流式细胞检测课件

王丽2015-07-07流式细胞技术FLOWCYTOMETRYWhatdoesitmean?CYTOCellMeasure(ment)MEASUREMENTOFACELLMETRY2FLOWCYTOMETRY：在液流系统中，快速测定单个细胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。FlowCytometer(FCM)–流式细胞仪FlowSorter–流式细胞分选仪BDFACSVantageBDCalibur流式细胞仪BD流式细胞仪液流系统3 BECKMANCytoFLEXMiltenyiMACSQuantGuava5HT微毛细管细胞 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪流式细胞仪的组成OpticsElectronicsSoftwareFluidicsWaste4样品规格：96孔板或1.5mL小管5进样准备工作流程样本制备荧光染色上样检测数据分析FluorescenceDetectorHistogramSingleCellSuspensionCellSuspensionFluorescentlyLabelledAntibodyFluorescenceY+BlueLaser(488nm)6液流系统功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。SheathFluid:~10mL/TestWaste：1L/hrrun10万—100万cells/TestNoSheathFluidWaste：<10ml/hrrun2千—1万cells/TestVolume=200nlFlowRate=0.1-1ul/second0.1mm20mm50-100mm0.1mmProbeVolume=200plVolume=0.01Volume=0.02Volume=0.03微毛细管流动池8460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50LongpassShortpassBandpassBP500/50=475nm–525nmLP500=>500nmSP500=<500nm光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。9easyCyte5HTsystem激发光:75mWBlueLaser(488nm)检测荧光通道：ForwardScatter–FSCSideScatter–SSCGreen–525/30nmYellow–583/26nmRed1–680/30nm10功能:量化电压脉冲将模型信号转换成数字信号荧光补偿数据传给电脑以便分析电子器件检测器、光电二极管、光电培增管11软件系统12InCyte开放模块-Flexibility拖曳式设门，操作简单易学整合多组数据多种Plot以供选择R1R2WorkStationHeat-Map数据分析直观化Min/Maxthreshold分析方式灵活13测量参数光散射强度荧光强度样本体积细胞数目前向散射角侧向散射角Incidentlaserlight前向散射角和侧向散射角“大小”成正比例关系:截面积大小折射率细胞形状虽然也与细胞的形状与大小有关，但是它对细胞膜、胞质、核膜的，折射率更敏感。FSC:Forwardanglelightscatter区分细胞与细胞碎片SSC:Side-angle(90)lightscatter在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。Scatter–HowitworksSideScatterForwardScatter02004006008001000LaserLightSSCFSCLaserLightFSC粒细胞SSC淋巴细胞LaserLightSSCFSC单核细胞荧光——荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。激发光谱——能够激发荧光物质的波长范围。发射光谱——荧光物质的发射波长范围。因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。FCM多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发多种荧光。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。荧光信号17荧光信号~520nmemission488nmexcitationFITC-labeledantibodybindssurfaceantigen荧光染料性能488nmexcitationwavelength(nm)excitation/emission519nmemissionStokesShift线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。对数放大——抗原检测等。荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。荧光信号20常见荧光素：FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色530nmPE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nmAPC(别藻兰蛋白）：红色660nm抗体的选择：首选直接标记抗体荧光分子强度：APC>PE>PerCP>FITCPE较强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原21常见荧光物质的应用PM1(Orange)AddnmPM2(Red)PM3(Green)FluorophoresConjugatedtoanAbPEPE-Cy5FITCDeadCellDyes(DNAstaining)PI7-AADLiveCellDye(DNAStaining)LDS751FluorescentProteinsGFPCellTrackingDyesCFSE直方图和点阵图直方图(HistogramPlot)——单参数分析.X-Axis:荧光信号强度.Y-Axis:细胞数目.点阵图(DotPlot)——双参数分析.XandYaxis：两种荧光信号强度.每个点代表一个细胞.Log&Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.