分子生物学研究的好材料——大肠杆菌

分子生物学研究的好材料——大肠杆菌 　　摘要 大肠杆菌（Escherichia coil）是我们了解得最清楚的原核生物，它为分子生物学的发展做出了巨大的贡献。本文简要介绍大肠杆菌的细胞壁、细胞膜、细胞核、质粒、核糖体、鞭毛等结构与功能以及大肠杆菌的产能方式和生化反应。 　　 关键词 大肠杆菌 细胞结构 产能代谢 生化反应 　　 大肠杆菌（Escherichia coli）在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。大肠杆菌为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌。其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。 　　1．形态结构 　　1.1 细胞壁 位于大肠杆菌的最外层，厚约11um，分为两层，即外膜和肽聚糖层。外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，占细胞壁于重的80％，厚约8nm，位于肽聚糖层的外侧，主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。脂多糖是革兰氏阴性细菌的内毒素，也是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成分，主要和其抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关。肽聚糖层由1～2层网状的肽聚糖组成，占细胞壁干重的10％，厚约2～3nm，是细菌等原核生物所特有的成分。大肠杆菌的肽聚糖由聚糖链、短肽和肽桥三部分组成。聚糖链由N-乙酸葡糖胺和N-乙酚胞壁酸分子通过β-1，4糖苷键连接而成，短肽由L-丙氨酸→D-谷氨酸→内消旋二氨基庚二酸→D-丙氨酸组成，并由L-丙氨酸与胞壁酸相连。一条聚糖链短肽的D-丙氨酸与另一条聚糖链短肽的内消旋二氨基庚二酸直接形成肽键（肽桥），从而使肽聚糖形成网状的整体结构。由脂蛋白将外膜和肽聚糖层连接起来，从而使大肠杆菌的细胞壁形成一个整体结构。 　　1.2 细胞膜 大肠杆菌细胞膜的结构和其它生物细胞膜的结构相似。但其细胞膜中蛋白质的含量高且种类多。其细胞膜具选择透性，从而可控制营养物质进出细胞。大肠杆菌细胞的生物活性非常活跃，含有丰富的酶系。如各种脱氢酶系，氧化磷酸化酶系，电子传递系统，透性酶等。因此细胞膜是原核生物能量转化的场所，并能通过它对外界环境的各种刺激作出反应，并可传递信息，参与细胞壁的合成等。 　　1.3 细胞质 细胞质是细菌的内环境，是蛋白质、各种酶类和核酸生物合成的场所，也是吸收营养物质后进行物质合成和分解代谢的场所。大肠杆菌的细胞质中含有糖原颗粒、核糖体和质粒等结构。 　　l.3.1 核糖体 核糖体是细胞质中一种核糖核蛋白颗粒，是蛋白质合成的场所。大肠杆菌的核糖体呈椭圆球形，体积为13.5nm×20nm×40um。由65％的核糖核酸和35％的蛋白质组成。大肠杆菌的核糖体分散在细胞质中，完整核糖体的沉降系数为70S，由30S和50S两个大小不同的亚基组成。 　　l.3.2 质粒 在大肠杆菌中，除遗传物质的主要载体染色体之外，还有一种闭合环状的双链DNA遗传因子，即质粒。质粒具有自我复制的特性，不同质粒的基因及质粒和染色体基因均可发生基因重组，质粒可通过细菌的接合而转移，也可随细胞的分裂而传递或丢失。由于质粒具有这些特性，所以在分子生物学和遗传 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 中质粒经常作为外源基因的载体。大肠杆菌中已发现的质粒有F因子、R因子和Col因子等。 　　F 因子 又称致育因子，是最早发现的质粒。分子量63×106D，94.5Kb，约为大肠杆菌染色体的2％。F因子的基因含有3个主要基因群，分别负责插入、复制和转移的功能。含有F因子的大肠杆菌为雄性，用F+ 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示，不含F因子的大肠杆菌称为雌性，用F-表示。通过F+和F-细菌的接合F因子可经性菌毛传递给F-菌株，使F-菌株转变为F+菌株。F因子可单独存在，也可以通过同源重组整合到细菌的染色体上。 　　R 因子 最早于50年代由痢疾志贺氏菌中发现，后来发现大肠杆菌也含有这种质粒。