几种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生

第 卷 第 期 年 月 植 物 学 报 , , 几种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生 王凯基 张王方 倪德徉 复旦大学生物系 包 慈 华 上海植物园 摘 要 愈伤组织形成过程中 , 各个发育时期以细胞形态和代谢状况的变化为其特征 。 在诱导期 或起动期 , 外植体伤 口 表面逐步通过回复变化转变为分生组织状态 , 表现为细胞核和核仁增大 以及 的积累 , 其结果导致细胞的脱分化 。 之后 , 继以分裂期 , 其特征为 的大量积累 和活跃的细胞分裂 。 这样 , 外层组织已完成起动 , 并已变为分生组织 , 就不能把分裂期认为回 复变化或脱分化的时期 。 木本植物外植体表面普遍地可发生瘤状愈伤组织 , 它起源于距外植体切 口较远的各 个部 分 , 特别包括表皮和下皮 。 愈伤组织培养中普遍地有分生组织结节的存在 , 它起源于个别薄壁 细胞经脱分化而来 。 分生组织结节可继续分化为内部是管胞 , 外围形成层状细胞的维管组织 结节 。 分生组织结节或维管组织结节在具有单向极性生长时形成根原基 。 不定芽一般从外生 或内生的分生细胞团分化而来 , 但有时芽原基的分化与分生组织结节或维管组织结节相关联 。 植物组织培养中有关形态发生的研究已有许多报道 。 对愈伤组织形成 、 组织分化和 器官再生的一些基本规律有所了解 , 对某些基本概念也取得了共同的认识 , 但还存在值得 商榷的若干 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。 本文对几种木本植物的外植体 , 从愈伤组织诱发到器官再生这一过程 作了比较系统的细胞组织学观察 , 为讨论植物组织培养中有关形态发生问题提供基本资 料 , 并对有关问题进行了讨论 。 材 料 和 方 法 以器官培养中已获得完整植株或芽的五种木本植物为研究材料。 诱导愈伤组织发生 和器官再生 , 分别在不同的培养基上进行 表 。 在外植体被诱导起动 , 愈伤组织分化和形成 , 器官再生各时期分别取 材 制 片 。 以 固定 , 石蜡包埋 。 切片厚度为 微米 , 分别用代氏苏木精单染或番红和固绿复染 。 侧定细胞质 相对含量 , 用 毗咯红一 甲基绿染色 。 细胞形态的观测 , 其大小用测微尺测量其长和宽 , 折成面积 声 核仁和核的大小 , 测其直径折成体积 尸 。 以上项目都在同一切片上测 个细胞 , 重复测定三次取其平 均值 。 含量的测定 , 用显微分光光度计 一 型 , 波长为 毫微米 , 在低 本文于 年 月收到 。 本文有上海植物园马以凤 、 刘静富参加实验工作。 全部照片由复旦大学生物系傅文瑜协助摄制 。 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 植 物 学 报 卷 表 诱发愈份组织和器官再生的培养基 毫克厂升 · ‘ ” 馆 植 物 种 愈伤组织 芽 根 油 橄 榄 、 十 十 十 弓或 乏 己 己 海 岸 红 杉 十 弓 十 十 叮“ 了 俐 ‘犷岁介己刀了 葡 萄 按 入门只 月卜 , 气儿 气 十 十 十 〔 娜“‘ 扩夕 南 蛇 藤 十 一 十 一 十 了 石 “ 一 小 叶 罗 汉 松 十 多 十 ···。 一 ⋯盯 , 了 脚解 乃 , 了, 了 习 培显微镜下测 , 个区域范 围 内的 光 密 度又 影 , 取其平均值 。 各项细胞组织学 观察的结果用摄影记录 。 观察结果和讨论 一 愈伤组织的诱导和发生 脱分化 外植体上已分化的活细胞 , 在外源激素的诱导下通过脱分化而后有愈伤 组织的发生 。 对这一过程还有必要作进一步的分析 。 参考 等 对愈伤组织诱发 过程所划分的时期及其细胞形态和生理特性 , 和我们在油橄榄茎段培养诱导愈伤组织发 生的早期 , 对细胞 、细胞核和核仁的大小 , 相对含量的动态观汉山 , 再用图解表示它 们在诱导起动到愈伤组织形成过程中的变动规律 图 。 