不同温度_pH值对鳗鱼消化道蛋白酶和淀粉酶活性的影响

不同温度、pH 值对鳗鱼消化道蛋白酶和淀粉酶活性的影响 王 琨1 , 叶继丹1 ,2 ,3 3 　(1. 集美大学水产生物技术研究所 ,福建厦门 361021 ;2. 福建省厦门市饲料检测与安全评价重点实验室 ,福建厦门 361021 ;3. 福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室 ,福建厦门 361021) 摘要　[目的] 了解美洲鳗的消化生理特点 ,为美洲鳗的饲料配制和合理投食提供科学依据。[方法] 以 30 g 左右的健康美洲鳗幼鱼为 试验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ,取胃、肠和肝胰脏组织进行匀浆、离心 ,上清液作为待测酶液 ,分别测定温度 20～60 ℃和 pH 值 1. 0～12. 0 下 ,3 种消化组织中 蛋白酶和淀粉酶活性的变化 ,研究不同温度、pH值对美洲鳗胃、肠和肝胰脏中蛋白酶和淀粉酶活性的影响以及在不同消化器官中这些 消化酶的活性大小变化规律。[结果]美洲鳗胃、肠和肝胰脏蛋白酶的最适温度和最适 pH 值分别为 55、55、50 ℃和 2. 0、7. 5、7. 5 ,美洲鳗 胃、肠和肝胰脏淀粉酶的最适温度均为 40 ℃,最适 pH值分别为 4. 0、7. 0、7. 0。在反应温度模式下 ,美洲鳗蛋白酶活性为胃 > 肠 > 肝胰 脏 ,淀粉酶活性为肝胰脏 > 肠 > 胃。在 pH值模式下 ,蛋白酶活性为肠 > 胃 > 肝胰脏 ,淀粉酶活性为肝胰脏 > 肠 > 胃。[结论]美洲鳗胃 和肠中蛋白酶活性较高 ,而淀粉酶活性较低。美洲鳗的 A/ P 值均小于 1 ,说明其为肉食性或偏肉食性。 关键词　美洲鳗 ;蛋白酶活性 ;淀粉酶活性 ;温度 ;pH 中图分类号　Q41 　　文献标识码　A 　　文章编号　0517 - 6611(2007) 33 - 10727 - 03 Effects of Different Temperatures and pH on the Protease and Amylase Activities in the Digestive Tract of Anguilla rostrata WANG Kun et al 　(Fisheries College & Institute of Aquaculture Biotechnology ,Jimei University ,Xiamen ,Fujian 361021 ) Abstract 　[Objective] The study aimed to know the digestive physiological characteristics of Anguilla rostrata ,and provide scientific basis for its feed for2 mulation and reasonably feeding. [Method] With healthy juvenile A . rostrata weighted about 30 g as tested material ,the tissues from stomach ,intestine and hepatopancreas were made for homogenate and centrifuge. With the obtained supernatants as tested enzyme liquid ,the changes of protease and amylase ac 2 tivities in 3 kinds of digestive tissues under the reaction temperature of 20～60 ℃and pHof 1. 0～12. 