口服精氨酸促进长骨线性生长的作用及机制的分析

复 旦 人 学 硕 1 学 位 论 文 S t u d y o n t h e e f f e c t a n d m e c h a n i s m o f o r a l a r g i n i n e i n i m P r o v i n g I i n e a r g r o w t h o f l o n g b o n e s A b s t r a c t O b j e c t i v e : ( 1 ) T o i n v e s t i g a t e a n d e v a l u a t e t h e e f f e e t o f o r a l L 一 a r g i n i n e o n i m P r o v i n g h e i g h t g r o w t h i n e h i l d r e n w i t h s h o r t s t a t u r e . ( 2 ) T O i n v e s t i g a t e t h e e f f e e t o f o r a l L 一 a r g i n i n e o n l i n e a r g r o w t h o f l o n g b o n e s a n d e x P l o r e t h e a e t i o n m e e h a n i s m ， f o c u s i n g o n t h e g e n e e x P r e s s i o n s r e l a t e d t o t h e h y P o t h a l a r n u s 一 P i t u i t a r y g r o w t h a x i s a n d n i t r i e o x i d e ( N O ) 一 e y e l i e g u a n o s i n e m o n o P h o s P h a t e ( e G M P ) P a t h w a y t h r o u g h t h e e x P e r i e n e e i n r a t s . ( 3 ) T o o b s e r v e d t h e e f f e e t o f o r a l a r g i n i n e o n h i s t o l o g i c a l s t r u e t u r e s a n d u l t r a s t r u e t u r e s o f t h e r a t ‘ 5 v i t a l o r g a n s a n d e v a l u a t e t h e s a f t y o f a r g i n i n e f o r t f C a t l n e f l t . M e t h o d s : ( l ) I n c l i n i e a l s t u d 又 4 5 e h i l d r e n w i t h s h o r t s t a t u r e w e r e g i v e n o r a l L 一 a r g i n i n e . B e f o r e a n d a f t e r t r e a t m e n t ， t h e h e i g h t · b o n e w i d t h ( B W ) \ b o n e m i n e r a l c o n t e n t ( B M C ) a n d b o n e m i n e r a l d e n s i t y ( B M D ) w e r e m e a s u r e d . T h e d a t a w e r e a n a l y s e d b y P a i r e d 一 s a m P l e s 1 t e s t . ( 2 ) T h e r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h e c o n t r o l g r o u P a n d t h e i n t e r v e n t i o n g r o u P . I n t h e e o n t r o l g r o u P : P h y s i o l o g i c a l s a l i n e w a s a P P l i e d f o r g a s t r i e P e r f u s i o n ， t o t a l l y f o r 4 w e e k s . I n t h e i n t e r v e n t i o n g r o u P : L 一 a r g i n i n e w a s a P P l i e d f o r g a s t r i e P e r f u s i o n ， t o t a l l y f o r 4 w e e k s . B o n e h i s t o m o 印 h o m e t r y a n a l y s i s w a s u s e d t o m e a s u r e g r o 叭 h P l a t e w i d t h ， m i n e r a l a p P o s i t i o n r a t e o f t h e t i b i a a n d t r a b e e u l a r b o n e v o l u m e f r a e t i o n ， o s t e o b l a s t s u r f a e e ， o s t e o c l a s t s u r f a e e o f t h e f e m u r . S e r u m g r o 认 t h h o r m o n e ( G H ) c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y . R e a l t i m e 一 P C R w a s u s e d t o m e a s u r e t h e g e n e e x P r e s s i o n s o f n e u r o n a l n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( n N O S ) ， s o l u b l e g u a n y l y l e y c l a s e a l ( s G C a l ) ， s o l u b l e g u a n y l y l e y e l a s e ( s G C p l ) ， c G M P 一 d e P e n d e n t P r o t e i n k i n a s e l l ( P K G l l ) ， g r o w t h h o r m o n e 一 r e l e a s i n g h o r m o n e ( G H R l l ) ， s o m a t o s t a t i n ( 5 5 ) i n h y P o t h a l a m u s a n d G H i n P i t u i t a r y . 认 七 s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e e t t h e P r o t e i n l e v e r s o f n N O S ， s G C a l a n d s G C p l i n h y P o t h a l a m u s . T h e d a t a w e r e a n a l y s e d b y 1 t e s t . ( 3 ) T h e r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h e e o n t r o l g r o u P a n d t h e i n t e n Z e n t i o n g r o u P . I n t h e e o n t r o l g r o u P : P h y s i o l o g i e a l s a l i n e w a s a P P l i e d f o r g a s t r i e P e r f u s i o n ， t o t a l l y f o r 1 2 w e e k s . I n t h e i n t e r v e n t i o n g r o u P : L 一 a r g i n i n e w a s a p P l i e d f o r g a s t r i e P e r f u s i o n ， t o t a l l y f o r 1 2 w e e k s . 