叹 屯 渭 产飞丫一、于屡后,石,盈 ‘后︸。司国︵闰口咧如阅因︺门万序 声铭、 细胞 一 一 令‘、 产 尹 尹 厂 一二七长二一 护。口 一 一 一 护 、 一 乏 歹护 核仁 一 飞口﹃。工臼韶﹁的丫长葵理男 卜己 多几、,翻 飞︺﹃一︸。钧‘的长以华 对照 起动期 分裂期 亏 形成期 图 油橄榄愈伤组织形成过程中各期细胞形态和 含量的变化 口 “ 召 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 期 王凯基等 几种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生 从图 可以看到 , 在这过程中有一个明显而比较一致的转折点 , 即细胞最小 、 细胞核 和核仁最大 、 含量最高的时期 , 它标志着是细胞分裂最旺盛的时期 。 在这以前 , 在外 植体伤 口 的许多细胞被诱导后 , 以细胞形态和 含量与未起动的薄壁细胞相比 , 都反 映它们逐步失去原有的分化状态 , 转变为具分生能力的胚性细胞 。 不仅油橄榄如此山 , 红 杉也同样 图版 , 。 这是回复变化 。 的时期 , 也是细胞进行脱分化的 过程 。 在分裂期后 , 从细胞形态和 ‘ 含量变动来看 , 反映逐步转入细胞分化而形成愈 伤组织 , 这是再分化的过程 。 等 提出“ 在这分裂期 , 即回复变化期 , 包含着愈伤组织外部逐步转变为分生 组织的状态 脱分化 ” , 这似乎意味着 , 只是在分裂期起着回复变化 。 我们认为从外植体 细胞群被诱导起动开始到分裂盛期的整过程是个回复变化时期 , 也就是脱分化的过程 。对 每一个细胞来说 , 由已分化的细胞转变为合成代谢旺盛的胚性细胞是脱分化的结果 , 不能 理解为由于反复细胞分裂的结果而细胞脱分化 同时 , 似乎细胞的反复分裂 , 特别是 含量下降是细胞走向分化的开始 。 当前对植物激素在细胞生长和发育中的作用 , 已初步 认为生长素起着转录作用 , 细胞分裂素则有转译作用 , 说明脱分化过程 中 的积累是 细胞分裂的前提 。 愈伤组织的起源和形成 叼 很早就提出受伤细胞释放的物质对诱导细胞 分裂的重要性 , 从而有人提出参与起动的愈伤物质是由伤 口 未经破坏的细胞自溶所提供 的 。吸并且是 自溶产物和外来的 , 一 等生长素类物质相互作用的结果圈。 在我们的实 验中 , 普遍地出现在外植体上距伤口较远的部分 , 往往引起外观上呈肿瘤状的肥大生长 , 其起源 , 如油橄榄团 、 罗汉松来 自皮层起动 图版 , , 红杉来 自形成层和 射 线 图 版 , , 按树和南蛇藤却来 自表皮 图版 , , , 而且从这种类型的愈伤组织上可进一步诱 导发生器官氏 , 甚至于完整的植株 。 这种距创伤部分较远的异常生长所产生的组织是 否属于愈伤组织的范畴 近年来 , 在植物组织培养中已逐步明确创伤刺激只是促使细胞 增殖的原因之一 , 而且在某些情况下可能不是主要原因 , 导致细胞增殖的决定因素是外植 体不再受整体植株对它的制约 , 并给以合适的营养与生长调节物质 。 在木本植物组织 培养中所取得的上述结果论证了这种见解 。 同时 , 我们认为愈伤组织的诱发中 , 对已分化 · 的细胞所以能转变为胚性细胞 , 必须强调脱分化的作用 , 除了红杉从形成层而来的细胞增 殖引起的肥大生长外 , 其它非分生组织的起动 , 即使是表皮的起动也是通过脱分化而后长 出少量愈伤组织的 图版 , 一 。 所以 , 植物组织培养币在非伤 口 部分发生的异常生长 和从伤 口 发生的在本质上无区别 , 都是愈伤组织 , 而且木本植物组织培养中所发生的这类 愈伤组织 , 在诱导器官再生上应予重视 。 在器官培养中 , 象红杉那样 , 从维管形成层诱导细胞增殖长出愈伤组织是相当多的 。 