0 were determined resp. The effects of different tem2 peratures and pH on the protease and amylase activities in stomach ,intestine and hepatopancreas of A . rostrata and the activities and change law of these digestive enzymes in different digestive organs. [ Result ] The optimum temperatures and pH were 55 ,55 ,50 ℃and 2. 0 ,7. 5 ,7. 5 resp. in turn for protease , the optimum temperatures were all 40 ℃and the optimum pH were 4. 0 ,7. 0 ,7. 0 resp.for amylase in stomach ,intestine and hepatopancreas of A . rostra2 ta. Under the mode of reaction temperature ,the order of protease activity in different peptic was stomach > intestine > hepatopancreas ,the order of amy 2 lase activity was hepatopancreas > intestine > stomach. Under model of pH ,the order of protease activity was intestine > stomach > hepatopancreas , and that of amylase was hepatopancreas > intestine > stomach. [ Conclusion] The protease activity of A. rostrata were higher in stomach and intestine , while the amylase activity were lower. The A/ P value of A . rostrata were all less than 1 ,which indicated that it was carnivorous or partial to be carnivo 2 rous. Key words 　Anguilla rostrata ;Protease activity ;Amylase activity ;Temperature ;pH value 基金项目　公益性行业 (农业)科研专项经费项目 (nyhyzx072043) ;福建 省青年创新基金项目 (2005J036) ;集美大学科研基金项目 (F05017) 。 作者简介　王琨 (1967 - ) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,硕士 ,副研究员 ,从事 水产养殖研究。3 通讯作者 ,E2mail :yjdwk @sina. com。 收稿日期　2007208217 　　研究鱼类消化器官中消化酶的活性 ,是了解鱼类消化生 理机能的重要内容之一。温度和 pH值是影响鱼类消化酶活 性的重要因子。目前 ,国内外已有很多关于不同温度、pH 值 对鱼类消化酶活性影响的报道[1 - 8] 。 美洲鳗 ( A. rostrata)原产于美洲东海岸 ,外形和习性接近 日本鳗。美洲鳗肉质及体色均佳 ,苗价便宜 ,成活率高 ,经济 效益高 ,其生物学特性和养殖学已有一些研究[9 - 11] ,但关于 不同温度、pH值对美洲鳗消化酶活性的影响 ,目前仍未见报 道。与日本鳗 ( A . japonica) 和欧洲鳗 ( A . Anguilla) 相比 ,美洲 鳗苗种价格低 ,对水质要求不高 ,具有很大的养殖潜力[12] 。 笔者以美洲鳗为实验材料 ,研究了反应温度、pH 值对其 胃、肠及肝胰脏中蛋白酶、淀粉酶活性的影响 ,以及在不同消 化器官中这些消化酶的活性大小与变化规律 ,以期了解美洲 鳗的消化生理特点 ,为美洲鳗的饲料配制和合理投食提供科 学依据。 1 　材料与方法 1. 1 　实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 　健康美洲鳗幼鱼 ,于 2006 年 8 月购于福建 省平和久荣养鳗场 ,其平均体重为 30 g 左右。 