复 日 _ 人 学 硕 l 学 位 论 文 A 丘 e r t r e a t m e n t ， t h e h i s t o l o g i e a l s t r u c t u r e s a n d u l t r a s t r u e t u r e s o f t h e e e r e b r a l c o r t e x 、 h y P o t h a l a m u s 、 P i t u i t a r y 、 h e a r t 、 l i v e r a n d k i d n e y w e r e o b s e r v e d b y l i g h t m i e r o s e o P y a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i e r o s e o P y . R e s u l t s : ( 1 ) A f t e r o r a l a d m i n i s t r a t i o n o f a r g i n i n e ， t h e g r o w t h v e l o e i t y 、 h e i g h t S D S 、 b o n e m i n e r a l c o n t e n t a n d b o n e m i n e r a l d e n s i t y w e r e i n e r e a s e d ( P < 0 . 0 5 ) . ( 2 ) A f t e r b e i n g i n t e r v e n e d w i t h o r a l a r g i n i n e ， t h e g r o w t h P l a t e w i d t h o f t i b i a a n d o s t e o b l a s t s u r f a e e o f f e m u r w e r e i n e r e a s e d ( P < 0 . 0 5 ) ， t h e s e r u m G H c o n e e n t r a t i o n w a s e l e v a t e d ( P < 0 . 0 5 ) ， t h e g e n e a n d P r o t e i n e x P r e s s i o n s o f n N O S ， s G C o l w e r e u P 一 r e g u l a t e d ( P < 0 . 0 5 ) ， t h e e x P r e s s i o n o f 5 5 m R N A w a s d o 帅 一 r e g u l a t e d ( P < 0 . 0 5 ) a n d t h e e x P r e s s i o n o f G H m R N A w a s s i g n i f i e a n t l y u P 一 r e g u l a t e d ( P < 0 . 0 1 ) . ( 3 ) T h e r e w a s n o s i g n i f i e a n t d i f f e r e n e e i n t h e h i s t o l o g i e a l s t r u c t u r e s a n d u l t r a t r u e t u r e s o f t h e e e r e b r a l c o r t e x 、 h y P o t h a l a r n u s 、 P i t u i t a r y 、 h e a l t 、 l i v e r a n d k i d n e y b e t w e e n t h e e o n t r o l g r o u P a n d t h e i n t e r v e n t i o n g r o u P . C o n c l u s i o n s : ( l ) O r a l a d m i n i s t r a t i o n o f a r g i n i n e e o u l d s P e e d u P h e i g h t g r o w t h a n d e n h a n c e b o n e m i n e r a l e o n t e n t a n d b o n e m i n e r a l d e n s i t y . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t a d v e r s e r e a c t i o n . ( 2 ) O r a l a r g i n i n e i m P r o v e d h e i g h t g r o w t h i n e h i l d r e n w i t h s h o r t s t a t u r e a n d m a d e b o n e m e t a b o l i s m i n a P o s i t i v e b a l a n e e . ( 3 ) O r a l a d m i n i s t r a t i o n o f a r g i n i n e e o u l d i m P r o v e l i n e a r g r o w t h o f l o n g b o n e s b y r e g u l a t i n g t h e e x P r e s s i o n s o f 5 5 、 G H m R N A a n d i n d u e i n g G H s e c r e t i o n ， P o s s i b l y v i a n N O S 一 N O 一 s G C 一 c G M P s i g n a l t r a n s d u e t i o n P a t h w a y . ( 4 ) T h e d o s e a n d t r e a t m e n t t i m e o f L 一 a r g i n i n e i n o u r s t u d y w e r e s a f t . I t h a d n o h a r m f u l e f f e e t s o n t h e v i t a l o r g a n s . K e y w o r d s : a r g i n i n e : n i t r i e o x i d e s y n t h a s e ; n i t r i e o x i d e : g r o w t h h o r m o n e ; s h o r t s t a t u r e : b o n e h i s t o m o r p h o m e t r y : h i s t o l o g i c a l s t r u c t u r e : u l t r a s t r u e t u r e C h i n e s e I i b r a r y c l a s s i f i e a t i o n : R 7 2 5 . 8 二 Q 4 2 6 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 、 ‘ 前 曰 随 着 经 济 的 快 速 发 展 ， 人 们 生 活 水 平 及 文 化 素 养 明 显 提 高 ， 儿 童 的 身 高 增 长 己 经 成 为 当 前 家 长 十 分 关 注 的 问 题 。 腺 垂 体 分 泌 的 生 长 激 素 ( G H ) 对 儿 童 身 高 增 长 起 着 关 键 作 用 。 G H 可 直 接 作 用 ， 亦 可 通 过 胰 岛 素 样 生 长 因 子 一 I ( I G F 一 I ) 间 接 促 使 软 骨 细 胞 、 成 骨 细 胞 增 殖 ， 胶 原 及 硫 酸 粘 多 糖 增 多 ， 同 时 伴 有 骨 矿 物 质 沉 积 ， 加 速 骨 形 成 ， 从 而 促 进 长 骨 线 性 生 长 「 ’ ] 。 身 材 矮 小 ， 但 其 长 骨 的 骨 干 与 骨 箭 尚 未 融 合 、 干 箭 端 的 软 骨 生 长 板 尚 存 的 患 儿 ， 临 床 上 可 采 用 药 物 治 疗 干 预 ， 促 进 其 身 高 的 增 长 。 皮 下 注 射 重 组 人 生 长 激 素 ( t h G H ) 对 促 进 患 儿 长 骨 的 线 性 生 长 ， 从 而 改 善 其 身 高 有 显 著 的 疗 效 。 然 而 r h G H 的 价 格 十 分 昂 贵 ， 非 大 多 数 家 庭 能 够 承 受 ， 限 制 了 其 的 临 床 应 用 ， 但 目 前 尚 缺 乏 真 正 有 效 的 能 替 代 r h G H 的 治 疗 方 法 。 研 究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 : 氨 基 酸 是 促 进 垂 体 G H 分 泌 的 潜 在 刺 激 因 子 。 其 中 ， L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 作 用 最 为 明 显 [ 2 ] 。 临 床 上 采 用 精 氨 酸 滴 注 可 促 进 腺 垂 体 释 放 G H ， 这 被 常 规 用 作 G H 激 发 试 验 ， 以 检 测 腺 垂 体 G H 的 储 备 功 能 。 