牛奶中酪蛋白和乳糖的分离及纯度测定

第 21卷 � 第 3期 大 学 化 学 2006年 6月 牛奶中酪蛋白和乳糖的分离及纯度测定 周夏衍 � 夏春兰 � 楚延锋 � 付晓平 � 邓立志 � 周鑫玉 (武汉大学化学与分子科学学院 � 武汉 430072) � � 摘要 � 分离牛奶中的酪蛋白和乳糖,并对其纯度进行测定。以此作为物理化学设计实验的部 分 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。 � � �牛奶中酪蛋白和乳糖的分离及鉴定 作为物理化学的设计实验, 其主要实验内容包括: ! 通过调节 pH分离牛奶中酪蛋白和乳糖; ∀ 试验酪蛋白和乳糖的鉴定方法; # 通过酪蛋白电 泳实验分离不同形态的酪蛋白。实验综合了分离技术、分光光度法、旋光度测定、电泳等内容。 �牛奶中酪蛋白和乳糖的分离及纯度测定 作为其中的一部分,具体内容如下。 1� 牛奶中酪蛋白的分离 � � 牛奶是一种乳状液,主要由水、脂肪、蛋白质、乳糖和盐组成。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白 质,是含磷蛋白质的复杂混合物。蛋白质是两性化合物,当调节牛奶的 pH达到酪蛋白的等电 点 ( pH= 4. 8)时, 蛋白质所带正、负电荷相等,呈电中性, 此时酪蛋白的溶解度最小, 会从牛奶 中沉淀出来,以此分离酪蛋白。因酪蛋白不溶于乙醇和乙醚,可用此两种溶剂除去酪蛋白中的 脂肪。 � � 取 50mL新鲜牛奶,在恒温水浴中加热至 40∃ ,边搅拌边慢慢加入 10%醋酸溶液,使牛奶 pH = 4. 8,放置冷却、澄清后,用尼龙布过滤酪蛋白。 (在滤液中加入少量粉状碳酸钙,留作乳 糖的分离。)依次用乙醇、乙醇和乙醚的等体积混合液、乙醚洗涤酪蛋白, 去除脂肪,待酪蛋白 充分干燥后称量其重量,并计算牛奶中酪蛋白的含量。 2� 牛奶中乳糖的分离 � � 乳糖是一种二糖,它由 D �半乳糖分子 C%上的半缩醛羟基和 D �葡萄糖分子 C4上的醇羟基 脱水通过 ��1, 4苷键连接而成。乳糖是还原性糖,绝大部分以 ��乳糖和 ��乳糖两种同分异构 体型态存在, ��乳糖的比旋光 [�] 20D = + 86&, ��乳糖的比旋光 [�] 20D = + 35&,水溶液中两种乳 糖可互相转变,因此其水溶液有变旋光现象。乳糖也不溶于乙醇,当乙醇混入乳糖水溶液中, 乳糖会结晶出来,从而达到分离的目的。 � � 将 1中加入碳酸钙的滤液置于蒸发皿中,用蒸汽浴浓缩至约 15mL,稍冷后,在热溶液中加 入约 90mL 95%乙醇,再加热, 使其混合均匀,趁热过滤,滤液应澄清。滤液移至锥形瓶中, 加 塞,放置 1~ 2天, 让乳糖充分结晶,过滤分离出乳糖晶体。用冷的 95%乙醇洗涤结晶, 一般应 对乳糖重结晶,干燥后称重,计算牛奶中乳糖的含量。 50 3� 酪蛋白的纯度测定 � � 用双缩脲法测定酪蛋白的含量 [ 1]。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红 色复合物,而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似,也能与铜离子在碱性环境中形成紫红 色复合物,其最大吸收光波长为 540nm。该复合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比, 而与蛋 白质的分子量及氨基酸组成无关。 � � 配制双缩脲试剂:取 1. 5g硫酸铜 ( CuSO4∋ 5H2O)和 6. 0g酒石酸钾钠 (NaKC4H4O6∋ 4H2O )溶 于 500mL蒸馏水中,搅拌加入 300mL的 10% NaOH溶液 (可另加 1g K I,以防止 Cu2+自动还原 成一价氧化亚铜沉淀 ) ,用水定容至 1000mL。此试剂可长期保存, 若有黑色沉淀需重配。 � � 酪蛋白 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的制作:取 7个容量瓶编号,按表 1操作。 