羊痘(Sheeppox, SP)和山羊痘(Goatpox,GP).主要表现为发热,无 毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹.羊痘 是所有动物痘病中最为严重的一种,有较高的病死 率,能造成巨大的经济损失,严重影响 国际贸易 国际贸易术语一览表国际贸易商业发票末班国际贸易实务课件ppt国际贸易实务ppt国际贸易合同 和养 羊业的发展.世界动物卫生组织(OIE)将该病列为 A类疾病,我国将其列为一类动物疫病[1].此外,本 病在公共卫生方面也有重要意义,中国,瑞典,印度 依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的 报道[2].世界各国都高度重视本病,有本病的国家 和地区的易感动物及其有关的产品被世界各国列为 严格限制进出口的对象. 羊痘广泛分布于非洲,中东,印度次大陆,北欧, 地中海各国及德国,澳大利亚,美国等,特别是非洲 北部,中东和亚洲的部分国家流行较为严重.l3世 纪英国首先报道,l5世纪在法国,l7世纪在意大利 和德国也先后见报道.1805年曾在欧洲南部与中 部一些国家流行,造成大批羊的死亡.与我国接壤 的周边国家,如印度,孟加拉,尼伯尔,巴基斯坦,俄 罗斯,蒙古等不少国家均有本病的流行.美国,德 国,日本等发达国家经采取强有力的防控措施,已消 灭该病.我国早在北魏(6世纪)时期就记载有绵羊 痘,一直到新中国建立前后均有羊痘流行史.据报 道,近几年我国的江苏,广东,贵州,山东,浙江,广 西,甘肃,黑龙江,福建等地均有本病发生,有的地区 呈暴发流行]. 山羊,绵羊均为易感动物,在自然界传播的潜伏 期为6d,l2d.本病多由病羊和含有羊痘病毒的 皮屑随风和灰尘吸人呼吸道而感染,也可通过损伤 的皮肤及消化道感染.丘疹中含大量病毒,黏膜上 的丘疹破溃后可从鼻,口分泌物和泪液排泄病毒. 乳汁,尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源. 被病羊污染的用具,饲料,垫草,病羊的粪便,分泌 物,皮毛和体外寄生虫(如羊虱)都可成为传播媒介. 该病可发生于全年任何季节,但以春秋两季多发,主 要在冬末春初流行,常呈地方性流行或广泛流行. 气候严寒,雨雪,霜冻,枯草和饲养管理不良等因素, 都有利于本病的发生和加重病情. 1病原 1.1病原的分类地位及形态特征 羊痘病毒属于痘病毒科(Poxviridae),痘病毒 属(Capripoxvirus).该山羊属包括山羊痘病毒 (Goatpoxvirus,GTPV),绵羊痘病毒(Sheeppoxvi— rus,SPPV)和疙瘩皮肤病病毒(Lumpyskindisease virus,LSDV)3个成员,是惟一在细胞浆内复制的有 囊膜的双股DNA病毒.可以引起山羊痘,绵羊痘 和牛结节性皮肤病(Lumpyskindisease,LSD).不 同的羊痘病毒间在血清上呈交叉反应,但LSDV一 般不感染山羊和绵羊.在电镜下观察,初期的病毒 粒子呈卵圆形,大小约为250am350nm;成熟的 收稿日期:2007?06—12 作者简介:蔺润霞(1967一).女.内蒙古临河人,兽医师,主要从事预防医学研究. 96动物医学进展2007年第28卷第9期(总第168期) 病毒粒子多呈卵圆形,大小约150nm,180nm× 150nm,180nm[4].在感染细胞内,可形成胞浆包 涵体,多呈椭圆形.病毒粒子外层为层管状的构造 的脂蛋白膜,包围着2个功能不清的侧体以及哑铃 型的核酸芯髓引.核酸是由双股DNA构成,其分 子质量约为130ku×10,240ku×10. 1.2病原分子生物学特性 绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)基 因组约有150kb,彼此十分相似,约有969/6的核苷 酸完全相同.和其他痘病毒一样,羊痘病毒基因组 包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列 (Invertedterminalrepeat,ITR).SPPV和GTPV 基因组共有147个开放阅读框(ORF),编码密度为 93,所编码的蛋白为53个,2027个氨基酸不等. 基因组中间的区域(ORFs024,123)有与其他痘病 毒同源的保守序列,编码病毒复制所需的蛋白,其功 能主要是负责病毒的转录,修饰RNA,病毒DNA的 复制以及在胞内组装成熟,在胞外被蛋白膜包裹成 成熟的病毒粒子.羊痘病毒DNA的左侧和右侧 10kb和27kb的基因结构中包含重要的编码功能 的基因序列.