1. 1. 1 　反应温度设置。在 25～60 ℃测定蛋白酶活性 ,以 5 ℃为 1 个梯度 ,共设 8 个梯度 ;在 20～55 ℃测定淀粉酶活性 , 以 5 ℃为 1 个梯度 ,共设 8 个梯度。每个梯度设 3 个重复。 反应的 pH值均为 7. 5 ,采用 0. 2 mol/ L 磷酸氢二钠 - 柠檬酸 缓冲液进行调节。 1. 1. 2 　pH系统设置。在 pH 值 1. 0～10. 0 下测定胃消化酶 活性 ,以pH值1. 0 为1 个梯度 ,共设10 个梯度 ;在pH值5. 0、 5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、10. 0、11. 0、12. 0 下测定肠 和肝胰脏消化酶活性 ,共设12 个梯度。每个梯度均设3 个重 复。反应温度均为 30 ℃,由恒温振荡器控制。 pH值 1. 0～2. 0 用 0. 2 mol/ L 柠檬酸 - 盐酸缓冲液调节 , pH值 3. 0～9. 0 用 0. 2 mol/ L 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液调 节 ,pH值 10. 0～12. 0 用 0. 2 mol/ L 磷酸氢二钠 - 氢氧化钠缓 冲液调节。pH值用精密酸度计校正。 1. 2 　样品的制备 1. 2. 1 　取样。30 尾健康美洲鳗幼鱼 ,用MS2222 麻醉 ,解剖鱼 体 ,分离出胃、肠道及肝胰脏组织 ,剥离脂肪及结缔组织 ,用 4 ℃左右的生理盐水冲洗 ,用滤纸轻轻揩干 ,置于 - 25 ℃冰箱 中保存备用。 1. 2. 2 　待测酶液的制备。组织样品分别称重后剪碎 ,用其 重量 10 倍 (胃 20 倍)体积的 4 ℃缓冲液匀浆 ,匀浆液在 4 ℃ 离心 15 min(10 000 r/ min) ,将上清液置于 4 ℃冰箱中保存备 用 (24 h 内 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 完毕) 。 1. 3 　蛋白酶活性的测定 　以酪蛋白为底物 ,用福林 - 酚试 剂显色 ,测定反应液 OD 值。蛋白酶活性定义 :在一定的温 度和 pH值下 ,1 g 组织蛋白 1 min 水解酪蛋白产生 1μg 酪氨 酸为 1 个酶活性单位[μg/ (g·min) ]。 1. 4 　淀粉酶活性的测定 　以可溶性淀粉为底物 ,用 3 ,52二 安徽农业科学 ,Journal of Anhui Agri . Sci . 2007 ,35(33) :10727 - 10729 　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李菲菲 硝基水杨酸显色 ,测定反应液 OD 值。淀粉酶活性定义 :在 一定的温度和 pH 值下 ,1 g 组织蛋白在 30 min 内每水解 10 mg 淀粉为 1 个酶活性单位[mg/ (g·30 min) ]。 1. 5 　组织匀浆蛋白含量的测定 　用考马斯亮兰测定试剂盒 测定。 2 　结果与分析 2. 1 　反应温度对蛋白酶活性的影响　从图1 可见 ,在25～50 ℃,肝胰脏中蛋白酶活性随温度升高而增加 ,在50～60 ℃,肝 胰脏中蛋白酶活性随温度升高而下降 ,最大蛋白酶活性温度 为 50 ℃;胃、肠中蛋白酶活性在 25～55 ℃随温度的上升而增 加 ,在 55～60 ℃随温度的上升而下降 ,最大蛋白酶活性温度 为 55 ℃。3 种组织中蛋白酶活性随温度的变化趋势相同 ,但 活性不同 ,其蛋白酶活性为胃 > 肠 > 肝胰脏 ,其中 ,肝胰脏中 蛋白酶活性明显比其他两种组织中的低。 图 1 　温度对消化道蛋白酶活性的影响 2. 2 　反应温度对淀粉酶活性的影响　从图2 可见 ,在20～55 ℃,胃、肠和肝胰脏淀粉酶活性的最适温度均为 40 ℃。在 20 ～40 ℃,淀粉酶活性随温度升高而上升 ;在40～50 ℃,随温度 升高而下降。随温度的变化 ,3 种消化器官淀粉酶活性变化 趋势相同 ,但不同消化器官中淀粉酶活性不同 ,淀粉酶活性 为肝胰脏 > 肠 > 胃 ,其中肝胰脏中淀粉酶活性明显高于胃、 肠中淀粉酶活性 ,而胃、肠中淀粉酶活性差异不明显。 