第三章　植物转基因技术

第三章　植物转基因技术 （一）植物基因转化受体系统 植物基因转化受体系统具备的条件： *​ ①再生能力:易于再生，高再生频率，良好重复性 *​ ②遗传稳定性：不影响受体细胞分裂分化，并能将外源基因稳定遗传给后代。 *​ ③外植体来源：转化频率低外植体来源丰富。 *​ ④对选择条件敏感：现在多用抗生素。 *​ ⑤对农杆菌侵染有敏感性 *​ 目前人们所常用的植物转化受体系统的细胞(或组织)类型及相应的转化方法见表4—1。 细胞（或组织）类型 转化方法 1）叶片和茎段等（包括子叶和胚轴） 农杆菌介导，基因枪等 2）原生质体 电击法、PEC、脂质体、微注射等 3）愈伤组织和悬浮培养细胞 基因枪、超声波等 4）为成熟胚和分生组织 农杆菌、基因枪、超声波等 5）花粉 基因枪、浸泡法 6）子房或胚珠 花粉管通道、子房注射等 （二）植物基因转化方法 *​ 目前已发展了许多用于植物基因转化的方法，这些方法可分为3大类： *​ 一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。农杆菌介导和病毒介导就属于这种方法。 *​ 第二类为基因直接导入法，是通过物理或化学方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因转化法、电激法、超声波法、显微注色法和激光法等化学法有PEG介导转化和脂质体法等。 *​ 第三类为种质法。包括花粉通道法、生殖细胞浸染法、子房注色法等。 *​ 作为植物基因转化的载体，必须有两种功能： *​ 一是作为媒介将外源基因导入到植物细胞中，并且整合至宿主细胞的基因组DNA上； *​ 二是它能提供寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。 *​ 1 农杆菌介导的转化 *​ 20世纪初，Smith等(1907)发现根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，能够感染许多双子叶植物的受伤组织，引起冠瘿瘤。即使去除细菌，这种瘤状组织仍能在无激素培养基上继续生长，并能合成—种特有的物质——冠瘿碱。研究发现，冠瘿瘤的形成是由于在根癌农杆菌中存在着一种致瘤质粒(tumour-inducing plasmid)，简称Ti质粒。在农杆菌侵染植物的过程中，Ti质粒上的一段DNA序列能够从农杆菌细胞中转移到植物细胞，并插入植物的基因组中。这一段DNA序列叫做转移DNA(Transfer DNA)，简称T-DNA。在T-DNA序列上带有植物激素基因和冠瘿碱合成酶基因。这样，插入T-DNA序列的植物细胞就不断合成植物激素和冠瘿碱。这是一种天然的基因转移途径，通过这一途径细菌的基因被转入植物基因组。 Ti质粒一部分DNA叫转移DNA (transfer DNA，T-DNA)，当农杆菌感染植物时，T-DNA便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱(opine)，作为农杆菌的碳源和氮源。 农杆菌感染产生冠缨瘤 *​ 另一种土壤细菌一发根农杆菌(A.rhizogenes)也是由于存在着带有T-DNA的诱根质粒(rootinducingplasmid，简称Ri质粒)，才能感染植物，使T-DNA整合到植物基因组中，合成一系列与发根有关的基因产物，使植物产生“毛状根”病 *​ 1.1 农杆菌的结构特点 *​ Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti 质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类，Ti 质粒可分为4 类： *​ 章鱼碱型(octopine) *​ 胭脂碱型(nopaline) *​ 农杆碱型(agropine) *​ 农杆菌素碱型(agrocinopine)。 *​ （3）Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移； *​ （4）Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。 1.2 农杆菌的转化机制 1.3 农杆菌优点 *​ 该转化系统模仿天然转化载体系统，成功率高，效果好。 *​ 机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广。 *​ T-DNA区可容纳片段大（50Kb) *​ T-DNA上有引导DNA转移和整合的序列，以及功能启动子和转录信号 *​ 外源基因不但可以表达还可接不同的启动子，可在不同组织器官中特异表达 *​ 单拷贝多，遗传稳定性好。 1.4 转化方法 *​ 农杆菌转化首先 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 植物外植体能够产生乙酰丁香酮或其它能够诱导Vir基因的活性物质（单子叶作物很难）。其次是农杆菌能够接近具有不定芽或体细胞胚再生能力的感受态植物细胞。 *​ 可用于农杆菌转化的外植体种类很多，从单细胞(通常是原生质体)、悬浮培养细胞和愈伤组织(未分化的胚性细胞)、薄壁细胞层、组织切片(如萝卜韧皮部和马铃薯块茎薄壁组织)到各种植物器官，如叶片、根、茎和花组织的切段等。　　　　 *​ 目前常用的农杆菌转化方法有以下几种。 *​ (1)叶圆片法 该方法是由Horsch等(1985)建立的，并已被成功地用于烟草、番茄、矮牵牛和杨树等植物的转化。其步骤是用打孔器取得叶圆片，在过夜培养并调整到合适浓度的农杆菌菌液中浸数分钟，置于培养基上共培养2-3天，再转移到含有选择剂的培养基上，使转化细胞直接再生植株。用烟草等的悬浮培养细胞对叶圆片进行看护培养，可大大提高转化频率。叶圆片法经过改良可以用于茎段、叶柄和萌发种子等其它外植体的转化。 *​ (2)共培养法 也就是把转化外植体，如原生质体、茎段、幼胚、悬浮培养细胞等与农杆菌在一起培养24—48h，用无菌水冲洗数次，洗去农杆菌，将材料转入含有抑菌剂(如cefotaxim等)的培养基中培养。