两端基因序列(ORFs001,023和 ORFs124,156)包括一个基因家族(由8个基因组 成)及其他与病毒修饰或逃避宿主免疫识别和反应 相关的基因,负责编码胞质分裂丝蛋白,表皮生长因 子样蛋白(EGF—likeprotein),PKR阻遏蛋白,G一蛋 白二联趋化因子受体等,还有痘病毒所特有的致病 基因和选择宿主范围基因.痘病毒基因组的末端有 发夹环结构,这一序列的A+T约为75,额外的末 端重复序列和发夹环结构至少有200bp. SPPV和GTPV基因组存在一些差异,如末端 的ITRs,在SPPV为2213bp"--2349bp,而在GT— PV为2198bp,其纵向重复序列也有差异,在最靠 近末端(ORFs00l和156)的区域,SPPV含有46bp 的ORFs,LSDV包含56bp的ORFs,但GTPV的 基因组不含这一纵向末端重复序列. SPPV和GTPV与LSDV的基因组也非常相 似,约有97的核苷酸完全相同,所有的SPPV和 GTPV基因在LSDV基因中都存在,在SPPV和 GTPV基因组中,有9个与LSDV的毒力和宿主有 关的基因缺失,其中包括LSDV独有的基因LS— DV132和类似于编码白介素一l受体的基因,黏液瘤 病毒M003.2和M004.1,牛痘病毒F1lL,N2L和 K7L基因.这些基因的缺失对SPPV和GTPV的 宿主范围起了很大的作用[6]. 2羊痘病毒p32蛋白的特性 p32蛋白是目前世界各地分离鉴定的所有羊痘 病毒株所共有的且特异性很强的结构蛋白,p32蛋 白的体外表达是目前国际上羊痘研究的热点.羊痘 病毒p32蛋白与晚期H3L基因编码的痘苗病毒的 p35蛋白相类似,在成熟胞内病毒粒子的膜上表达, p35蛋白在病毒吸附,成熟病毒粒子的组装,病毒毒 力,免疫原性方面发挥着重要作用.GPVP32基因 包含969bp的开放阅读框,编码322个氨基酸; SPVp32基因包含972bp的开放阅读框,编码323 个氨基酸.推导的氨基酸序列表明p32蛋白是高度 保守的.P32基因包含一个与膜相关的靠近羧基末 端的跨膜区,能被去污剂溶解,在ELISA检测抗体 试验中能被用做捕捉抗原.免疫印迹研究显示,P32 蛋白包含一个重要的抗原决定簇,诱导的抗体反应 比其他结构蛋白超前并且优越,不但可以用于诊断 技术,还可以用于羊痘的预防. HosamaniM等对几株SPPV和GTPV的 P32基因序列的分析结果表明,SPPV和GTPV同 源为97.5,氨基酸同源性为94.7%.而SPPV p32蛋白的第55位点有一个额外的天冬氨酸,而山 羊痘和牛的结节性疹块病的P32蛋白没有此氨基 酸,另外,GTPV的p32蛋白的第77,275,403,552, 867和964位点有6个特异的核苷酸,GTPV和LS- DV也有类似的特异性核苷酸. 3诊断 3.1常规血清学方法 诊断羊痘的血清学方法有病毒中和试验,荧光 抗体试验,琼脂扩散试验,免疫电泳,对流免疫电泳, 反向被动血凝试验[8],斑点凝集试验和酶联免疫吸 附试验等.由于羊痘病毒和副痘病毒有相似的血清 型,常规血清学方法因会出现抗体交叉反应而无法 区分来源于牛,绵羊和山羊的病毒毒株以及副痘病 毒(Parapoxvirus),使其推广受限.羊痘病毒感染后 主要引起细胞介导的免疫,动物接触病原后仅产生 低水平的中和抗体,故病毒中和试验敏感性不高. 应用荧光抗体试验检测被感染的细胞,可鉴定羊痘 病毒抗原,但该方法操作繁琐,难以推广.病毒培养 虽有较高的特异性,但比较耗时,费力[如].电镜观 察是诊断羊痘的常用方法,但在发病区往往没有这 样的设备,难以满足快速诊断的需要.因此,建立特 异,敏感,快速的羊痘诊断方法是目前国内外研究的 热点. 蔺润霞:羊痘研究概况97 ELISA因其操作便利,快速,敏感,特异性强, 便于推广,能检测群体特异性抗体而倍受人们的关 注.RaoBM等[11]把Ranipet株适应于BHK一21细 胞后,经密度梯度离心纯化后作为绵羊痘抗原,建立 了检测绵羊痘特异性IgM抗体的敏感,特异的 ELISA方法.RaoTVS等[1.建立了用于检测皮 肤活组织中的山羊痘病毒抗原的免疫捕捉IC— ELISA方法,证明其特异性为80,100,敏感性 为70,869,6,该方法也可用来诊断绵羊痘.Rao TVS等[1建立了用于检测山羊痘病毒抗体的avi— din-biotinELISA方法,其特异性为91.8,敏感性 为94.19/6.CarnVM等[1将P32基因克隆后,在 大肠埃希菌中以融合蛋白的形式表达,将表达的重 组抗原用于建立ELISA诊断试剂盒,包括p32蛋白 的单价多克隆抗血清和单克隆抗体的生产.这些试 剂使高度特异性的ELISA得以建立. 虽然ELISA方法具有很多优点,但其在生产中 的应用由于需要特殊的试剂和专业技能而受到限 制.研制抗SPPV和GTPV的单克隆抗体将会为 建立特异性的区分SPPV和GTPV的诊断方法铺 平道路. 