在 这 一 药 理 作 用 的 启 示 下 ， 我 们 萌 生 了 采 用 精 氨 酸 口 服 ， 以 持 续 而 缓 和 地 刺 激 腺 垂 体 分 泌 G H ， 从 而 促 进 患 儿 身 高 增 长 的 想 法 。 本 课 题 首 先 以 左 旋 精 氨 酸 口 服 对 矮 小 儿 童 进 行 干 预 ， 通 过 比 较 治 疗 前 后 生 长 速 率 ( G V ) 、身 高 的 标 准 差 计 分 ( S D S ) 、 骨 宽 度 ( B W ) 、 骨 矿 含 量 ( B M C ) 及 骨 密 度 ( B M D ) ， 评 价 其 促 进 身 高 增 长 及 骨 形 成 的 作 用 。 为 进 一 步 探 讨 口 服 左 旋 精 氨 酸 ( L 一 精 氨 酸 ， L 一 a r g i n i n e ) 促 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 及 机 制 ， 本 课 题 采 用 骨 形 态 计 量 学 方 法 分 别 测 定 胫 骨 生 长 板 宽 度 ( G P ) 及 矿 化 沉 积 率 ( M A R ) ， 股 骨 骨 小 梁 体 积 百 分 数 ( B V / T V ， % ) 、 成 骨 细 胞 面 积 ( O b . S / B S ， % ) 及 破 骨 细 胞 面 积 ( O c . s / B S ， % ) ， 观 察 口 服 L 一 精 氨 酸 对 大 鼠 长 骨 线 性 生 长 的 促 进 作 用 ; 并 以 放 射 免 疫 法 测 定 血 清 生 长 激 素 ( G H ) 浓 度 ， 以 实 时 定 量 一 聚 合 酶 链 反 应 ( R e a l t i m e 一 P C R ) 检 测 下 丘 脑 神 经 型 一 氧 化 氮 合 酶 ( n N O S ) 、 可 溶 性 鸟 普 环 化 酶 a l ( s G C a l ) 、 可 溶 性 鸟 普 环 化 酶 日 l ( s G C p l ) 、 e G M p 依 赖 的 蛋 白 激 酶 H ( P K G H ) 、 生 长 激 素 释 放 激 素 ( G H R J 」 ) 、 生 长 抑 素 ( 5 5 ) 及 垂 体 生 长 激 素 ( G H ) 基 因 表 达 水 平 ， 以 W 己 s t e r n b l o t 测 定 下 丘 脑 n N O S 、 S G C a l 及 s G C 印 的 蛋 白 表 达 水 平 ， 从 N O 依 赖 的 信 号 转 导 通 路 对 下 丘 脑 一 垂 体 生 长 轴 功 能 的 促 进 作 用 的 角 度 ， 探 讨 口 服 精 氨 酸 促 进 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 机 制 。 另 外 ，我 们 通 过 对 比 两 组 大 鼠 大 脑 皮 层 、 下 丘 脑 、垂 体 、 心 脏 、肝 脏 、 ’ 肾脏 的 组 织 形 态 及 超 微 结 构 ， 以 观 察 口 服 精 氨 酸 对 实 验 动 物 重 要 脏 器 可 能 存 在 的 毒 性 作 用 ， 从 而 评 价 其 临 床 治 疗 的 安 全 性 。 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 第 一 部 分 口 服 精 氨 酸 促 进 矮 小 儿 童 身 高 增 长 作 用 的 临 床 评 估 身 材 矮 小 是 指 与 同 地 区 同 种 族 同 年 龄 同 性 别 正 常 儿 童 相 比 较 ， 身 高 低 于 正 常 身 高 的 2 个 标 准 差 ， 或 者 低 于 正 常 儿 童 生 长 曲 线 的 第 3 百 分 位 [ 3 ] 。 据 2 0 0 0 年 w H o 发 表 的 调 查 结 果 ， 在 发 展 中 国 家 矮 小 症 的 患 病 率 高 达 3 2 . 5 % [ 4 1 。 矮 小 的 病 因 学 分 类 有 慢 性 系 统 性 疾 病 、 内 分 泌 异 常 、 中 枢 神 经 系 统 疾 病 、 先 天 性 疾 病 及 代 谢 性 疾 病 等 [ 5 l 。 身 材 矮 小 可 使 患 儿 的 成 年 身 高 显 著 降 低 ， 并 对 将 来 的 就 业 、 学 习 、 婚 姻 、 心 理 等 一 系 列 行 为 产 生 不 良 影 响 。 研 究 发 现 ， 矮 小 儿 童 存 在 不 同 程 度 的 行 为 适 应 能 力 障 碍 【 6 一 7 ] 、 认 知 障 碍 [ 8 ] 和 自 我 意 识 障 碍 [ 9 l 。 因 此 ， 矮 小 的 问 题 在 国 内 日 趋 受 到 社 会 和 家 庭 的 普 遍 关 注 ， 临 床 求 诊 患 者 也 随 之 增 多 。 小 儿 时 期 的 骨 线 性 生 长 主 要 发 生 在 骨 髓 生 长 板 ， 由 软 骨 组 织 、 干 箭 端 的 骨 组 织 及 围 绕 生 长 板 的 纤 维 组 织 构 成 ， 生 长 板 通 过 软 骨 生 长 、 骨 基 质 形 成 和 软 骨 钙 化 发 生 骨 骼 的 生 长 。 儿 童 至 青 春 期 发 育 成 熟 长 骨 的 线 性 生 长 主 要 受 G H 一 I G F 轴 调 控 ， 该 生 长 轴 与 骨 形 成 密 切 相 关 【 ’ 0 ] 。 G H 是 人 出 生 后 促 生 长 最 主 要 的 激 素 ，具 有 促 进 骨 的 纵 向 生 长 的 作 用 。 国 外 己 有 较 多 的 体 内 外 实 验 研 究 证 实 L 一 精 氨 酸 具 有 显 著 促 垂 体 G H 分 泌 作 用 ， 补 充 精 氨 酸 有 助 于 刺 激 G H 一 I G F 轴 并 促 进 骨 骼 线 性 生 长 【 ” 一 ’ 2 ] 。 根 据 精 氨 酸 的 药 理 作 用 及 大 量 研 究 报 道 ， 我 们 制 定 了 左 旋 精 氨 酸 口 服 治 疗 方 案 。 以 矮 小 儿 童 为 对 象 ， 分 析 对 比 治 疗 前 后 生 长 速 率 、 身 高 S D S 、 骨 宽 度 、 骨 矿 含 量 及 骨 密 度 ， 观 察 及 评 价 L 一 精 氨 酸 促 进 身 高 增 长 及 骨 形 成 的 作 用 。 1 病 例 选 择 1 . 1 病 例 纳 入 标 准 ① 青 春 期 前 或 青 春 期 ， 身 高 低 于 正 常 同 性 别 、 同 年 龄 儿 童 平 均 身 高 2 个 标 准 差 ; ② 年 身 高 增 长 小 于 s c m ; ③ 知 情 同 意 者 。 1 . 2 病 例 排 除 标 准 ① 慢 性 器 质 性 疾 病 ; ② 遗 传 代 谢 性 疾 病 : ③ 甲 状 腺 素 缺 乏 、 生 长 激 素 缺 乏 等 内 分 泌 疾 病 。 复 _ q 大 学 硕 上 学 位 论 文 2 一 般 资 料 符 合 纳 入 标 准 的 患 儿 共 4 5 例 ， 来 自 2 0 0 8 年 7 月 一 2 0 1 1 年 2 月 复 旦 大 学 附 属 儿 科 医 院 专 科 门 诊 病 人 。 所 有 患 儿 均 为 汉 族 ， 其 中 男 2 5 例 ， 女 2 0 例 ， 年 龄 5 . 5 一 1 3 . 4 岁 。 所 有 患 儿 家 属 均 签 署 知 情 同 意 书 。 3 治 疗 及 观 察 方 法 3 . 1 治 疗 方 法 对 4 5 例 患 儿 均 给 予 左 旋 精 氨 酸 ( 由 南 京 制 药 厂 提 供 ) 口 服 治 疗 ， 3 9 旧 ， 临 睡 前 服 用 ， 疗 程 6 ~ 1 2 个 月 。 3 . 2 观 察 方 法 3 . 2 . 1 所 有 患 儿 于 治 疗 前 及 治 疗 后 每 3 月 随 访 一 次 ， 记 录 其 身 高 、 体 重 ， 观 察 第 二 性 征 ， 并 计 算 身 高 增 长 速 度 。 公 式 为 : 生 长 速 率 ( 。 耐 年 ) 扎 两 次 身 高 测 量 值 之 差 ( c m ) / 间 隔 时 间 ( d ) 1 X 3 6 5 。 所 有 研 究 对 象 的 身 高 和 体 重 都 是 由 专 业 人 员 测 量 ， 使 用 同 一 测 量 工 具 ， 每 人 测 三 次 取 其 平 均 值 。 测 定 身 高 时 ， 被 测 者 以 “ 立 正 ” 姿 势 站 在 身 高 计 的 底 板 上 ， 脚 跟 、 骸 骨 部 及 两 肩 脾 间 紧 靠 身 高 计 的 立 柱 上 ; 测 量 者 站 在 被 测 者 的 左 或 右 侧 ， 其 头 部 调 整 到 耳 屏 上 缘 与 眼 眶 下 缘 的 最 低 点 齐 平 ， 再 移 动 身 高 计 的 水 平 板 至 被 测 者 的 头 顶 ， 使 其 松 紧 度 适 当 ， 即 可 测 量 出 身 高 。 3 . 2 . 2 采 用 双 能 X 线 吸 收 仪 ( D E X A ) ， 于 治 疗 前 、 后 分 别 测 定 骨 宽 度 、 骨 矿 含 量 及 骨 密 度 ， 测 量 部 位 为 右 侧 挠 、 尺 骨 中 段 。 4 统 计 方 法 数 据 统 计 分 析 用 S P S S 1 5 . 0 软 件 ， 治 疗 前 后 的 比 较 采 用 自 身 配 对 l 检 验 ， 结 果 用 均 数 士 标 准 差 ( x 士 s ) 表 示 。 