R因子常由相连的两个DNA区段组成。一个为抗性转移因子，它含有调节DNA复制和拷贝数的基因。转移基因及四环素抗性基因。另一个为抗性决定因子，其上含有青霉系、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素和磺胺等抗性基因。 　　Col 因子 即产大肠杆菌素因子。它编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素的化学成分为脂多糖蛋白质复合物，它能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢而专一性地杀死不含Col因子的其它肠道细菌。 　　1.4 拟核 大肠杆菌的细胞核无核膜和核仁，没有固定的形态，结构简单，称为拟核，也称细菌染色体。拟核具有高度紧密的结构，由RNA、蛋白质和超螺旋环状DNA组成。大肠杆菌的全部基因都包含在这条DNA上。环状DNA的总长度可达1300μm，分子量为2.8×109D，大约含有3000～4000个基因，目前已经确定了1400多个基因的结构、功能及在基因图上的位置。通过研究大肠杆菌基因的结构、功能及表达调控可揭示其它生物的遗传现象和规律。 　　1.5 特殊结构 　　1.5.l 荚膜 荚膜是某些细菌向细胞壁外分泌的并位于细胞壁外侧的一层厚度不定的胶状物质。大肠杆菌的荚菌的荚膜主要由多糖组成，具有抗原性，构成了大肠杆菌的表面抗原，即K抗原。 　　1.5.2 鞭毛 鞭毛是某些细菌长在细胞表面的长丝状、波曲状的附属物。其数目为一至数根，长为菌体的苦干倍，最长可达70μm，直径一般为10～20nm。鞭毛由鞭毛蛋白组成，构成了细菌的鞭毛抗原。大肠杆菌为周身鞭毛，和其运动有关。若将大肠杆菌穿刺接种于半固体培养基，它将沿穿刺线向周围扩散生长。大肠杆菌的细胞表面还含有一种比鞭毛更细、较短且直硬的丝状体叫菌毛，可分为普通菌毛和性菌毛。普通菌毛主要用于吸附于动植物、真菌以及各种细胞的表面，有的是噬菌体吸附的位点。性菌毛是在F因子的控制下形成的，它是细菌接合的“工具”。通过性菌毛的接合，可在细菌之间传递质粒或染色体基因等。 　　2．生理生化 　　2.1 产能代谢 大肠杆菌为兼性厌氧菌，其营养类型为化能异养。呼吸类型为：在有氧条件下进行有氧呼吸产能，在无氧条件下进行无氧呼吸和发酵产能。 　　2.1.1 有氧呼吸 有氧呼吸是指以分子氧作为最终电子受体的生物氧化过程。大肠杆菌可以利用葡萄糖等作为碳源和能源。葡萄糖经EMP途径分解为丙酮酸，丙酮酸再经TCA循环彻底氧化为CO2和H2O，并从中获得大量能量。在此过程中，底物氧化释放的电子通过电子传递链最后交给氧。电子传递链又称呼吸链，其功能之一是传递电子，功能之二是将电子传递过程中释放的能量合成ATP，即电子传递磷酸化作用。大肠杆菌呼吸链的组分与线粒体呼吸链的组分有所不同，但详细组分还不是十分清楚。大肠杆菌的呼吸链上有两个部位释放质子（线粒体呼吸链上有3个部位释放质子）。因此大肠杆菌呼吸链的P：O比为2，即一对电子经呼吸链的电子传递可得到两个分子的ATP。 　　2.1.2 无氧呼吸 在无氧条件下，底物脱下的氢经部分呼吸链传递，最后交给氧化态的无机物（个别为有机氧化物）的呼吸类型。大肠杆菌含有硝酸盐还原酶，在无氧条件下以硝酸盐作为最终电子受体而将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 　　2.1.3 发酵 发酵是厌氧或兼性厌氧微生物获取能量的一种方式。在此过程中，有机质氧化释放的电子不经电子传递链而是直接交给另一内源性有机物。基质在发酵过程中氧比不彻底，发酵的结果仍积累某些有机物。大肠杆菌在无氧条件下进行混合酸发酵，通过发酵将葡萄糖转变成琥珀酸、乳酸、甲酸、乙醇、乙酸、H2和CO2等多种产物。大肠杆菌将丙酮酸分解成乙酰辅酶A与甲酸。甲酸在酸性条件下（pH6.2以下）经甲酸氢酶进一步分解为CO2和H2，因此大肠杆菌发酵葡萄糖既产酸又产气。 　　2.2 生化反应 由于上述大肠杆菌进行混合酸发酵产生较多有机酸，使发酵液pH下降到4.2以下，加入甲基红指示剂呈红色。故大肠杆菌甲基红反应阳性。产气气杆菌发酵葡萄糖形成的丙酮酸经缩合脱羧转变为乙酰甲基甲醇，进一步还原为2.3-丁二醇。乙酸甲基甲醇在碱性条件下氧化生成二乙酸，二乙酸与精氨酸中的胍基起反应生成红色化合物，此反应为V．P．反应。产气气杆菌发酵葡萄糖的V．P，反应阳性。