因为形成层是分生组织 , 不存在脱分化过程 , 在创伤刺激或外源激素的作用下促进其细胞 分裂活动 , 更重要的是由形成层衍生的细胞改变了它们控制分化的遗传信息 , 不是内外分 别分化木质部和韧皮部分子 , 而只是分化薄壁组织 图版 , 。 所以 , 在愈伤组织的诱发 中 , 不只是包含着脱分化的概念 , 还存在改变细胞遗传信息和代谢路线的内容 。 根和茎的 顶端分生组织的离体培养中有同样的情况 , 与成熟组织的离体培养有所区别 。 二 组织分化 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 植 物 学 报 卷 愈伤组织形成的本身就有组织分化的内容 , 在愈伤组织中进一步有其它组织的分 化已有许多报道比 一 , 但它们与器官再生无直接关系 。 本文所涉及的是分生组织结节 的形成是愈伤组织培养中常见的现象叫 , 它是呈瘤状或片状的分生组织咖 , 而且这种结构 与芽和根的再生有关圈 。 在我们对几种木本植物组织培养中也比较普遍地观察到 , 并且 瘤状的和片状的两种类型都有〔 。 关于分生组织结节虽然还有其它许多报道‘ 〕, 但它如何形成 , 又如何进一步发展 , 还 是值得探讨的 。 很早 指出 , 器官原基的形成 , 通常是从单个或一小群已分化的 细胞变为具稠密的原生质和大核的分生细胞而来 。 等图曾报道产生芽和根的分生 · 组织是从培养物的薄壁组织发生占 等 甚至于报道说 , 发生胚状体的分生组织从 愈伤组织中的薄壁细胞随机发生的 。 最近 , 总结了有关器官再生的发 育 过 程 , 认为 “器官发育是从一堆细胞中个别具液泡的薄壁组织细胞的变化开始 , 这个 细 胞 活 化 , 发生一系列迅速的细胞分裂 , 导致形成拟分生组织 。 ⋯⋯这些拟分生组织有可塑性 , 能形成芽或根的原基 ”。 从我们的实验中 , 也看到愈伤组织中出现个别薄壁组织细胞回复 到胚性细胞 , 如油橄榄山 、红杉 图版 , 等 , 由它进一步通过细胞分裂而形成瘤状的所 谓拟分生组织 , 这里称它为分生组织结节 , 如油橄榄田 , 红杉 图版 , 。 根据这个细胞 的形态和 含量较高 , 我们初步明确分生组织结节是由愈伤组织中的薄壁组织细胞 经脱分化而来 。 分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心以却 , 也有进一步分化为维管组织结节 , 如油橄榄圆 , 红杉 图版 , 一 , 它是由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形 成层状细胞 , 包围着内部 已分化的管胞而形成 。 关于愈伤组织中分化的维管组织结节已 有许多报道 , 如红杉器官培养中出现的管胞集团‘刀 , 胡萝 卜平细胞培养中的所谓结节〔 , 香叶天竺葵离体叶柄上产生的鸟巢状维管组织团〔们 和水稻花粉培养中出 现 的 管 状 分 子 团圈等 , 虽然名称不同 , 实质上都是维管组织结节 , 它是分生组织结节进一步分化的结果 , 至于它和器官再生的关系 , 也还有商讨的余地 。 三 器官再生 根的起源和发生 根原基如何从愈伤组织发生 , 它和分生组织结节或维管组织结 节有无联系的问题尚不够明确 。 在几种木本植物器官培养中 , 油橄榄离体茎段发生的愈 · 伤组织上所产生的根 , 直接与维管组织结节联系着 , 在维管组织结节外围的形成层状细胞 具单向极性生长时形成根原基闭 , 这和张新英等图在花粉培养 中从管状分子团分化根原基 相同 。 红杉离体茎所产生的愈伤组织上再生芽 , 将这芽长成的小苗转移到分化根的培养 基后 , 在苗基又新生愈伤组织 。 在这种愈伤组织内发生分生组织结节 图版 , 。 在它 具单向极性生长时形成根原基 图版 , 。 这又和程井辰 报道的从愈伤组织中散生 分生组织团和 ’〕报道的从愈伤组织近表面的分生组织团分化根尖相同 。 从这些 事实看 , 应该说根的起源和发生基本上取得一致的看法 , 只是结节状结构的分化程度有所 差异而已 。 