尸 < 0 . 0 5 认 为 差 别 有 统 计 学 意 义 ， p < 0 . 0 1 认 为 差 别 有 高 度 统 计 学 意 义 。 5 结 果 5 . 1 生 长 效 应 : 左 旋 精 氨 酸 口 服 治 疗 后 ， 生 长 速 率 由 ( 4 . 2 1 士 0 . 5 2 ) c 耐 年 提 高 到 ( 7 . 1 6 士 2 . 3 6 ) e 耐 年 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 ( P < 0 . 0 5 ) ; 身 高 S D S 明 显 增 加 ( p < 0 . 0 5 ) ， 从 一 2 . 1 9 士 0 . 8 0 增 加 到 一 1 . 9 5 士 0 . 7 9 。 ( 见 表 l 一 l 、 图 l 一 l ) 表 1 一 1 4 5 例 矮 小 儿 童 口 服 L 一 精 氨 酸 治 疗 前 后 G v 、 身 高 s D s 的 比 较 ( x 士 s ) 分 组 G V 身 高 S D S 治 疗 前 4 . 2 1 士 0 . 5 2 ︻ O 了 矛 八 n 八 丫 U ︸ 一 2 . 1 9 士 0 . 治 疗 后 7 . 1 6 士 1 . 3 6 一 1 . 9 5 士 0 . 注 : 与 治 疗 前 比 较 ， ’ 尸 < 0 . 0 5 复 } ! . 人 学 硕 卜 学 位 论 文 治 疗 . 泊 介 后 侧 聆 铃 甲 、 ︶ 八 . 州 v 比 S S 橄 Q · 0 。 1 . 一 l 。 月 . 一 2 。 1 . 一 3 。 5 . 泊 疗 有 泊 f ， 石 注 : 与 治 疗 前 比 较 ， ’ P < 0 . 0 5 图 1 一 1 4 5 例 矮 小 儿 童 口 服 L 一 精 氨 酸 治 疗 前 后 G V 、 身 高 S D S 的 比 较 ( x 士 s ) 5 . 2 骨 ， 矿 含 量 及 骨 密 度 : 经 口 服 左 旋 精 氨 酸 治 疗 后 ， 患 儿 骨 矿 含 量 及 骨 密 度 明 显 增 加 。 治 疗 前 B W 、 B M C 和 B M D 分 别 为 ( 1 . 0 2 7 士 0 . 1 1 2 ) e m 、 ( 0 . 5 1 7 士 0 . 1 2 0 ) g / e m 和 ( 0 . 4 9 5 士 0 . 0 7 6 ) g z e m Z ， 治 疗 后 分 别 为 ( 1 . 0 4 1 士 0 . 1 1 8 ) e m 、 ( 0 . 5 5 8 士 0 . 1 3 6 ) g / c m 不 f l ( 0 . 5 3 1 士 0 . 0 8 3 ) g / e m ， 。 B M e 、 B M D 值 治 疗 前 后 比 较 ， 爪 0 . 0 5 。 ( 见 表 l 一 2 、 图 l 一 2 ) 表 1 一 2 4 5 例 矮 小 儿 童 口 服 L 一 精 氨 酸 治 疗 前 后 B w 、 B M c 和 B M D 的 比 较 ( x 士 s ) 分 组 B W ( c m ) B M C ( g / e m ) B M n ( g / e m Z ) 治 疗 前 1 . 0 2 7 士 0 . 1 1 2 0 . 5 1 7 士 0 . 1 2 0 0 . 4 9 8 士 0 . 0 7 6 治 疗 后 1 . 0 4 1 士 0 . 1 1 8 0 . 5 5 8 士 0 . 1 3 6 0 . 5 3 1 士 0 . 0 8 3 ’ 注 : 与 治 疗 前 比 较 尸 < 0 . 0 5 、 、 ︺ ( 0 ” 叫 巾 即 份 才 . 甘 昨 后 份 疗 . 招 泞 后 侣 昨 . 份 昨 后 注 : 与 治 疗 前 比 较 ‘ P < 0 . 0 5 图 1 一 2 4 5 例 矮 小 儿 童 口 服 L 一 精 氨 酸 治 疗 前 后 B W 、 B M C 和 B M D 的 比 较 ( x 士 s ) 5 . 3 不 良 反 应 : 所 有 用 药 对 象 均 无 明 显 不 良 反 应 。 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 讨 论 生 长 是 极 为 复 杂 的 生 物 过 程 ， 受 遗 传 因 素 、 先 天 因 素 、 出 生 时 体 重 和 身 高 、 营 养 和 激 素 等 多 种 因 素 的 共 同 作 用 和 影 响 【 ‘ 3 ] 。 部 分 儿 童 在 生 长 发 育 过 程 中 ， 受 各 种 因 素 的 影 响 ， 使 生 长 速 度 减 慢 或 停 滞 ， 偏 离 正 常 的 生 长 发 育 轨 迹 ， 最 终 导 致 身 材 矮 小 。 正 常 儿 童 线 性 生 长 ( 身 长 生 长 或 身 高 生 长 ) 有 其 一 定 的 规 律 ， 呈 非 匀 速 生 长 。 生 后 第 一 年 生 长 速 度 最 快 ， 随 后 在 儿 童 期 的 生 长 速 度 减 慢 。 在 进 入 青 春 早 期 时 出 现 第 二 个 增 长 高 峰 。 然 后 是 进 入 生 长 速 度 的 减 慢 ， 直 到 长 骨 骨 髓 闭 合 ， 生 长 停 止 【 1 4 ] 身 高 增 长 基 础 是 骨 骼 的 线 性 生 长 ， 骨 骼 的 发 育 状 况 最 终 决 定 着 身 高 。 在 临 床 工 作 中 我 们 往 往 用 身 高 的 变 化 来 评 价 正 常 或 异 常 的 骨 骼 线 性 生 长 治 疗 效 果 。 本 文 的 研 究 结 果 显 示 ， 经 口 服 L 一 精 氨 酸 治 疗 后 ， 生 长 速 率 及 身 高 S D S 均 明 显 增 加 ， 表 明 口 服 精 氨 酸 具 有 促 进 矮 小 儿 童 身 高 增 长 的 作 用 。 骨 矿 含 量 及 骨 密 度 通 常 采 用 双 能 X 线 吸 收 仪 测 定 骨 组 织 而 得 出 ， 反 映 长 骨 生 长 发 育 的 具 有 代 表 性 的 测 量 部 位 为 挠 、 尺 骨 的 中 段 。 骨 矿 含 量 及 骨 密 度 是 骨 盐 沉 积 状 态 的 一 种 定 量 指 标 ， 能 够 比 较 精 确 地 反 映 儿 童 骨 骼 的 发 育 及 成 熟 状 态 ， 在 评 价 小 儿 的 生 长 发 育 ， 预 测 儿 童 对 治 疗 的 反 映 及 对 与 骨 代 谢 相 关 疾 病 进 行 诊 断 和 治 疗 检 测 等 方 面 有 重 要 的 临 床 意 义 【 ’ 5 ’ ‘ “ 】 。 本 文 的 研 究 结 果 表 明 ， 精 氨 酸 能 够 增 加 骨 矿 含 量 和 骨 密 度 、 减 少 骨 量 的 丢 失 ， 使 患 儿 骨 质 代 谢 处 于 正 平 衡 状 态 。 身 材 矮 小 是 r h G H 治 疗 的 主 要 适 应 症 。 国 外 研 究 表 明 G H 在 促 进 身 高 增 长 的 同 时 ， 亦 能 增 加 骨 体 积 、 骨 矿 物 质 含 量 和 骨 矿 物 质 密 度 ， 改 善 动 物 和 人 骨 转 化 的 组 织 学 和 生 化 参 数 【 ’ 7 1 。 但 t h G H 价 格 昂 贵 ， 而 且 G H 有 严 格 的 种 属 特 异 性 ， 并 且 不 能 口 服 给 药 ， 这 样 就 大 大 限 制 了 t h G H 在 治 疗 身 材 矮 小 症 方 面 的 应 用 。 本 课 题 应 用 左 旋 精 氨 酸 口 服 治 疗 身 材 矮 小 患 儿 ， 采 用 治 疗 前 后 自 身 对 照 研 究 ， 证 实 精 氨 酸 能 加 速 身 高 的 增 长 ， 并 且 能 增 加 骨 矿 物 质 含 量 和 骨 矿 物 质 密 度 ， 改 善 骨 骼 的 代 谢 和 发 育 。 这 为 应 用 口 服 精 氨 酸 替 代 t h G H 治 疗 提 供 了 临 床 依 据 和 研 究 资 料 ， 并 说 明 其 对 改 善 身 材 矮 小 患 儿 的 最 终 身 高 具 有 较 大 的 临 床 应 用 价 值 。 复 叹 少 心 学 硕 士 学 位 论 文 小 结 1 . 身 材 矮 小 患 儿 口 服 精 氨 酸 治 疗 后 身 高 增 长 加 速 ， 骨 矿 含 量 及 骨 密 度 增 加 ， 且 无 明 显 的 不 良 反 应 。 2 . 口 服 精 氨 酸 在 促 进 矮 小 患 儿 身 高 增 长 的 同 时 ， 亦 能 使 骨 质 代 谢 处 于 正 平 衡 状 态 。 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 第 二 部 分 口 服 精 氨 酸 促 进 大 鼠 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 及 机 制 的 研 究 儿 童 进 入 青 春 期 后 ， 体 格 发 育 最 显 著 的 表 现 是 身 高 线 性 生 长 明 显 加 速 ， 这 是 在 下 丘 脑 一 垂 体 生 长 轴 及 下 丘 脑 一 垂 体 一 性 腺 轴 的 协 同 调 控 作 用 下 实 现 的 。 