周碧君等[1朝建立了山羊痘(GP)的5种血清学 检测方法并进行了比较分析,结果表明,琼脂扩散试 验适于基层兽医开展山羊痘病例的诊断,对流免疫 电泳能提高对抗原或抗体的分辨能力,荧光抗体试 验能对感染细胞进行GTPV定位检测,反向被动血 凝试验主要用于临床痘疹痂皮和感染细胞中GTPV 抗原的定量测定,正向间接血凝试验(IHA)不失为 一 种GTPV抗体的最佳监测方法. 3.2分子生物学诊断方法 依据临床症状,电镜观察和常规血清学技术确 诊SPPV有时不可靠,且不能区分来源于牛,绵羊和 山羊的羊痘病毒毒株,病毒分离和ELISA方法由于 受中和抗体的影响,有时甚至检测不到病毒粒子. 用PCR方法可以简单,快速,特异的从组织培养上 清,活组织样品中检测出SPPV的DNA片段,还可 以通过对PCR产物的酶切分析进行CPV种的鉴 定. IrelandDC等.]以SPPV基因组的附着蛋白 基因和融合蛋白基因序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的引物具有SPPV特 异性,可利用限制性内切酶EcoRI和DraI的识别 位点来证实PCR产物的特性;ManganaVO等" 建立了鉴别SPPV的简单,快速,特异的PCR方法, 该方法的引物来自羊痘病毒KS一1和InS一1株的倒 置末端重复序列,能将SPPV与CPDV和疱疹病毒 (Herpesviruses)区分开;MarkoulatosP等[1.]用倒 置末端重复序列和a微管蛋白为目的基因设计引 物,建立了多重PCR技术检测皮肤组织中的SP— PV,该技术采用3对引物,一步扩增方法,这比用单 一 引物的PCR方法具有更高的敏感性和特异性,还 相当节省时间,是一种简单,快速,准确且特异性强 的诊断方法;HosamaniM等[7依据GTPV和SP— PVP32基因序列的差异,对产物进行限制性酶切分 析,建立了区分GTPV和SPPV的PCR—RFLP(限 制性片段长度多态性)方法,可鉴别GTPV和SP— PV;同样,GTPV和SPPV的P32基因有两个 EcoRV酶切位点,而在LSDV中不存在,HeineHG 等[1叼据此建立了区分SPPV与LSDV的PCR— RFLP方法,但需要进一步证实是否该法对所有的 SPPV都具有特异性,并且能常规化的用于区分LS— DV和SPPV;OrlovaES等[2阳建立了一种快速,简 便的鉴别羊痘病毒种的多重PCR方法,该法用羊痘 病毒种特异性的引物,产物无需进行序列或限制性 酶切分析;为了区分俄国和前苏联的一些国家应用 的绵羊痘疫苗株与流行株.,建立了一种对锚蛋白重 复序列基因的PCR产物进行限制性分析的方法. 由于这两种方法都具有很高的特异性,可以用做羊 痘病毒的常规诊断. 郭巍等[2妇依据P32基因和Gt微管蛋白基因,初 步建立了诊断山羊皮肤组织中GTPV的PCR方 法;康文玉等.参照SPPVP32基因序列,建立了快 速,特异,敏感,可定量,可同时检测大量样品的实时 荧光定量PCR技术.郭巍等[2引,马维民等.,陈轶 霞等[2进行了山羊痘病毒P32基因的克隆与表达, 为国内研制羊痘病毒诊断试剂和亚单位疫苗奠定了 基础. 4疫苗 预防绵羊痘和山羊痘有多种弱毒疫苗和灭活疫 苗,灭活疫苗免疫效果不佳,最多只能提供短暂的保 护.绵羊和山羊以一株羊痘病毒免疫后,可以抵抗 所有毒株的感染,不论感染毒株来源于亚洲或非 洲[2引.灭活的许多山羊痘病毒株均可作为灭活疫 苗广泛使用[2. 目前,正在开发新一代GTPV基因工程疫苗, 因为CPV的基因组较大,有表达多个外来基因的潜 力,且将外来基因插在羊痘病毒的非编码区,既不影 响其复制也不会影响其抗原性,所以以山羊痘病毒 基因组作为其他反刍动物病原基因的载体,生产重 组疫苗.如将牛瘟病毒(Rinderpestvirus),小反刍 兽疫病毒(Pestedespttitsruminantsvirus,PPRV) 98动物医学进展2007年第28卷第9期(总第168期) 基因克隆于羊痘病毒载体,所研制的重组单一疫苗, 将对羊痘,牛瘟,小反刍兽疫均有免疫作用?州. 5展望 对羊痘病毒p32蛋白的研究为研制新的诊断试 剂及羊痘的亚单位疫苗奠定了基础,以羊痘病毒为 载体研制活载体疫苗具有很大潜力.进一步研究该 病毒基因组的一些重要的编码功能的基因序列,将 会为诊断,流行病学和有效预防控制该病开辟新的 领域. 参考文献: [1]CranVM.Controlofcapripoxvirusinfection[J].Vaccine, 1993.11(3):1275—1279. [2]洪艳,谢忠文,施恒豫.人感染山羊痘5例[J].中华传染病杂 志,2005,23(2):143. [3]康文玉,徐自忠,高洪,等.羊痘的研究进展[J].