中药炮制实验 赤芍与白芍中芍药苷含量测定.doc

中药炮制实验 赤芍与白芍中芍药苷含量测定.doc 白芍、赤芍异同点及芍药苷的测定方法 摘要:芍药为临床上常用中药，经过历代医家的不断实践，已经形成了较为稳定的用法。但是，在白芍与赤芍区分方面仍有不甚明晰之处。通过查阅文献从来源、化学成分、药理作用及临床应用等方面对之加以区别。两者都含有芍药苷，将介绍一些关于芍药苷的现代分析方法。 关键词:白芍、赤芍、芍药苷、来源、化学成分、药理作用、临床应用、分析方法 芍药一名,最早见载于《诗经?郑风》:“维士与女,伊其相谑,赠之以芍药”。后芍药逐渐被发现可做药物。但直到魏晋南北朝时期才明确提出白芍、赤芍之分,梁代陶弘景《本草 【1】经集注》记载:“芍药,今出白山、蒋山、茅山最好,白而长尺许。余处亦有而多赤,赤者小利,”又云:“白芍,其花莼白,大而美丽,根亦白色,故名。”虽将芍药分为白芍、赤芍,但在性能功效上未能将二者分开。宋代是我国历史上方药共荣发展的一个重要时期,各医家不仅充分认识到白芍和赤芍非同一药物,而且在临床上开始大范围的区别运用二者。王怀隐《太平圣惠方》将芍药分成白芍和赤芍两种药物,其代表方有白芍药散治产后崩漏,淋漓不断,虚损黄瘦;赤芍药汤治赤痢多,腹痛不可忍等,此后的文献对白芍、赤芍的功效主治、加工炮制、 【2】化学成分、药理作用、临床运用等方面予以区别,并详尽记载。 1、来源与加工的区别 白芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora?Pall的去外皮干燥根,性微寒,味苦酸。归肝脾经。主产于浙江、安徽、四川、山东、湖南等地。夏、秋采挖已栽植3,4年的芍药根,除去根茎及须根,洗净,刮去粗皮,置于沸水中略煮,使芍根发软,捞出晒干。以根粗、坚实、无白心或裂隙者为佳。 赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora?Pall或川赤芍Paeonia veitchii Lynch 的干燥根,性味苦、微寒,归肝经。赤芍主产于内蒙古、河北、东北等省区;陕西、甘肃、宁夏、山西亦产。川赤芍主产于四川;甘肃、陕西、青海亦有分布。夏、秋两季采挖,除去根 【3】头及须根,晒干。以条粗长、断面粉白色、粉性大者为佳。 结合上述，白芍与赤芍的主要不同点在于白芍主产于南方，炮制过程要去粗皮，水煮后晾干。而赤芍主产于北方，炮制是采挖后可直接晾干，无需水煮。并且在来源上赤芍比白芍来源广泛些，赤芍也可取自川赤芍的根。现常将芍药栽培品的根作为白芍入药,而其野生及其它种芍药皆作为赤芍入药。 2、化学成分的区别 白芍主要含有芍药苷(paeoniflorin)1.86%,5.76%、羟基芍药苷(oxypaeoniflorin)、芍药内酯苷(albiflorin)、苯甲酰羟基芍药苷(benzoyloxypaeoniflorin)、苯甲酸、鞣质、没食子酸。 赤芍含有丰富的苷类化合物,主要含有芍药苷3.5%,7.98%,羟基芍药苷0.12%,0.21%、芍药内酯苷，苯甲酰羟基芍药苷，苯甲酰芍药苷(benzoylpaeoniflorin)，此外还含有没食子酸、苯甲酸、鞣质。 二者所含的化学成分大致相同，但是含量各异，差别较大，有文献报道赤芍中芍药苷的含量大6.4%。D-儿茶精的含量高于0.05%,没食子酸的含量(除黄龙外)小于0.05%,苯甲酸含量低于0.21%。白芍中没有检测到D-儿茶精,芍药苷的含量小于6.0%,没食子酸的含量大于0.07%,苯甲酸含量低于0.15%。 3、功效、药理作用和临床应用的区别 白芍中医记载具有养血柔肝,缓中止痛,行瘀、凉血、消肿及敛阴收汗之功效。现代中药药理研究表明它具有解除腹部痉挛作用，对胃、肠管、子宫平滑肌均有抑制或解痉作用;并有解热，镇痛，镇静和抗惊厥的作用;还有抗炎，抗溃疡和对多种致病菌及某些病毒有抑制作用等。临床多用于阴虚发热、自汗盗汗，主治头晕、头痛、胸胁疼痛、痢疾腹痛、阑尾炎腹痛、腓肠肌痉挛、痛经和月经不调等症。