生 长 激 素 ( G H ) 在 儿 童 至 青 春 期 对 长 骨 的 线 性 生 长 具 有 显 著 的 促 进 作 用 。 垂 体 G H 的 分 泌 主 要 受 下 丘 脑 生 长 激 素 释 放 激 素 ( G H R H ) 和 生 长 抑 素 ( 5 5 ) 的 双 重 调 节 ， 前 者 促 进 ， 后 者 抑 制 【 ’ 8 一 2 0 ] 。 近 年 来 研 究 发 现 : g h r e l i n ， 由 胃 腺 的 壁 细 胞 分 泌 的 2 8 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 多 肚 ， 具 有 较 强 的 促 G H 分 泌 活 性 [ 2 ’ ] 。 除 了 G H R H 和 g h r e l i n ， 氨 基 酸 亦 可 促 进 垂 体 生 长 激 素 的 分 泌 。 在 所 有 氨 基 酸 中 ， L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 作 用 最 为 明 显 [ 2 2 一 2 6 ] ， 且 研 究 表 明 L 一 精 氨 酸 的 代 谢 产 物 N o 在 其 促 G H 分 泌 过 程 中 起 着 重 要 作 用 [ z 7 〕 。 为 了 进 一 步 验 证 前 期 临 床 研 究 的 结 果 ， 我 们 以 骨 形 态 计 量 学 指 标 作 为 观 察 对 象 ， 观 察 口 服 精 氨 酸 对 大 鼠 长 骨 线 性 生 长 的 促 进 作 用 ; 并 从 与 下 丘 脑 一 垂 体 生 长 轴 及 N O 信 号 转 导 通 路 相 关 的 基 因 表 达 的 角 度 探 讨 其 促 进 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 机 制 ， 为 临 床 上 采 用 口 服 精 氨 酸 促 进 矮 小 患 儿 身 高 增 长 提 供 理 论 依 据 。 1 材 料 和 方 法 1 . 1 主 要 试 剂 及 配 制 1 . 1 . 1 骨 形 态 计 量 学 测 定 主 要 试 剂 ( l ) 四 环 素 荧 光 标 记 物 : S i g m a 公 司 ( 2 ) 钙 黄 绿 素 荧 光 标 记 物 : S i g m a 公 司 ( 3 ) 碱 性 磷 酸 酶 ( A L P ) 孵 育 液 : 西 唐 生 物 科 技 ( 4 ) 抗 酒 石 酸 磷 酸 酶 染 色 ( T R A P ) 孵 育 液 : S i g m a 公 司 ( 5 ) 多 聚 甲 醛 : 复 旦 大 学 放 射 医 学 研 究 所 骨 代 谢 研 究 室 提 供 ( 6 ) 盐 酸 赖 氨 酸 : 复 旦 大 学 放 射 医 学 研 究 所 骨 代 谢 研 究 室 提 供 ( 7 ) 过 碘 酸 钠 : 复 旦 大 学 放 射 医 学 研 究 所 骨 代 谢 研 究 室 提 供 主 要 试 剂 配 制 : ( 1 ) P L P 固 定 液 : 保 存 液 A ( 0 . I M 盐 酸 赖 氨 酸 ， 0 . 0 5 M 盐 酸 缓 冲 液 p H 7 . 4 ) ， 保 存 液 B ( 8 % 多 聚 甲 醛 水 溶 液 ) ， 4 o C 保 存 。 使 用 前 3 : 1 比 例 混 合 A 液 和 B 液 ， 加 入 过 碘 酸 钠 ， 使 成 0 . o l M 溶 液 。配 成 固 定 液 含 2 % 多 聚 甲 醛 ， 0 . 0 7 5 M 赖 氨 酸 复 旦 少 丈 学 硕 士 学 位 论 文 和 0 . o l M 高 碘 酸 钠 1 . 1 . 2 放 射 免 疫 法 测 定 试 剂 ( l ) 大 鼠 生 长 激 素 ( g r o w t h h o r m o n e ， G H ) 放 射 免 疫 测 定 试 剂 盒 : L I N C O R e s e a r c h 1 . 1 . 3 分 子 生 物 学 试 剂 ( l ) R N A 提 取 试 剂 T R I Z O L : I n v i t r o g e n 公 司 ( 2 ) 焦 碳 酸 二 乙 酷 ( D E P C ) : S i g m a 公 司 ( 进 口 分 装 ) ( 3 ) 核 糖 核 酸 酶 抑 制 剂 ( R N A s i n ) : 华 美 生 物 工 程 公 司 ( 4 ) 随 机 引 物 : 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 ( 5 ) 目 的 按 基 因 引 物 : 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 ( 6 ) d N T P : 北 京 天 为 时 代 公 司 ( 7 ) M 一 M L V 逆 转 录 酶 : P r o m e g a 公 司 ( 8 ) T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 : 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ( 9 ) R e a l t i m e P C R M a s t e r M i x : 日 本 T O Y O B O 公 司 ( 1 0 ) D N A L a d d e r M a s t e r M i x : 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ( 1 1 ) 琼 脂 糖 : 上 海 鼎 国 生 物 工 程 公 司 ( 西 班 牙 进 口 分 装 ) ( 1 2 ) G e l E x t r a c t i o n k i t 试 剂 盒 : O M E G A 公 司 l · l . 4 w 亡 s t e r n b l o t 试 剂 及 配 制 ( 1 ) W e s t e m 及 I P 细 胞 裂 解 液 : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( 2 ) B C A 法 蛋 白 定 量 试 剂 盒 : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( 3 ) W 己 S t e m 一 抗 稀 释 液 : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( 4 ) 兔 抗 大 鼠 n N O S 单 克 隆 抗 体 ( a b 7 6 0 6 7 ) : a b c a m 公 司 ( 5 ) 兔 抗 大 鼠 s G e a l 多 克 隆 抗 体 ( 0 4 2 8 0 ) : 5 1 脚 a 公 司 ( 6 ) 兔 抗 大 鼠 S G C p l 多 克 隆 抗 体 ( 1 6 0 8 9 7 ) : C a y m a n 公 司 ( 7 ) 羊 抗 兔 I g G 一 H R P : S A N T A C R U Z 生 物 公 司 ( 8 ) G A P D H : 康 成 生 物 ( 9 ) 蛋 白 M a r k e r : T h e r m o 公 司 ( 1 0 ) S X 上 样 缓 冲 液 : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( l 1 ) 1 . s m o l L 一 ’ T r i s 一 H C I : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( 1 2 ) l m o l L 一 ’ T r i s 一 H C I : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( 1 3 ) 3 0 % 丙 烯 酞 胺 : 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ( 1 4 ) 甘 氨 酸 : 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ( 1 5 ) 吐 温 一 2 0 : 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ( 1 6 ) T r i s : 上 海 爱 紫 特 生 物 科 技 有 限 公 司 ( 1 7 ) 甲 醇 : 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 复 旦 大 学 硕 _ { 学 位 论 文 ( 1 8 ) 脱 脂 奶 粉 : 上 海 光 明 乳 业 股 份 有 限 公 司 主 要 试 剂 的 配 制 ( l ) 蛋 白 定 量 配 制 工 作 液 : 5 0 体 积 B C A 试 剂 A 加 1 体 积 B C A 试 剂 B ( 5 0 : 1 ) 配 制 适 量 B C A 工 作 液 ( 2 ) 1 0 % S D S : S D S 1 0 9 ， 加 d d H Z O 至 I O 0 m L ， 调 p H 值 至 7 . 