直方图：可根据单一因素区分细胞亚群10e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)705335180CountM2M110e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)705335180Count70cellseachhaveagreenfluorescenceintensityofabout400Noticethesubpopulation?25血细胞分群（红细胞溶解后）点阵图：根据多因素区分细胞亚群荧光补偿光谱重叠的校正：目前使用的荧光染料都是宽波谱，两两之间的发射谱范围有一定的重叠。为了克服这种误差，可使用荧光补偿电路，设置合理的荧光信号补偿。我需要准备什么？1.Why：为什么进行流式细胞检测？流式细胞技术是否是最佳的检测方法？检测的原理是什么？要检测的物质是什么？2.Where：荧光标记的物质在哪里？是否需要对细胞进行固定？打孔？3.Which：选择什么荧光标记物？4.How:样品制备流程，多少个标本？（空白对照、阴性对照……）5.When:预约（175874947群共享下载申请表）Doit！（合适的细胞密度并避免细胞结团）2728应用范围细胞绝对计数和活力分析细胞增殖细胞周期细胞凋亡细胞毒实验抗原定量检测线粒体膜电位检测……实验对照的设计空白对照ALL：采用不标记的细胞进行平行测定，用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。阴性对照：调节各荧光探测器合适的放大倍数，即确定待测标本的基础荧光域值。常用同型对照（与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白），用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的背景。阳性对照：用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。补偿对照：多色分析时，将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进行单色标记，以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，补偿对照29细胞周期：从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。（细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化。）DNA含量：G1（DNA合成前期，2C）、分裂间期S（DNA合成期，2C-4C）、G2（DNA合成后期，4C）分裂期——M期（DNA为4C）。利用核酸标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四个时期，普通流式无法进行定量检测。301.DNA细胞周期分析应用实例1.DNA细胞周期分析31实验步骤及注意事项：1、细胞周期固定：加200ul细胞（贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化）到1.5ml离心管中→300×g转速离心5min，并用1×PBS清洗一次→离心去上清→添加300ulPBS溶解沉淀细胞→缓慢加入－20℃预冷的100%乙醇700ul固定细胞（固定过程中需要边滴加乙醇，边震荡，不要产生细胞聚团，否则会严重影响实验结果）→最后乙醇终浓度为70%→－20℃孵育至少3小时（建议4℃孵育过夜，效果会更好）。2、将固定好的细胞300×g转速离心5min，并用1×PBS清洗一次。将细胞用200ul的Guava细胞周期试剂重新悬浮，室温孵育30min，注意避光。3、用200目细胞筛过滤细胞（如果使用PI染色必须过滤），显微镜下细胞无结团，Guava流式细胞仪检测。321.DNA细胞周期分析2.早期细胞凋亡检测332.早期细胞凋亡检测结果34正常细胞：AnnexinV(-)/7-AAD(-)早期凋亡细胞：AnnexinV(+)/7-AAD(-)晚期凋亡细胞：AnnexinV(+)/7-AAD(+)CD95/FASL刺激诱导凋亡实验步骤1.样本准备(贴壁细胞)：弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入胰酶消化细胞，。收集旧培养基，通过离心获得凋亡或死亡细胞，与之后消化后的细胞混合，再检测。2.细胞染色：在96-well微孔板相应的孔中加入100ulGuavaNexin（货号：4500-0450）和100ul准备好的细胞悬液，室温避光孵育20min；尽快用流式细胞仪获取结果（1h内）。流式细胞仪检测获取数据。注意：实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照（凋亡诱导组）。352.早期细胞凋亡检测结果细胞凋亡细胞凋亡是动态事件，在不同时期展现不同的凋亡信号。早期——磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在细胞膜上，与PS结合的AnnexinV成为检测凋亡早期的最常用指标。除此之外，线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放，也被认为是凋亡的早期信号。中期——Caspase家族蛋白分布于各条凋亡通路上，是中期凋亡的指标。活化Caspase蛋白检测可以使用FLICA底物。晚期——DNA片段化是凋亡晚期的显著特征。通过TUNEL法对断裂的DNA片段进行标记。36凋亡的途径Caspase-8外源性TNF-alpha/FAS受体ResponsetoenvironmentalcuesCaspase-9内源性细胞色素C的释放DNA损伤或细胞周期阻滞Caspase-3/7关键的执行蛋白MultiCaspasecaspases1,3,4,5,6,7,8&9的检测Caspase家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程中心点。GuavaIncyteIC50/EC50自动分析IC50即半数抑制浓度，是指一种药物能将细胞生长、病毒复制等抑制50%所需的浓度。EC50即半数效应浓度，是指引起受试对象50%个体产生一种特定效应的药物剂量。使用GuavaIncyte软件，可以自动进行IC50/EC50计算和曲线绘制。3839抗体表达 多样本单指标检测40+抗体表达 多指标检测41Thankyou！