芽的起源和发生 关于芽的再生是否与分生组织结节或维管组织结节有关 , 已有 许多报道 〔 , , , , , 意见似乎比较一致 , 但在我们的工作中发现有不同的情况存在 。罗汉松和 葡萄按离体茎培养中 , 从皮层起动发生的愈伤组织表面 , 由局部愈伤组织近表面的片状分 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 期 王凯基等 几种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生 生细胞团分化形成苗端分生组织 图版 , , , 进一步分化叶原基形成芽 图版 , , , 夕 南蛇藤离体茎表皮起动后长出少量愈伤组织 图版 , , 从它局部表面分化苗端分 生组织 , 进一步分化芽 图版 , 当表皮和下皮一起起动长出少量愈伤组织时 , 也从愈 伤组织近表面的局部产生苗端分生组织 , 进一步形成芽 图版 , 一 红杉由形成层 起动长出的愈伤组织 , 在它尚未突出于皮层之外时 , 即由片状的分生细胞分化苗端分生组 织而形成芽原基 图版 , 。 以上这些芽的再生都不见有分生组织结节或维管组织结 节的存在 , 更不是直接从结节状结构分化形成 。 但是 , 也观察到 , 南蛇藤表皮和下皮起动 长出的少量愈伤组织中有时出现维管组织结节的分化 图版 , , 并且芽的奠基与它 有联系 图版 , , 又如红杉 , 当愈伤组织表面有苗端分生组织发生时 , 其内方有一维 管组织结节 , 而且它的形成层状细胞向外延伸与苗端分生组织相连接 图版 , , 当芽 原基形成时 , 维管组织结节成为开放型的 , 其形成层状细胞和叶原基的原形成层相通连 图版 , 。 这些又说明芽的再生与维管组织结节有关 , 但不象根那样直接由结节状 结构在具有单向极性生长时形成原基 。 可见 , 芽的再生还不能得出如 等提出池 结论 同时 , 象南蛇藤 、红杉那样的芽的再生与维管组织结节的关系 , 有待进一步研究 。 参 考 文 献 「 中国科学院上海植物生理研究所细胞室编译 , 植物组织和细胞培养 , 上海科学技术出版社 , 一 页 。 王凯基等 , 油橄榄组织培养的细胞组织学研究 , · 植物学报 , 斗一 , 一 。 包慈华等 , 海岸红杉组织培养诱导完整植株的初步研究 。 科学通报 , 一 李正理等 , 香叶天竺葵离体叶柄上发生不定根和不定芽的观察。 植物学报 , 一 。 张新英等 , 水稻花药培养中小抱子形成植株的组织分化和器官建成的初步观察。 植物 学 报 , 一 。 程井辰 , 水稻花粉愈伤组织器官形成的初步研究 。 花粉培养学术讨论会文集 , 科学出版社 , 一 , , , 坛 饥夕已 云 彻 召 才 , 一 , , 中国科学院北京植物研究所等译 , 人工培养基中培养的植物细胞及组织 。 植物生 理生化译丛 第二集 , 科学出版社 。 一 , , 血 牡 乙, , 犷衫邵 ‘ 君 奴 爪老 饥 汽 云 , 石 , 饭 恤 , 二 艺 才 云, 落 , 一 , , 昭 , , , 场 杭 ￡” 坛玄 仙 , 一 , , , 卫 份 , 乞她 却 才 , 一 , , 过 玉 了 。 召犷口夕 名 乞 路 , 一 , , 认 肋 血 万 乞 几才, 一 石 邵 , , 的 桩 滩几 刀 儿 , 召云 , 一 , , 毓 如 叮。罗 币 儿 动‘几份仍 仇可左召 桩 才 , 器 一 留 , , 。 比 通 , 俘 九 , ,勺,‘ 叫’ 〕 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 植 物 学 报 卷 , , , 气 艺牡 落亡 , 叮 , 一 刃 , , “ , 恤 ” 认 了 , 一 叨 , , “ ” , “ 乐 , 一 , , 卫 , , 伍 皿 刀 了 即 艺 件古 , 儿 ” 云 , 一 , 已 、 , 刀 还 恤 , · , 九九 才· , 一 , , , , 还 认 几几 , 一 , , , , “ 日 ” , , 二 一 ,﹃‘, , 月口自﹄ 韶肠 月一 一 , 乞 夕 一 一 夕沪口 亡仍 ”云 , 邵 件落公 犷 么才 一 召 , 夕 公丑。