白芍因其药理作用广泛，临床上多与其它药配伍使用。除上述治疗作用外，用于治疗糖尿病、哮喘、胃及十二指肠溃疡、习惯性便秘、肌肉痉挛及各种痛症，均取得良好疗效。 赤芍中医中记载有清热凉血、散瘀止痛之功能。现代药理作用研究证明其具有抑制血小板和红细胞聚集、抗凝和抗血栓、抗动脉粥样硬化、保护心脏和肝脏、抗肿瘤等作用，具有广泛的药理活性。临床用于温毒发斑,吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛经，症瘕腹 【】4痛，跌扑损伤，痈肿疮疡等症。 总之，在中医理论中白偏于补，赤偏于破，乃是赤白芍二药分用的基本特点。白芍常配伍白术补脾，同川芍泻肝，同人参补气，同当归补血，同甘草止腹痛，同黄连止泻痢。赤者常配伍犀角今以水牛角代凉血止血，同槟榔治五淋，同桅子泻肝火，同防风发痘疹，同天花 【】5粉祛癖生新。要在配伍之神，乃著奇绩耳。 4、芍药苷的现代分析方法 芍药苷的定量分析方法中多以高效液相色谱法最为常用,且呈上升趋势,其次是薄层扫描法;分光光度法应用越来越少,毛细管电泳法由于是新方法,所以应用数量不多,但其应用前景广阔。下面分别作一介绍: 4.1高效液相色谱法 高效液相色谱法主要是利用芍药苷与其他组分在流动相与固定相中的分配系数不同而把芍药苷分离出来并进行含量的测定。芍药苷为亲水性化合物分离主要是用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。 该法测定芍药苷的色谱条件中流动相以“甲醇-水”系统、“乙腈-水”系统以及“甲醇-异丙醇-醋酸-水”系统为主,且以“甲醇-水”系统最为常用，有的流动相加入一定的有机酸(如:乙酸、磷酸)是为了调节pH值,因为芍药苷呈弱酸性,加入一定的酸或缓冲溶液可减少拖尾,提高灵敏度,多少根据具体实验而定;检测波长多在230nm;流动相流速多在0.5,1.5ml/min之间,供试液的制备以甲醇溶液提取为主,乙醇也较常用,且常通过滤膜(0.45um)。 文献中 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 用高效液相色谱法测定芍药苷含量的过程比我们在实验室的操作要严谨一些，文献中除了对照品溶液、供试品溶液、标准曲线的制备还会做精密度实验，精密量取对照品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,按已知色谱条件试验,重复测定6次,计算芍药苷峰面积积分值的RSD，考察仪器精密度。稳定性实验，取供试样品溶液分别在0h、2h、4h、8h、 【6】20h进样20μL，计算芍药苷峰面积积分值的RSD，分析溶液的稳定性。重复性实验，取同供试药材样品6份,按供试品测定法测定,测得芍药苷的平均含量，计算RSD(n=6)，避免 【7】偶然误差。最后还有加样回收率实验，取已知含量的供试品溶液5份，各1mL，分别加入每毫升含芍药苷50μg的芍药苷对照品溶液1mL，混匀，测定回收率。在有些处方中测定芍药苷的含量时还会做阴性对照实验，将处方中的芍药除去，提取其它药材，进样，阴性对照液则在相对应的保留时间内无吸收峰出。 高效液相色谱法具有适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分易收集以及安全等特点,应用范围非常广泛。 4.2薄层扫描法 薄层扫描法是先用薄层色谱法(TLC)将待测组分分离出来,然后利用薄层扫描仪在选定 的波长范围进行扫描,得到面积积分值,再根据由标准液建立的回归方程算出含量,该方法准确、灵敏度高,应用较为广泛,但操作也较麻烦,尤其是测定复方中某一味组分的含量时,为避免其他组分干扰,往往需要作各种前处理,所受影响较大,重现性较差。扫描仪目前国内多用日本岛津双波长单光束薄层扫描仪;展开剂多用氯仿-甲醇系统;测定波长是芍药苷的吸收波长其数值各异,是因为不同的溶剂和其他成分对芍药苷的测定产生一定影响,而有一定的波动,有时为了避免其他组分的干扰,而不采取最大吸收峰,另取一峰值或其附近值;狭缝宽 【8】度直接影响分光质量,一般以减少狭缝宽度时吸光度不再改变时的宽度为宜。 