2 ( 3 ) 1 0 % A P : 过 硫 酸 钱 1 9 ， 加 d d H Z O 至 1 O m L ， 4 o C 保 存 ( 4 ) 5 0 ， 0 分 离 胶 : d d H Z o 2 . 3 m L ， 3 0 0 ; 0 丙 烯 酞 胺 1 . 3 m L ， z . s m o I L 一 ’ T r i s 一 H e l ( p H s . s ) l . 3 m L ， 1 0 % S D S S O u L ， 临 灌 胶 时 加 A P 5 0 u L ， T E M E D 3 u L ( 5 ) 1 0 % 分 离 胶 : d d H Z o 1 . g m L ， 3 0 % 丙 烯 酞 胺 一 7 m L ， 1 . s m o l 七 一 ’ T r i s 一 H e l ( p H S . 8 ) l . 3 m L ， 1 0 % S D S S O u L ， 临 灌 胶 时 加 A p 5 0 u L ， T E M E D Z u L ( 6 ) 3 . 9 0 ， 0 浓 缩 胶 : d d H Z o 2 . z m L ， 3 0 0 ， 0 丙 烯 酞 胺 o . 6 7 m L ， l m o l 七 一 ， T r i s 一 H e l ( p H 6 . 8 ) 0 . 3 8 m L ， 1 0 % S D S 3 0 u L ， 1 1 备 灌 胶 时 加 A P 3 0 u L ， T E M E D 3 u L ( 7 ) l o x T B s T : N a e l g o g ， T w e e n 一 2 0 一 o m L ， l m o l L 一 I T r i s 一 H e l ( p H 7 . 5 ) 2 5 o m L ， 加 d d H Z O 至 2 O O 0 m l ， 临 用 时 稀 释 1 0 倍 ( 8 ) S X T r i s 一 甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 : T r i s 1 5 . 5 9 ， 甘 氨 酸 9 4 9 ， 1 0 % S D S S O m L ， 加 d d H Z O 至 I L ( 9 ) 转 膜 缓 冲 液 : T r i s 碱 0 . 0 3 9 ， 甘 氨 酸 1 4 . 4 9 ， 甲 醇 2 0 o m L ， 加 d d H Z O 至 I L ( 1 0 ) 封 I 司 液 : 称 取 5 9 脱 脂 奶 粉 溶 入 1 0 0 m L T B S T 中 ， 4 0 C 保 存 1 . 2 主 要 仪 器 ( l ) 日 本 尼 康 E 6 0 0 显 微 镜 : 复 旦 大 学 放 射 医 学 研 究 所 骨 代 谢 研 究 室 提 供 ( 2 ) S N 一 6 2 8 型 放 射 免 疫 测 定 仪 : 复 旦 大 学 医 学 院 附 属 儿 科 医 院 核 医 学 科 提 供 ( 3 ) 实 时 荧 光 定 量 p C R 扩 增 仪 ( M a s t e r e y e l e r e p r e a l p l e x ) : e p p e n d o r f 公 司 ( 4 ) P C R 扩 增 仪 ( P T C 一 1 5 0 ) : 美 国 M J 公 司 ( 5 ) 紫 外 分 光 光 度 计 ( U V 1 6 0 1 型 ) : 日 本 岛 津 公 司 ( 6 ) 紫 外 凝 胶 一 次 成 像 分 析 仪 ( G D S S O 0 0 ) : 英 国 U V P 公 司 ( 7 ) D Y Y 一 n l 型 电 泳 仪 : 北 京 六 一 仪 器 厂 ( 8 ) H S 一 琼 脂 糖 电 泳 槽 : 浙 江 海 宁 仪 器 厂 ( 9 ) 高 速 低 温 离 心 机 ( G S 1 5 ) : B e e k l n a n 公 司 ( 1 0 ) 台 式 高 速 离 心 机 ( T G L 一 1 6 B ) : 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂 ( 1 1 ) 电 子 分 析 天 平 : M E T T L E R A E 2 6 O ， 西 德 ( 1 2 ) X W 一 8 0 A 漩 涡 混 合 器 : 上 海 医 科 大 学 仪 器 厂 ( 1 3 ) U N I C O U V 一 2 0 0 0 型 分 光 光 度 计 : 尤 尼 柯 ( 上 海 ) 仪 器 有 限 公 司 ( 1 4 ) T G L 一 1 6 G 高 速 冷 冻 离 心 机 : 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂 ( 1 5 ) B 2 3 一 2 型 恒 温 磁 力 搅 拌 器 : 上 海 司 乐 仪 器 有 限 公 司 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 ( 1 6 ) T S 一 1 型 脱 色 摇 床 : 江 苏 海 门 市 其 林 贝 尔 仪 器 制 造 有 限 公 司 ( 1 7 ) 电 热 恒 温 水 浴 锅 : 上 海 市 医 疗 器 械 五 厂 ( 1 8 ) H o e f e r m i n i V E 垂 直 蛋 白 电 泳 系 统 : A m e r s h a m B i o s c i e n e e s ( 1 9 ) H o e f e r T E 一 7 0 半 干 转 膜 仪 : A m e r s h a m B i o s e i e n e e s ( 2 0 ) 硝 酸 纤 维 素 膜 : M i l i p o r e C o 印 o r a t i o n ( 2 1 ) 3 M 滤 纸 : W h a t m a n 1 . 3 实 验 动 物 及 饲 养 条 件 3 5 天 雄 性 s D 大 鼠 5 4 只 ， 体 重 ( 1 4 0 士 5 ) g ， 由 上 海 复 旦 大 学 动 物 实 验 中 心 提 供 。 清 洁 级 动 物 房 ， 温 度 为 ( 2 2 士 3 ) ℃ ， 相 对 湿 度 为 5 0 % 一 6 0 % ， 1 2 / 1 2 h 明 暗 周 期 ， 动 物 食 用 标 准 颗 粒 饲 料 ， 自 由 饮 水 和 摄 食 。 1 . 4 实 验 设 计 1 . 4 . 1 喂 饲 物 配 制 左 旋 精 氨 酸 由 南 京 制 药 厂 提 供 ， 以 蒸 馏 水 溶 解 ， 配 制 成 每 毫 升 含 精 氨 酸 0 . 0 4 5 9 的 口 服 溶 液 。 1 . 4 . 2 实 验 分 组 及 给 药 方 法 实 验 大 鼠 随 机 分 成 2 组 ， 每 组 2 7 只 。 在 普 通 饲 料 喂 养 基 础 上 ， 对 照 组 喂 饲 生 理 盐 水 ; 干 预 组 喂 饲 精 氨 酸 口 服 溶 液 ; 每 只 l o m l 瓜 g 体 重 ， 每 天 1 次 ， 疗 程 4 周 。 喂 饲 剂 量 与 疗 程 均 参 照 国 外 文 献 [ 2 8 一 3 0 ] 。 每 组 随 机 选 取 六 只 大 鼠 ， 在 喂 饲 第 1 6 天 及 第 2 6 天 分 别 腹 腔 注 射 四 环 素 ( 3 0 m g 瓜 g ， S i g m a ) 、 钙 黄 绿 素 ( 1 s m g 瓜 g ， s i g m a ) 进 行 荧 光 标 记 。 1 . 4 . 3 组 织 取 材 及 处 理 干 预 结 束 后 ， 所 有 大 鼠 经 1 1 % 乌 拉 坦 l m l / I O 0 g 体 重 腹 腔 麻 醉 。 经 荧 光 标 记 过 的 1 2 只 大 鼠 处 死 后 取 股 骨 和 胫 骨 标 本 ， 左 侧 股 骨 和 胫 骨 置 7 0 % 酒 精 固 定 ( 4 o C ) ， 右 侧 股 骨 和 胫 骨 置 P L P 固 定 液 ( 含 2 % 多 聚 甲 醛 ， 0 . 0 7 5 M 赖 氨 酸 和 0 . o l M 高 碘 酸 钠 ) 4 o C 固 定 3 天 。 其 余 4 2 只 大 鼠 麻 醉 后 ， 颈 动 脉 采 取 血 标 本 ， 放 血 处 死 后 由 复 旦 大 学 动 物 实 验 中 心 专 业 人 员 取 下 丘 脑 、 垂 体 标 本 。 血 标 本 立 即 离 心 ，分 离 血 清 ， 一 2 0 ℃ 保 存 。 下 丘 脑 及 垂 体 标 本 置 于 液 氮 中 ，用 于 抽 提 总 R N A 和 蛋 白 质 。 1 . 5 骨 形 态 计 量 学 测 定 将 酒 精 固 定 后 的 左 侧 胫 骨 经 塑 料 包 埋 、 非 脱 钙 切 片 ( L e i t z l 6 0 0 ， 德 国 ) ， 白 片 进 行 双 荧 光 分 析 。 切 片 于 显 微 镜 下 观 察 和 摄 片 ， 采 用 I m a g e P r o P l u s 图 像 分 析 软 件 ( M e d i a C y b e m e t i c s ， U S A ) 计 量 并 计 算 矿 化 沉 积 率 ( M A R ， M A R = 双 标 记 间 距 / 1 0 d ) 。 