畜牧兽医杂 志,2005,24(3):18—20. [4]周碧君,虞天德,阴正兴,等.山羊痘病毒粒子的电子显微镜观 察rJ].中国预防兽医,2006,28(3):316—319. [5]许乐仁,周碧君,阴正兴,等.山羊痘病变的超微病理学观察 EJ3.畜牧兽医,2005,36(5):492—497. [63TulmanER.AfonsoCL,Luz,eta1.Thegenomesofsheep andGoatpoxviruses[J].JournalofVirology,2002,76(12): 6054—6061. [7]MadhusudanHosamani,BimalenduMondal,PrabhakarA,et a1.Differentiationofsheeppoxandgoatpoxvirusbysequence analysisandPCR—RFLPofP32geneEJ].VirusGenes,2004: 29(1):73-80. [8]王开功,虞天德,何光志,等.应用反向间接血凝试验检测山羊 痘病毒抗原rJ].山地农业生物,2005,24(1):29—32. [9]何光志,周碧君,虞天德,等.贵州山羊痘的病原学研究与血清 学检测EJ].山地农业生物,2004,23(4);300—304. [1O]刘棋,黄夏,郭建刚,等.山羊痘病毒的分离鉴定及生物学 特性的研究EJ].中国预防兽医,2006,28(5):494-498. [11]RaoBM,RaoMVS.AnindirectIgMenzymelinkedimmu— no8orbentassayfordiagnosisofsheeppoxvirusinfection[J]. IndianVeterinaryJournal,1999,76:12,1050-1054. [12_]RaoTVS,MalikP.EvaluationofimmunocaptureELISAfor diagnosisofgoatpox[J].ActaVirologica,1997,41(6):345- 348. [I3]RaoTVS,MalikP,AsgolaD,eta1.Evaluationofavidin—bi— otinELISAforthedetectionofantibodiestogoatpoxvirusu— singnoninfectionsdiagnosticreagent[J].Acta-Virologica, 1999,43(5):297—301. [14]CarnVM,KitchingRP,HammondJM,eta1.Useofare— combinantantigeninanindirectELISAfordetectingbovine antibodytocapripoxvirus[J].JVirolMethods,1994,49:285— 294. [15]周碧君,冯元璋,许乐仁.山羊痘血清学诊断技术研究EJ].中 国预防兽医,2006,28(4);423—426. [16]IrelandDC,BinepalYS.Improveddetectionofcapripoxvirus inbiopsysamplesbyPCR[J].JVirolMethods.1998.74;1-7. [173ManganaV0,MarkoulatosP,KoptopoulosG,eta1.Sheep poxvirusidentificationbyPCRincellcultures[J].Journalof VirologicalMethods,1999,77(1):75—79. [18]MarkoulatosP,VougioukaOM,KoptopoulosG,eta1.Detec— tionofsheeppoxvirusinskinbiopsysamplebyamultiplex polymerasechainreactionEJ].VirologicalMethods,2000,84 (2):16I-167. [19]HeineHG,StevensMP,FoordAJ,eta1.Acapripoxvirus detectionPCRandantibodyELISAbasedonthemajoranti— genP32,thehomologofthevacciniavirusH3Lgene[J].Im— munolMethods.1999,227(1-2):187—196. [zo]0rlovaES,ShcherbakovaAV,DievVI,eta1.Differentia— tionofcapripoxvirusspeciesandstrainsbypolymerasechain reaction[J].MolBiol(Mosk),2006,40(1):158—64. [21]郭巍,陈杰,黄保续,等.