选择转化性。 *​ (3)直接接种法 取对数生长期的农杆菌用接种针直接接种离体培养枝条，或剪去枝条顶端用吸管等直接滴注农杆菌侵染。感染后，取瘤状组织或毛状根进行继代培养，选择转化体。这种方法简便、实验周期短，因培养基不与农杆菌直接接触，故污染较少。 2病毒介导基因转化 *​ 病毒侵染细胞后把其DNA 导入寄主细胞，并且这些病毒DNA 能在寄主细胞中进行复制和表达。其本身就是一种潜在的基因转化系统。因此，病毒可以作为植物转基因的一种载体。随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视。因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。 *​ 在已知的300 多种植物病毒中，单链RNA 病毒约占91%左右，双链DNA 病毒、单链DNA病毒各占3%左右。RNA不太适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。 *​ 目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花斑病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)和番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus, TGMV)。 *​ 以病毒核酸分子为基础构建载体，可以直接侵染整体植株，而且病毒在植物体内可以扩散和复制，表达水平较高。 *​ 存在的问题： *​ 插入病毒基因组的外源基因经过几个侵染周期后就叫能被清除； *​ 而且插入的片段对病毒本身的活性有时会产生干扰，以致丧失侵染能力； *​ 病毒的核酸分子一般存在于植物染色体之外，不能通过有性生殖而遗传。 *​ 此外，还存在寄主限制等问题 3 化学诱导DNA转化 *​ （1）PEG介导基因转化 *​ 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种水溶性的化学渗透剂，分子质量1500～6000，pH4.6～6.5，因多聚程度不同而异。PEG法的原理是它可使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性的改变，从而诱导原生质体摄取外源基因DNA。 *​ 在PEG 转化过程中，常需加入磷酸钙，这是因为磷酸钙可与DNA结合形成DNA-磷酸钙复合物而使DNA 沉积在原生质体的膜表面，并促进细胞发生内吞作用。此外，高pH 可诱导外源DNA分子的摄取。因此，高PH和高Ca离子浓度是诱导原生质体摄取外源DNA的方法之一。 *​ PEG 转化的基本步骤包括：①外源目的基因的制备；②原生质体制备；③目的基因和原生质体的转化培养；④转化体的鉴定及再生植物培养。 *​ PEG 转化法操作简单、成本低、无需昂贵的基因转化仪器；所得到的转化体中，嵌合体很少；受体植物不受种类的限制，对已建立了原生质体再生体系的植物都可采用；并且结果比较稳定，重复性好。 *​ 但由于建立作物原生质体再生系统较为困难，加之PEG转化法对原生质体活力的有害作用，使转化率低，一般在10-5～10-3之间。将PEG 转化法与电击法、脂质体法和激光微束法等技术结合使用，可使转化率大大提高。 *​ （2）脂质体介导转化法 *​  脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，可以将 DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或原生质体的吞噬过程，把外源 DNA 转运到细胞内。此方法的优点是包在脂质体内的 DNA可免受细胞内核酸酶的降解，所以可直接转化外源 DNA。 4物理诱导DNA直接转化 *​ （1） 基因枪转化法 *​ 基因枪(particle gun)介导转化法又称微弹轰击法，是指利用火药爆炸、高压气体和高压放电作为驱动力(这一加速设备称为基因枪)，将载有目的基因的金属颗粒加速，高速射入植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出新的植株。 *​ 美国Cornell 大学最早研制了火药基因枪。1990 年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000 系统。此后，高压放电、压缩气体驱动等各种类型的基因枪相继出现，并在实际应用中得到不断改进和发展，使基因枪转化法成为继农杆菌介导转化法之后又一广泛应用的转化技术。根据动力系统，可将基因枪分为3 种类型。第一类是利用火药爆炸力作为加速动力；第二类是以高压气体作为动力；第三类是以高压放电作为驱动力。 *​ 其具有如下优点： *​ ①无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用； *​ ②可控度高，操作简便迅速，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞； *​ ③受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分生组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击； *​ ④可将外源基因导入植物细胞的细胞器，并可得到稳定表达。正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器等。 *​ 缺点 *​ 基因枪转化成本高；嵌合体比率大；遗传稳定性差。此外，通过基因枪法整合进植物细胞基因组中的外源基因通常是多拷贝的，易导致基因沉默。 *​ 转化原理 *​ 这种方法是在微粒表面衣裹DNA，然后用粒子加速器，高速粒子可以穿入各种组织或细胞，从而完成DNA的输送。 *​ 这一技术对难再生植物转基因有用 *​ 尽管基因枪有各种不同的类型，但基因枪转化的基本步骤如下： *​ ①受体细胞或组织的准备和预处理； *​ ②DNA微弹的制备； *​ ③受体材料的轰击； *​ ④轰击后外植体的培养和筛选 *​ （2）电击法 *​ 电击法(eletroporation)也称电穿孔法，其原理是利用高压电脉冲作用在原生质体上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源目的基因的摄入。随着技术的改进，并与化学法结合，目前该法的转化率可高达1.2%。 *​ 电击法的一般操作程序如下：将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中培养1～2 周之后，选择已转化的细胞，作进一步的分化培养，最后获得转化的再生植物。 *​ 电击法的优点是操作简便，特别适合于瞬间表达研究。缺点是必须经过原生质体培养，加上电穿孔易造成原生质体损伤，使其再生率降低。将电击法与PEG 转化法、脂质体法和激光微束法等技术结合使用及不断改进技术，都可有效提高转化率。 *​ (3)超声波处理转化法 *​ 超声波处理细胞时可击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA 进入细胞。超声波处理转化法的转化率较高，并且利用超声波处理可以避免使用电穿孔转化时高电压脉冲对细胞的损伤，有利于细胞存活，目前主要用于微生物细胞的基因转化 *​ (4)注射转化法 *​ 这是一种利用注射仪把外源 DNA 直接注入细胞的转基因方法，可用于动植物的外源 DNA的转化。这种方法操作较为繁琐耗时，但其转化效率很高，以原生质体作为受体细胞，平均转化率达 10％～20％，甚至高的可达 60％以上，并且可以把外源 DNA直接注入细胞器。 *​ (5)激光微束穿孔转化法 *​ 此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束照射受体细胞，可导致细胞膜的可逆性穿孔。根据这一原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源进行照射，导致细胞膜穿孔，处于细胞周围的外源 DNA分子随之进入细胞。这种方法操作简便快捷；基因转移效率高；无宿主限制，可适用于各种植物细胞、组织、器官的转化操作，并且由于激光微束直径小于细胞器，可对线粒体和叶绿体等细胞器进行基因操作。 5种质系统介导基因转化 *​ 以植物自身的种质细胞为媒介，特别使植物的生殖系统的细胞(花粉、卵细胞、子房和幼胚等)以及细胞的结构，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的技术称为种质转化系统(germ line transformation)，该技术也称为生物媒体转化系统或整株活体转化(in planta *​ transformation)。该技术具有下述特点： *​ ①目的DNA可以是裸露的DNA，也可以是总DNA或重组质粒DNA，还可以是某些DNA 片断； *​ ②转化过程依靠植物自身的种质系统或细胞结构来实现，不需要细胞分离、组织培养和再生植株等复杂技术； *​ ③方法简便易行，并与常规育种紧密结合。它已发展成一种颇具潜力的转化体系。 *​ 目前常用的种质系统转化法有以下几种： *​ （1） 花粉管通道法 *​ 花粉管通道法(pollen-tube pathway)是由中国科学院周光宇等(1983)建立，并在长期科学研究中发展起来的。 *​ 该法的主要原理是：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 *​ 花粉管通道法的基本程序包括： *​ ①外源DNA(基因)的制备； *​ ②根据受体植物的受精过程及时间，确定导入外源DNA(基因)的时间及方法； *​ ③将外源DNA(基因)导入受体植物； *​ ④转基因植株目标性状鉴定及分子检测。 *​ 花粉管通道法最大优点： *​ 不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 *​ 它的受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，避免了原生质体再生以及组织培养过程中可能导致的染色体变异或优良农艺性状丧失等问题，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。 *​ (2)生殖细胞浸泡法 *​ 所谓浸泡转化(imbibition transformation)法就是指将种子、胚、胚珠、子房、幼穗甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用可将外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。 *​ 浸泡转化法的原理： *​ 利用植物细胞自身的物质运转系统将外源DNA 直接导入受体细胞。关于植物运输系统的结构与功能已有很多研究。现已 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 植物细胞至少可以通过以下途径将外源DNA 吸入细胞内： *​ ①外源DNA 可以通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统而被运输到每个细胞； *​ ②植物细胞也可以通过内吞作用将外源DNA摄入细胞内； *​ ③植物组织中传递细胞的膜透性改变也为大分子物质透过细胞膜提供了机会。尤其是在生殖细胞、胚胎细胞及分生细胞中，外源DNA进入细胞的机会更大。 *​ 优缺点： *​ 浸泡转化法是植物转基因技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法。它不需要昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，并且此法容易推广普及。 *​ 但该法的转化率较低，重复性较差，而且筛选和检测也比较困难。