将 P L P 固 定 后 的 右 侧 股 骨 胫 骨 经 E D T A 一 G ( 4 o C ， 2 8 d ) 脱 钙 后 行 低 温 石 蜡 切 片 作 H E 染 色 、 碱 性 磷 酸 酶 ( A L P ) 和 抗 酒 石 酸 磷 酸 酶 染 色 ( T R A P ) 后 于 复 旦 大 学 硕 十 学 位 论 文 显 微 镜 下 观 察 和 摄 片 ， 采 用 I m a g e P r o P l u s 图 像 分 析 软 件 进 行 形 态 计 量 分 析 : 取 胫 骨 近 端 生 长 板 ， 测 量 宽 度 作 为 生 长 板 宽 度 ( G P ， ~ ) ; 取 股 骨 干 箭 端 松 质 骨 ( 生 长 板 下 0 . 5 m m 处 ) 进 行 形 态 计 量 ， 分 别 以 骨 小 梁 体 积 ( B V / T V ， % ) 、 成 骨 细 胞 面 积 ( o b . s / B S ， % ) 和 破 骨 细 胞 面 积 ( o c . s / B S ， % ) 表 示 。 其 中 ， 骨 结 构 和 骨 量 参 数 为 生 长 板 宽 度 和 骨 小 梁 体 积 ， 骨 形 成 参 数 为 成 骨 细 胞 面 积 和 矿 化 沉 积 率 ， 骨 吸 收 参 数 为 破 骨 细 胞 面 积 。 1 . 6 血 清 G H 浓 度 测 定 以 放 射 免 疫 法 测 定 ， 采 用 大 鼠 G H 放 射 免 疫 测 定 试 剂 盒 ( R G H 一 4 5 H K ， L I N C O R e s e a r e h ) 。 操 作 步 骤 : 待 试 剂 充 分 溶 解 ， 平 衡 至 室 温 并 摇 匀 后 ， 按 操 作 顺 序 表 ( 见 表 2 一 l ) 操 作 。 表 2 一 1 G H 放 免 分 析 操 作 程 序 ( 单 位 : 卜 L ) T 管 N S B 管 A 管 B 一 G 管 样 品 管 试 剂 A 一 0 U ︵ ︵ 一 一 记 任 n n ︶ 尸 . ︺ 2 1 温 0 0 一 一 0 0 1 0 0 标 准 B 一 G 1 0 0 样 品 山 ， 几 1 . 日 日 ︸ ︸ ︷ n U O 1 2 5 1 一 G H 1 0 0 1 j 1 l . n ( ︵ U ) 0 n U ︸ 抗 体 1 0 0 室 温 亡 月 过 夜 分 离 试 剂 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 充 分 摇 匀 ， 4 o C 放 置 2 0 分 钟 ， 3 0 0 0 转 / 分 离 心 2 0 分 钟 ( 除 T 管 ) ， 弃 去 上 清 液 ， 沉 淀 物 和 T 管 计 数 1 分 钟 ， 根 据 仪 器 程 序 自 动 计 算 出 血 清 样 品 G H 的 含 量 。 1 . 7 下 丘 脑 n N O s 、 s G C a l 、 s G C p l 、 p K G l l 、 G H R H 、 5 5 及 垂 体 G H 的 基 因 表 达 水 平 ( 实 时 荧 光 定 量 R T 一 P C R ) 1 . 7 . 1 器 皿 、 试 剂 的 去 R N A 酶 处 理 l m L D E P C 加 入 1 0 0 O m L 三 蒸 水 中 ， 充 分 搅 拌 ， 3 7 o C 水 浴 2 h 或 室 温 过 夜 ， 巧 磅 Z O m i n 高 压 消 毒 ， 分 装 后 4 o C 保 存 。 R N A 抽 提 过 程 均 采 用 此 溶 液 。 金 属 器 皿 、 研 钵 等 器 皿 在 1 8 0 o C 烘 烤 4 h 灭 酶 备 用 。 1 . 7 . 2 总 R N A 的 提 取 及 测 定 ( T r i z o l 法 ) ( l ) 组 织 匀 浆 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 ① 取 出 高 温 高 压 消 毒 后 研 钵 ， 将 冰 冻 组 织 置 于 研 钵 内 ， 倒 入 液 氮 ， 研 碎 。 ② 每 5 0 一 I O o m g 匀 浆 组 织 标 本 加 入 l m L 的 T r i z o l ， 标 本 的 量 不 能 超 过 T r i z o l 体 积 的 1 0 % ， 否 则 会 出 现 D N A 污 染 。 ③ 将 以 上 匀 浆 标 本 转 移 到 1 . s m L 的 E P 管 中 ， 在 1 5 一 3 0 o C 放 置 5 分 钟 ， 以 彻 底 分 离 核 蛋 白 复 合 体 。 ( 2 ) 相 分 离 加 入 0 . 2 m L 氯 仿 ， 加 盖 后 用 手 剧 烈 摇 匀 1 5 秒 ， 在 1 5 一 3 0 o C 放 置 2 一 3 分 钟 ， 然 后 2 一 s o c 离 心 1 2 ， 0 0 0 X g ， 1 5 分 钟 。 离 心 后 分 成 3 层 ， 下 面 的 红 色 为 酚 一 氯 仿 相 ， 一 个 中 间 层 ， 一 面 是 无 色 的 水 相 。 R N A 只 存 在 于 水 相 中 。 水 相 占 总 T r i z o l 的 6 0 % 。 ( 3 ) R N A 沉 淀 将 上 层 水 相 转 移 到 另 一 干 净 的 E P 管 中 ， 加 入 0 . s m L 异 丙 醇 ， 混 匀 ， 1 5 一 3 0 o C 静 置 1 0 分 钟 ， 然 后 2 一 s o C 1 2 ， 0 0 0 X g 离 心 1 0 分 钟 。 离 心 前 可 以 在 管 的 侧 壁 和 底 部 看 到 絮 状 胶 样 沉 淀 ， 这 就 是 R N A 沉 淀 。 ( 4 ) R N A 洗 涤 去 上 清 ， 加 入 l m L 7 5 % 乙 醇 洗 涤 R N A 沉 淀 ， 振 荡 器 混 匀 ， 2 一 s o C 7 ， 5 0 0 X g 离 心 5 分 钟 。 ( 5 ) R N A 再 溶 解 去 上 清 ， 置 真 空 或 空 气 中 5 一 1 0 分 钟 ， 干 燥 R N A 沉 淀 ( 不 能 在 真 空 中 离 心 干 燥 ) 。 注 意 不 能 将 R N A 沉 淀 完 全 干 燥 ， 这 样 会 极 大 地 降 低 它 的 溶 解 度 。 用 D E P C 水 重 悬 R N A 沉 淀 ， 用 枪 头 反 复 吹 打 几 次 ， 静 置 1 0 分 钟 ， 测 浓 度 后 一 2 0 o C 保 存 。 ( 6 ) 测 定 R N A 浓 度 取 出 4 u L 的 上 液 ， 加 入 1 9 6 u L 的 D E P C 水 ， 测 O D 2 6 O / 2 8 0 值 。 O D 2 6 0 / 2 8 0 值 在 1 . 8 一 2 . 0 视 为 纯 度 很 高 。 ( 7 ) R N A 鉴 定 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 确 定 抽 提 R N A 完 整 性 和 D N A 污 染 情 况 。 1 . 7 . 3 逆 转 录 ( R T ) 取 Z u g 总 R N A 加 入 l u L 随 机 引 物 ， 用 D E P C 水 补 充 体 积 为 1 s u L 。 于 7 0 o C 反 应 5 分 钟 ， 置 于 冰 上 ， 加 入 以 下 反 应 体 系 : s x M 一 M L V 逆 转 录 缓 冲 液 s u L M 一 M L V ( Z O O U / u L ) l u L 4 X d N T P ( I O l l l r n o l / L ) l . 2 5 u L R N a s i n ( 4 0 U / u L ) 0 . s u L 复 旦 大 学 硕 十 学 位 论 文 D E P C 水 2 . 2 5 u L 总 反 应 体 积 2 5 u L 置 于 P C R 扩 增 仪 中 2 5 ℃ 1 0 分 钟 ， 3 7 o C 6 0 分 钟 ， 9 5 ℃ 5 分 钟 终 止 反 应 。 逆 录 产 物 加 S O u L 灭 菌 d d H Z O 混 匀 并 分 装 ， 于 一 Z O o C 保 存 。 1 . 7 . 4 聚 合 酶 链 式 反 应 ( P C R ) 引 物 设 计 参 考 文 献 资 料 并 采 用 计 算 机 辅 助 设 计 ( P r i m e r p r e m i e r 5 . 0 ) ， 均 采 用 S Y B R 一 G r e e n l 荧 光 染 料 法 进 行 检 测 。 大 鼠 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 、 P K G l l 、 G H R H 、 5 5 、 G H 、 仔 一 a c t i n 上 下 游 引 物 序 列 及 产 物 长 度 如 表 2 一 2 所 示 : 表 2 一 2 荧 光 定 量 P C R 引 物 序 列 及 产 物 长 度 检 测 基 因 上 下 游 引 物 序 列 5 ‘ 一 3 产 物 长 度 ( b P ) n N O S S e n s e : 5 ‘ 一 g a e a a c g t t c e t g t g g t c e t 一 3 ‘ ︸ 乙 气 l ， 1 . 