君 二乞 乙召 二 一 , 即 , , , , , 朋 刃。 杭 , , , 刀 , © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 期 王凯基等 几种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生 一 。 , , , 滋 刀 砚叭 加 即 笋位 一 即 公吕 却 卯。艺 比 桩 个 刀 。 了 , 毛 刀倪 乙, 夕才讹 血 伍 玩 口 玩 牡 · , 即 俪才沏 刀 即 功份 个 肠 。乞 初 比 姐 任。 毛 确 卫 , 卿 还 、 乞 诫 “ 。 桩 , 乞 心 曲 。初 · 介 叨 , ‘ 纽 个 加 刀“ 妙才钻 戒 、甲 伍 山 。恤 玩 倪 刃‘ 蓄 倪 名 卯 。玄 耐 少加 个 召才 ”名 必 还 此 伽 纽 烈 比 , 个 , 灿 习艺璐 盆 日 纽 · · 而 又 加 场 、 ￡ 袱 个 吧 伍 一 加 , 幼 了 初 · 让 吕 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 王凯基等 儿种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生 图版 一 ﹄月日﹃目 红衫茎外植体纵切面 , 示愈伤组织形成中的起动期 。 丫 罗汉松茎外植体横切 面 , 示愈伤组织起源于 皮层 。 义 犯 红杉茎外值体横切面 , 示起动的形成层 个 和射线细胞 。 按树茎外植休纵切面 , 示 愈伤组织起源于表皮 。 丫 南蛇藤茎外植体纵切面 , 示表皮起动 。 丫 、 南蛇藤愈伤组织的发生 , 并有苗端分生组织 个 的发生 。 火 工 红衫愈伤组织切 面 , 示单独的薄壁组织细胞脱分化和进行第一 次 有丝分裂 。 丫 斗 从上图所示单个薄壁组织细胞发展而来的分生组织结节 。 丫 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 王 凯基等 一 儿种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再生 图版 如 一 从上图所示分生组织结节发展而来的维管组织结节的发育。 丫 红杉愈伤组织的切面 , 内有 若千分生组织结节。 红杉愈伤组织的切面 , 示根原基起源于分生组织结节。 丫 罗汉松外 植体的横切面 , 示愈伤组织上有苗端分生组织 个 发生 。 丫 巧 从上图苗端分生组织发展而来的芽原基 的形成 。 又 按树愈伤组织切面 , 示愈伤组织上发生苗端分生组织 。 又 从上图所示苗端分生 组织发展而来的芽原基的形成 。 火 南蛇藤外植体的纵切面 , 示起源于表皮的芽原基 。 丫 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 王 凯基等 一 几种木本植物组织培养的愈伤组织形成和器官再 生 图版 , 比 中 致怪慰伪姐洪叨 阅 , 不曰王剑牙原叁曰 夕。 沐 ‘ 阴 叱滕外但体纵叨 四 , 不 汉起动 。 沐 拼 乙 走 上 图所示已起动的下皮进行有丝分裂 。 火 愈伤组织的形成 , 并在它表面分化苗端分生组织 个 。 义 若干芽原基的形成 。 又 南蛇藤外植体的纵切面 , 示下皮起动长出的愈伤组织中有维管组织 结节的发生 。 丫 芽原基的分化与维管组织结节相关 。 火 红杉愈伤组织切而 , 示苗端分生组 织 个 的分化与维管组织结节的形成层状细胞有联系。 丫 芽原基的形成 , 其叶原基的原形成层与维 管组织结节的形成层状细胞相连接 。 丫 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net