由于大肠杆菌发酵葡萄糖不产生2.3-丁二醇，故大肠杆菌V．P．反应阴性。V．P．试验、甲基红试验对大肠杆菌的检测具有重要意义。大肠杆菌还具有氧化酶阴性、不液化明胶、产生吲哚、不利用柠檬酸盐以及在三糖铁琼脂培养基中不产生H2S等生化反应特性。 　　 早期分子生物学的研究主要以大肠杆菌为实验材料，通过研究大肠杆菌，揭示了许多生命的现象和规律。1953年，沃森和克里克提出DNA的双螺旋结构模型并设想DNA以半保留方式进行复制。1958年梅塞尔森和斯塔尔以大肠杆菌为材料，用实验证明了DNA半保留复制的有效性。1969年凯恩斯用放射自显影技术证明了大肠杆菌环状DNA的半保留复制。1968年冈崎发现了冈崎片段。至70年代，大肠杆菌的复制过程已相当清楚，从而为分子生物学的发展以及对细胞分裂的认识奠定了理论基础。 　　1．大肠杆菌的分裂繁殖 　　1.1 染色体复制与分裂的关系 大肠杆菌以分裂的方式进行繁殖。它的分裂是从染色体的复制开始的。为了使遗传物质能均等地传给两个子代，染色体的复制必须与细胞的分裂保持一致。染色体复制不完成，细胞就不能分裂；复制一旦完成，即开始分裂。大肠杆菌DNA复制从起始到完成需40min。在染色体复制完成约20min后，细菌进行分裂。在生长缓慢时，每一个大肠杆菌内只有一条染色体，染色体复制完成后细胞进行分裂，然后才开始下一次复制。在快速生长时，染色体一次复制尚未结束，在尚不分开的染色体上又开始了新的复制，导致染色体复制的时间大为缩短，细胞分裂的代时（细菌繁殖一代所需时间）大为缩短。由此可知：抑制DNA的复制，即可抑制细胞的分裂。如用丝裂霉素C处理对数生长期的大肠杆菌，由于抑制了DNA的合成，虽然细菌能继续生长，但却不能分裂。 　　1.2 分裂过程 接种到新鲜培养基中的大肠杆菌细胞，从周围环境中选择性地吸收营养物质。在细胞内合成所需的RNA、DNA、蛋白质及酶等大分子物质，细胞体积不断增大，随后开始分裂过程。首先是拟核开始分裂，同时细胞中央的细胞膜也开始对称地向中心凹陷生长，使拟核均等地分配到凹陷两侧。随着细胞膜的向内凹陷，母细胞的肽聚糖层也跟着由四周向中心生长，把细胞膜分为两层，每层分别成为子细胞的细胞膜。肽聚糖层也分为两层，直至中央会合，形成由细胞质膜和肽聚糖组成的隔膜。隔膜完全形成后，两个子细胞分开，完成了一次细胞分裂。 　　2．大肠杆菌DNA的复制方式 　　遗传信息通过实代DNA分子的复制，从亲代传递给子代，从而保证了遗传的稳定性。因此DNA的复制对生物的遗传具有重要的意义。 　　2.1 双链DNA的半保留复制 在复制时DNA双链分开，作为合成子链的模板。复制后双链DNA分子中的一条链为亲代的DNA，而另一条链则为新合成的DNA。这种方式的复制称为半保留复制。半保留复制首先是在大肠杆菌中得到证明的。1958年梅塞尔森和斯塔尔首先将大肠杆菌在重同位素15N的培养基上培养十几个小时，以保证全部DNA都被15N所标记，然后再将大肠杆菌转入14N培养液，间隔一定时间取样，提取菌体DNA并经氯化铯密度梯度离心，进行紫外线吸收光谱分析。从不同代期的光谱分析中可以看出：在代期为0时（亲代DNA）为由15N构成的重密度带。复制一代以后为14N15N组成的中间密度带。没有得到15N构成的重密度带，这表明在复制过程中亲代DNA不能作为完整的单位保留下来；亦未得到14N轻密度带，表明子代DNA分子不能重新合成。复制两代以后出现两条带，一条为轻密度带14N，另一条为14N15N的中间密度带。随后，随着代期的延长，中间密度带被稀释，从而说明大肠杆菌DNA的复制为半保留复制。后来证明这是生物界DNA复制的普遍方式。 　　2.2 染色体环状复制 大肠杆菌的染色体为双链环形DNA，总长度为4.6×106bp，DNA总长度可达1100～1400μm。凯恩斯通过精辟的实验证明了大肠杆菌DNA是以环状方式复制的。首先将大肠杆菌生长在含[3H]胸腺嘧啶的培养基中，这样在放射性培养基上生长时所合成的全部DNA都是具放射性的。培养接近两代时，分离出菌体的完整DNA，可以从其放射自显影图上看到分枝的环状图式。后来在有些病毒中也发现了环状复制。因为复制环的图式象希腊字母θ，故称这种复制为θ复制。 　　2.3 DNA复制的酶学 DNA的复制过程十分复杂，是在多种酶的参与下完成的。 　　2.3.l 拓扑异构酶I 首先在大肠杆菌中发现，当其与DNA结合时，可形成稳定的复合物，在此复合物中，DNA的一条链断裂，然后再重新连接，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。