图 2 　温度对消化道淀粉酶活性的影响 2. 3 　不同 pH值对蛋白酶活性的影响 　从图 3 可见 ,在 pH 值 1. 0～10. 0 ,胃蛋白酶活性在 pH值 2. 0 时出现峰值。在 pH 值 5. 0～12. 0 ,肠中蛋白酶活性在 pH 值 7. 5 处有 1 个最大峰 值 ,并在 pH值 10. 0 处出现 1 个次峰。与肠中蛋白酶活性变 化趋势类似 ,在 pH值 5. 0～12. 0 ,肝胰脏中蛋白酶活性分别 在 pH值 7. 5 和 9. 0 处出现峰值 ,但 pH值 9. 0 处的峰值较小。 随 pH值变化 ,肠、肝胰脏中蛋白酶活性变化趋势相似 ,而与 胃中蛋白酶活性的变化趋势不同 ,肝胰脏中蛋白酶活性比肠 中的要低。 2. 4 　不同 pH值对淀粉酶活性的影响 　从图 4 可见 ,在 pH 值 1. 0～10. 0 ,当 pH 值为 4. 0 时 ,胃中淀粉酶活性最大。在 pH值 5. 0～12. 0 ,肠和肝胰脏中淀粉酶活性最高的 pH 值均 为 7. 0。3 种组织中的淀粉酶活性不同 ,其淀粉酶活性为肝 胰脏 > 肠 > 胃 ,其中以肝胰脏中淀粉酶活性最高 ,胃和肠淀 粉酶活性均较低。 图 3 　pH值对消化道蛋白酶活性的影响 图 4 　pH值对消化道淀粉酶活性的影响 3 　讨论 3. 1 　反应温度对消化酶活性的影响 　实验结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 ,美洲 鳗胃、肠和肝胰脏蛋白酶的最适温度分别为 55、55、50 ℃,而 淀粉酶的最适温度均为 40 ℃。梅景良等[1]报道 ,黑鲷蛋白 酶和淀粉酶的最适温度分别为 50 和 40 ℃。叶元土等[2]报 道 ,南方大口鲶胃、肠和肝胰脏蛋白酶最适温度分别为 33、45 和 39 ℃,淀粉酶最适温度分别为 45、41 和 39 ℃。长吻鱼危胃、 肠和肝胰脏的蛋白酶最适温度分别为 39、41 和 36 ℃,淀粉酶 最适温度分别为 45、39 和 36 ℃。该实验结果与他们的结论 相比 ,淀粉酶最适温度基本相似 ,蛋白酶最适温度却高出 5～ 19 ℃,可能是不同鱼类消化酶之间的差异引起的 ,也可能是 实验设定的酶促反应条件不一致造成的。 3. 2 　pH值对消化酶活性的影响 　美洲鳗胃中蛋白酶的最 适 pH值为 2. 0 ,肠和肝胰脏中蛋白酶的最适 pH 值都为 7. 5 ; 胃中淀粉酶的最适 pH值为 4. 0 ,而肠和肝胰脏中淀粉酶的最 适 pH值均为 7. 0。该实验结果与梅景良等[1]报道的黑鲷胃 和肠中蛋白酶的最适 pH 值分别为 2. 0、7. 0 一致 ,但低于黑 鲷肝胰脏中蛋白酶的最适 pH 值 7. 5。叶元土等[2]测得的南 方大口鲶胃、肠和肝胰脏中蛋白酶的最适 pH 值分别为 2. 6、 7. 0 和 6. 2 ,淀粉酶的最适 pH 值分别为 5. 0、7. 0 和 6. 4 ;长吻 鱼危胃、肠和肝胰脏中蛋白酶的最适 pH 值分别为 3. 0、7. 4 和 6. 2 ,淀粉酶的最适pH值分别为 6. 6、7. 0 和 6. 6。除南方大口 鲶肠中淀粉酶和长吻鱼危肠中蛋白酶、淀粉酶的最适 pH 值与 82701 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007 年 笔者的实验结果基本一致外 ,其他结果与笔者的实验结果不 一致 :美洲鳗的肠、肝胰脏中蛋白酶最适 pH值处于偏碱性范 围 ,而南方大口鲶和长吻鱼危的肝胰脏中蛋白酶与淀粉酶的最 适 pH值处于偏酸性范围 ,可能是实验鱼的种类不同所致。 如图 3 所示 ,除了在 pH值 7. 5 有最大峰值外 ,肝胰脏中 蛋白酶在 pH值 9. 0 ,肠中蛋白酶在 pH值 10. 0 出现 1 个较小 的峰值。可能在美洲鳗肠和肝胰脏内存在两类性质不同的 蛋白酶。 值得指出的是 ,鳗鱼消化酶活性是在离体条件下测定 的 ,其最适温度均高于栖息水温 ,尤其是蛋白酶。实际情况 并非如此 ,这是由测定条件决定的。消化酶的最适温度是一 个不易确定的值 ,常受其他因素的影响。特别是酶促反应时 间对酶活性的影响较大。