4.3分光光度法 分光光度法是定量分析中常用的方法,是利用分光光度计来测定芍药苷的吸光度,建立浓度C与吸光度A之间的正比关系A =K×C,来计算其含量。总体来说,分光光度法是经典的定量分析方法之一,但由于其操作繁琐,影响因素较多,灵敏度受到一定限制,应用不多。 4.4高效毛细管电泳法(HPCE) HPCE是继HPLC之后又一种重要的分离、分析及微量制备的新技术。其原理是利用离子在电场作用下,在毛细管中按其淌度和分配系数不同进行分离、分析。具有分离效率高、进样量少、最低检测量小、重现性好、柱子不污染、成本低廉等特点,近几年应用越来越广泛。 【9】如王磊磊文献中报道利用高效毛细管电泳分析方法,建立赤芍和白芍的高效毛细管电泳法(HPCE)指纹图谱。方法HPCE工作条件:采用未涂层熔融石英毛细管(内径75μm,有效长度50cm),分离电压为25kV,柱温25?,二极管阵列检测器(DAD)检测波长为220nm,缓冲液为30mmol/L硼砂(pH =9.0)溶液。按此条件对来自不同产地的7种赤芍样品和8种白芍样品进行了分析。结果建立了赤芍和白芍HPCE指纹图谱,采用中药指纹图谱相似度计算软件,以系统生成的对照指纹图谱为对照模板对不同样品的图谱进行相似度计算。 目前,芍药苷在复方中的定量分析方法主要有反相高效液相色谱法、薄层扫描法、分光光度法和毛细管电泳法等。薄层扫描法和分光光度法因操作繁琐、灵敏度不高、影响因素较多而应用较少;毛细管电泳法为一新兴分离、分析技术,应用前景广阔;反相高效液相色谱法以其高效、高速、仪器化等特点而应用最广。在查阅文献过程中还看到一篇采用竞争性酶 【10】联免疫检测法(ELISA)对芍药中芍药苷(PF)和白花素(Alb)进行定量分析。介绍了一种对芍药进行质量控制的免疫化学方法，这种方法较新颖。竞争性酶联免疫检测法的原理:以测定抗原为例，(1)将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。(3)加底物显色:参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。文献作者利用这一方法测定白芍苷的含量，测定结果与HPLC检测结果的一致性良好，共检测了15个方剂，竞争性ELISA的灵敏度比HPLC法高100倍。但是我觉得竞争性ELISA操作过于繁琐，与HPLC相比可行性差。而且个人觉得HPLC的灵敏度已经可以达到要求。 5、结语 白芍与赤芍在化学成分、药理作用等方面都有差异，所以在临床应用上定要加以区别，不可以同作为一味中药使用。在芍药苷含量测定方面多采用HPLC法，该法测定操作简单、适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分易收集以及安全等特点,应用范围非常广泛。 【1】梁?陶弘景编.尚志钧，尚元胜辑校.本草经集注[M]北京:人民卫生出版社，1994:270 【2】陈建杉.白芍、赤芍源流考.四川中医,2006年第24卷第12期 【3】杨中林.中药炮制学.中国医学科技出版社 【4】项亚西，张京红.赤白芍化学成分和药理作用的差异.海峡药学2010.22(11) 【5】欧阳思清.赤、白芍药析疑.吉林中医药2004.24(3) 【6】李秀红.HPLC测定养血固冲丸中芍药苷的含量.山西中医学院学报.2011.12(4) 【7】陈春红.韩俊琦.HPLC法测定不同溶剂提取的赤芍中芍药苷的含量.浙江省医学科学院学 报2006.9(66) 【8】任建生,马海泉.芍药苷在复方中的定量分析研究进展.时珍国医国药2001.12(8) 【9】王磊磊,陈军辉.赤芍与白芍药材高效毛细管电泳指纹图谱方法学研究.时珍国医国药 2008.19(10) 【10】Lu Z?.运用单抗酶联免疫检测法对生药和方剂中的芍药苷和白花素进行定量分析 〔英〕.BiolPharm Bull.-2003.26(6)