表 1� 测定酪蛋白标准曲线的溶液配制 编号 V /mL标准酪蛋白溶液 蒸馏水 双缩脲试剂 1 0 6. 00 20. 00 2 1. 00 5. 00 20. 00 3 2. 00 4. 00 20. 00 4 3. 00 3. 00 20. 00 5 4. 00 2. 00 20. 00 6 5. 00 1. 00 20. 00 7 6. 00 0 20. 00 注: 标准酪蛋白溶液的配制:用 0. 05m ol /L NaOH溶液溶解酪蛋白 ( CP) ,加热或放置过夜助溶,配 制成 2mg /mL的酪蛋白溶液。 � 图 1� 酪蛋白溶液标准曲线 � � 充分混匀后, 在 60∃ 水浴中放置 30m in,冷却 至室温,用 V IS�7220分光光度计在 540nm波长下 测定其吸光度。以吸光度 A 540为纵坐标, 酪蛋白溶 液质量浓度为横坐标,绘制标准曲线 (图 1)。 � � 酪蛋白溶液标准曲线的拟合式为 A = 5. 711 ( 10 - 4 + 0. 2879 , R = 0. 99939, 其中 A 为吸光度, 为酪蛋白溶液质量浓度, R为相关系数。 � � 将从牛奶中分离的酪蛋白配成合适的浓度, 在上述相同条件下, 测定其吸光度。由标准曲线 计算纯酪蛋白的浓度, 与实际浓度比较, 计算从牛 奶中分离出来的酪蛋白的纯度。 � � 测定从牛奶中分离的酪蛋白的纯度一般在 90%以上。 4� 乳糖的纯度测定 � � 不同浓度的乳糖溶液具有不同的旋光度, 其旋光度与浓度成正比。因乳糖具有变旋光现 象,其溶液需放置数小时或加入 2滴浓氨水,使之达到平衡,再测定旋光度。 � � 配制不同浓度的标准乳糖溶液, 放置过夜, 用 341旋光仪测定其旋光度。乳糖为分析纯, 含一个分子结晶水, [ �] 25D = 52&。以旋光度为纵坐标, 乳糖溶液质量浓度为横坐标, 绘制标准 51 � 图 2� 乳糖溶液标准曲线 曲线 (图 2)。 � � 乳糖溶液标准曲线的拟合式为 �= - 0. 006 + 0. 0528 , R = 0. 9999, 其中 �为旋光度, 为乳糖溶 液质量浓度, R为相关系数。 � � 将从牛奶中分离的乳糖配制成合适的浓度, 先 测定其变旋光,后加入 2滴浓氨水摇匀,静置 20m in 后,测定平衡时的旋光度。由标准曲线计算纯乳糖 的浓度,与实际浓度比较, 计算从牛奶中分离出来 的乳糖的纯度。 � � 测定从牛奶中分离的乳糖的纯度一般在 90% 以上。 5� 实验注意事项 � � ! 酪蛋白等电点随温度不同而变化,等电点 pH为 4. 6~ 4. 8。分离酪蛋白时, 边加醋酸, 边搅拌,边测 pH, 同时观察沉淀。开始快搅拌, 接近等电点时, 应慢搅拌。 � � ∀ 酪蛋白沉淀用 200目的尼龙布过滤比较好,同时进行抽滤。用滤纸很难过滤;而用纱 布过滤,酪蛋白容易粘在其上。 � � # 用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀时,应将酪蛋白捣碎,并在溶剂中搅拌、浸泡, 充分洗净 脂肪。纯净的酪蛋白应为白色,若发黄表明脂肪未洗干净。 � � )用双缩脲法测定酪蛋白的含量时,应使酪蛋白与双缩脲试剂反应完全,否则测量结果 不准。 � � ∗ 首次结晶出来的乳糖含有杂质, 一般需要重结晶, 否则乳糖难以溶解,且溶液混浊, 测 定的旋光度不准。 � � +测定乳糖的平衡旋光度时,应放置数小时或加入 2滴浓氨水, 待平衡后再测。 参 � 考 � 文 � 献 1� 李如亮. 生物化学实验. 武汉:武汉大学出版社, 1998 � � (上接第 49页 ) 参 � 考 � 文 � 献 1� 高鸿.分析化学前沿.北京:科学出版社, 1991 2� 陈炳稔,何广平,凌莫育.应用化学, 1997, 14 ( 6) : 75 3� 陈炳稔,何广平,刘小珠.化学通报, 1998( 10) : 43 4� 赵振国,顾惕人.化学学报, 1983, 41 ( 12) : 1091 5� H e Guangp ing, Ch en B in ren. Ch in ese Journa l of R ea ctiv eP olym ers, 2001, 10( 2) : 154 52