一般认为 ,反应时间越长 ,消化酶 的最适温度越低[1] ,这解释了在自然水温下鱼体消化酶活性 是与较长的消化作用时间相适应的。因此 ,研究消化酶的最 适温度只在一定条件下才有意义 ,但这类研究可以在一定程 度上反映消化酶的性质和温度对这些消化酶活性影响的变 化规律。 3. 3 　不同消化器官消化酶活性的差异 　在反应温度模式 下 ,美洲鳗蛋白酶活性为胃 > 肠 > 肝胰脏 ,淀粉酶活性为肝 胰脏 > 肠 > 胃。在 pH 值模式下 ,蛋白酶活性为肠 > 胃 > 肝 胰脏 ,淀粉酶活性为肝胰脏 > 肠 > 胃。这与梅景良等[1]报道 的黑鲷不同消化器官中蛋白酶和淀粉酶活性大小顺序基本 一致 ,而与沈文英等[3]研究得出的澳洲宝石鱼蛋白酶和淀粉 酶活性大小顺序均是肠道 > 胃 > 肝胰脏的结论不一致。 由此可见 ,美洲鳗 3 种消化器官中消化酶活性存在较大 差异。蛋白酶活性在胃和肠都较高 ,说明胃和肠是美洲鳗消 化蛋白质的主要场所。值得指出的是 ,胃和肠中淀粉酶活性 均明显比肝胰脏中的低 ,与蛋白酶在这 3 种消化器官中的表 现恰好相反 ,提示美洲鳗对饲料碳水化合物的消化力较弱。 Biesiot 等[13]曾采用淀粉酶/ 蛋白酶值 ( A/ P值)作为鱼类食性 划分的依据。A/ P 值高时 ,鱼的食性为植物食性或偏植物食 性 ;A/ P值低时 ,鱼的食性则为肉食性或偏肉食性。该实验 得出美洲鳗的 A/ P 值均小于 1 ,说明其食性为肉食性或偏肉 食性 ,因此 ,美洲鳗胃、肠中较低的淀粉酶活性是可预期的。 参考文献 [1 ] 梅景良 ,马燕构 ,张红星 ,等.夏、冬两季黑鲷消化酶活力的比较及反应 温度和 pH值对酶活力的影响[J ].海洋学报 ,2006 ,28(4) :167 - 171. 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(上接第 10726 页) 结果进一步证明了在 TCM2199 中单独添加发情牛血清是可 行的 ,与石德顺等[1 - 3]的报道一致。在生产实践中 ,胎牛血 清不易获得且价格昂贵。发情牛血清比较容易获得 ,适宜于 在牛胚胎体外生产中推广应用 ,但要注意的是 ,采集发情牛 血液时 ,采集牛数宜多 ,以保证所制备血清激素含量及相互 比例的稳定性。 　　表 2 　　表皮生长因子和激素对卵母细胞 IVM、IVF及 IVD 的影响 组别 卵母细 胞数 批次 成熟率 % 卵裂率 % 桑囊率 % ① 273 5 79. 49(31/ 39) a 56. 81(121/ 213) a 31. 40(38/ 121) a ② 260 5 82. 50(33/ 40) b 61. 43(129/ 210) b 31. 78(41/ 129) a ③ 277 5 83. 33(35/ 42) b 62. 21(135/ 217) b 33. 33(45/ 135) a 　　(2) EGF 对牛卵母细胞体外成熟及卵裂有良好的促进作 用 ,这与 Coskun 等报道的结果一致[4 - 6] 。现已证明 ,EGF 可 以促进多种动物如兔、牛、猪、鼠以及人等的卵子在体外成 熟。另有证据表明 ,EGF 通过刺激 FSH受体表达和孕酮产生 来调节颗粒细胞的活动[7] 。EGF 与 FSH 共同作用 ,可以促使 卵丘细胞分泌透明质酸 ,从而促进卵丘扩展 ,有利于精子穿 入卵丘。这说明 EGF 可能与促卵泡激素在体外成熟培养中 有一定协同作用 ,但可能是这种激素的添加量与 EGF 的添加 量不合适而导致促进效果不明显 ,对于 EGF 与激素间的相互 作用还有待于进一步研究。 参考文献 [1 ] 石德顺 ,卢克焕.肝素及血小板激活因子对牛卵母细胞体外受精的影 响[J ].广西科学 ,1996 ,3(3) :36 - 40. [2] 马云.牛卵泡卵母细胞体外成熟 ,体外受精及受精卵体外培养的研究 [D].杨凌 :西北农林科技大学 ,2001. [3] 卢晟盛 ,卢克焕.不同血清种类及其浓度对牛卵母细胞体外受精的影 响[J ].广西农业大学学报 ,1994 ,13(1) :21 - 26. [4] COSKUN S ,SANBUISSBO A ,LIN Y C ,et al. 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