此过程不需要ATP。 　　2.3.2 旋转酶 属II型拓扑异构酶。大肠杆菌的旋转酶由两个A亚基和两个B亚基组成。旋转酶可连续引入负超螺旋到同一个双链闭环DNA分子中，从而消除复制过程中所产生的正超螺旋。此酶的活性需要ATP。 　　2.3.3 解螺旋酶 大肠杆菌的解螺旋酶是由rep基因编码的蛋白质或酶，称为Rep蛋白。ReP蛋白利用ATP水解的能量松开双螺旋。 　　2.3.4 DNA聚合酶 1956年科恩伯格等首先在大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶I，后来又相继发现了DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 　　DNA聚合酶I 由1条多肽链组成，其活性主要有：5＇→3＇聚合酶活性，即使脱氧核糖核苷酸逐个加到3＇－OH末断的核苷酸链上，使DNA链沿5＇→3＇方向延长，其聚合活性只能在已有的核苷酸链上延长DNA而不能从无到有开始DNA链的合成；5＇→3＇核酸外切酶活性，此活性对DNA复制的忠实性极为重要，在极少情况下，聚合酶在3＇－OH末端加上1个与模板链上碱基不配对的碱基，此时聚合酶I即可发现并切除这个错配碱基，从而避免复制过程中的错误；5＇→3＇核酸外切酶活性，它只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5＇末端水解下核苷酸，此活性在切除由紫外线照射而形成的胸腺嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA复制中冈崎片段5＇端RNA引物的切除也靠此酶。 　　DNA聚合酶II 由1条多肽链组成，酶的活性低。其活性主要有：5＇→3＇聚合活性，3＇→5＇核酸外切酶活性和5＇→3＇核酸外切酶活性。 　　DNA聚合酶III 是由多个亚基组成的蛋白质，是大肠杆菌细胞内真正负责开始合成DNA的酶。此酶活性极高。全酶由7种亚基组成，其中α亚基具有5＇→3＇聚合酶活性。α、ε、θ3种亚基组成全酶的核心酶，称为polIII。ε亚基具有校对功能。此酶也具有5＇→3＇外切核酸酶活性和3＇→5＇外切核酸酶活性。 　　2.3.5 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶由1条多肽链组成。此酶能把3＇－OH和5＇－P连接起来。但 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 这两个基团都在相邻的脱氧核苷酸碱基配对的末端，它不能将两条游离的DNA分子连接起来。 　　2.4 大肠杆菌染色体DNA的复制 大肠杆菌染色体DNA的复制是从染色体的一个特定位置，即复制起始区（oriC）开始的双向复制，在环状染色体的相对位置上的终止区（terC）终止。整个复制过程可划分为3个阶段：复制的发动，复制叉的延伸和复制的终止。首先是切口酶在复制起点将一股超螺旋的DNA切开，在解旋酶的作用下DNA双螺旋解旋形成一个复制泡，此时切口被封闭，复制泡的两边各形成一个复制叉。一个顺时针移动，另一个逆时针移动，在复制叉处开始DNA的复制。在RNA聚合酶的作用下先形成一段与模板互补的引物RNA，然后在DNA聚合酶的作用下根据碱基配对原则将脱氧核糖核苷酸添加到引物RNA的3＇端，使DNA由5＇→3＇复制，从而使新链不断延长。由于在一个复制叉上亲代DNA的两条链皆是新DNA合成的模板，两条链又是反向平行的，而DNA的合成只能从5＇向3＇方向进行，所以在一个复制叉上随着复制叉的向前延伸，一条链的复制是连续的称为前导链，另一条链的复制则是不连续的称后随链。后随链合成的DNA中大部分是以小段形式存在的称为冈崎片段。每个冈崎片段都由一个RNA引物引发。当复制叉延伸到复制终点时，由DNA聚合酶I除去RNA引物并由DNA添补缺口，最后由DNA连接酶封闭切口，从而形成两个与原来完全一样的双链DNA环状分子。由于大肠杆菌染色体是环形的，所以两个复制叉汇合在起点对面距起点180°的终点。这样一个包括复制起点和终点的独立的复制单位叫复制子。大肠杆菌只有一个起点和一个终点，整个染色体为一个复制子。大肠杆菌染色体的复制速度很快，每分钟复制105核苷酸，完整染色体在40min内完成复制，从而为细胞的分裂做好了准备，保证了遗传物质的稳定性和连续性。 辛明秀著，生物学通报，1996年11月，12期