应用PCR检测山羊痘病毒[J]. 中国兽医科技,2003,33(12):50—52. [22]康文玉,徐自忠,花群义,等.羊痘病毒实时荧光定量TaqMan— PCR检测方法的建立EJ].中国兽医科学,2006,36(07):529- 533. [23]郭巍,相文华,李一经.羊痘病毒P32蛋白表达EJ].中国兽 医杂志,2005,41(3):8-10. [24]马维民,刘湘涛,张强,等.山羊痘病毒P32基因的克隆与 序列分析EJ].甘肃农业大学,2006,41(4);27-30. [25]陈轶霞,郑亚东,窦永喜,等.羊痘病毒p32蛋白基因的克隆与 表达EJ].动物医学进展,2007,28(1)t31—34. [26]KitchingRP,HammondJM,TaylorWP.Asinglevaccine forthecontrolofcapripoxinfectioninsheepandgoats[J].Res VetSci,1986,42l53—60. [273KitchingRP,TaylorWP.Clinicalandantigenticrelationship betweenisolatesofsheepandgoatpoxviruses[J].TropAni— umHeahhProd,1985,17:64-74. [28]王开功,虞天德,张大权,等.贵州省首次暴发山羊痘的诊断研 究EJ].动物医学进展,2003,24(4):116—118. [29]BerheG,MinetC,GoffCL,eta1.Developmentofadualre— combinantvaccinetoprotectsmallruminantsagainstPeste- des—petits—ruminantsvirusandcapripoxvirusinfections[J]. Virol,2003,77(2):1571—1577. [3O]NgichabeCK,WamwayiHM,NdunguEK,eta1.Longterm immunityinAfricancattlevaccinatedwitharecombinantcap? ripox-rinderpestvirusvaccine[J].EpidemiolInfect,2002, 128:343—346. ProgressontheCapripox LINRun—xia (TheEpidemicPreventionStationofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730046,China) Abstract:TheCapripoxvirusgenomesareapproximately150kbp,containacentralcodingregionbounded bytwoidenticalinvertedterminalrepeat(ITR)regions.SPPVandGTPVgenomesarestrikinglysimilar toeachother,exhibiting96nucleotideidentityovertheirentirelength.theycanbedifferentiatedbymo— leculartools.p32,oneofthespecificlystructuralproteinspresentinallthestrainsofcapripoxviruses,play astrikinglyroleindiagnosisandprophylaxis.Althoughthetwodiseasesareeasilyidentifiedfromtheclini— calsignsandhostspeciesaffected,laboratorytestsarenecessaryforunequivocaldiagnosis.Nowabattery ofdiagnosticmethodsandreagentsisavailableforgoatpoxandsheeppox.Thebestwaytocontrolthese diseasesistheprophylacticimmunizationofallsusceptibleanimalswithefficaciousvaccine.Thispaperisa comprehensivereviewofgoatpoxandsheeppox,includingtheircausativeagent,diagnosis,preventionand contro1. Keywords:Capripoxvirus;p32protein;diagnosis;vaccine