勺 勺 n ， 夕 产 Q 乙 曰 叶 0 n 月 一 z 丫 a n t i 一 s e n s e : s r 一 t e e a g t g t g c t e t t e a g g t g 一 3 ‘ S G C 仪 1 S e n s e : 5 ’ 一 c t t t g t g t t c a e e c c g a g a t 一 3 ‘ a n t i 一 s e n s e : 5 ‘ 一 c a g a a a c a t g e g g e t e a c t a 一 3 s G C p l s e n s e : 5 ‘ 一 a e g g t c e e g a g g t g t g g g a a g 一 3 ‘ a n t i 一 s e n s e : 5 ‘ 一 t c e e a g g a c a e g c a a g a t g g t 一 3 P K G ll s e n s e : 5 ’ 一 a g t g g e e e e a t a g a t e a e a g 一 3 a n t i 一 s e n s e : 5 ‘ 一 t e e g g g a g a t e t a a e a a t g c 一 3 G H R H S e n s e : 5 ’ 一 a c t c t g g g t g t t e t t t g t g c 一 3 护 乙 ‘ 勺 气 1 二 . ︼ 勺 4 n O q 了 ︶ 厂 曰 Z 4 O C / ， a n t i 一 s e n s e : 5 ’ 一 a g e t t c a t e e t t g g g a a t e e 一 3 ‘ S S S e n s e : 5 护 一 a c c e e a g a e t e e g t e a g t t t 一 3 ‘ a n t i 一 s e n s e : 5 ’ 一 g a a g t t e r t g e a g c e a g e t t 一 3 ‘ G H S e n s e : 5 ’ 一 g c a g a g a a e t g a c a t g g a a t t g 一 3 ’ a n t i 一 s e n s e : 5 ’ 一 t t t t g a g e a g a g e g t c a t e 一 3 ’ p 一 a e t i n s e n s e : 5 ‘ 一 t g a c a g g a t g e a g a a g g a g a t 一 3 ‘ a n t i 一 s e n s e : 5 护 一 g a t a g a g e e a e e a a t e e a c a e a 一 3 ’ ( 1 ) n N O S 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T 砍 a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 0 . 2 5 l l L 1 0 X R e a e t i o n B u n 匕 r s u L 4 X d N T P 4 l l L P r i m e r l l u L P r i m e r Z 1 l l L 复 口 . 大 学 硕 二 卜 学 位 论 文 待 测 c D N A 1 l l L 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 O C 3 O s e e 一 6 0 0 C 3 o s e e ， 7 2 o C 4 O s e e ， 4 O e y e l e 一 7 2 o e l o m i n 一 l o 0 C ( 2 ) s G C a l 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 o . 2 5 u L 1 0 X R e a e t i o n B u f l ’ e r s u L 4 X d N T P 4 u L P r i m e r 1 1 u L P r i m e r 2 1 u L 待 测 c D N A 1 u L 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 o C 3 o s e e 一 5 6 o C 3 o s e e ， 7 2 o C 4 0 s e e ， 4 0 e y e l e 一 7 2 o C l o m i n 一 l o o C ( 3 ) s G C p l 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 0 . 2 5 u L 1 0 X R e a c t i o n B u f t 七 r s u L 4 又 d N T P 4 u L P r i m e r 1 1 u L P r i m e r 2 1 u L 待 测 c D N A l u L 灭 菌 d d H Z O 3 7 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 o C 3 O s e e 一 6 O O C 3 0 s e e ， 7 2 0 C 4 O s e e ， 4 0 e y c l e 一 7 2 o C l o m i n 一 l o o e ( 4 ) P K G H 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 O . 2 5 u L I O X R e a e t i o n B u f l 乞 r s u L 4 X d N T P 4 u L P r i m e r 1 1 u L P r i m e r 2 1 u L 待 测 c D N A l u L 复 旦 人 学 了 吹 十 学 位 论 文 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 O C 3 O s e e 一 6 0 0 C 3 o s e c ， 7 2 o C 4 o s e e ， 4 O e y c l e 一 7 2 O C I O m i n 一 l o o C ( 5 ) G H R H 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 o . 2 5 u L I O X R e a e t i o n B u f l 乞 r s u L 4 X d N T P 4 u L P r i m e f 1 1 u L P r i m e r 2 1 u L 待 测 c D N A 1 u L 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 O C 3 0 s e e 一 5 9 o C 3 O s e c ， 7 2 o C 4 0 s e e ， 4 o e y e l e 一 7 2 o C 1 O m i n 一 1 0 0 C ( 6 ) 5 5 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 0 . 2 5 u L 1 0 X R e a c t i o n B u f l ’ e r s l l L 4 X d N T P 4 l l L P r i m e r l l u L P r i m e r Z 1 l l L 待 测 c D N A l u L 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 O C 3 O s e e 一 6 0 0 C 3 O s e e ， 7 2 o C 4 O s e e ， 4 0 e y e l e 一 7 2 0 C 1 o m i n 一 1 o o C ( 7 ) G H 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 0 . 2 5 u L I O X R e a c t l o n B u l l ’ e r S U L 4 火 d N T P 4 u L P r i m e r l l u L P r i m e r Z l u L 待 测 c D N A l u L 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 复 日 . 人 学 硕 卜 学 位 论 文 总 体 积 S O u L 扩 增 条 件 : 9 5 O C 3 0 s e e 一 6 0 o C 3 0 s e e ， 7 2 o e 4 O s e e ， 4 O e y e l e 一 7 2 “ e l o m i n 一 l o o e ( 8 ) p 一 a c t i n 的 反 应 体 系 及 扩 增 条 件 反 应 体 系 : T a k a R a E x T a q D N A 聚 合 酶 O . 2 5 u L 1 0 又 R e a e t i o n B u f t 七 r s u L 4 X d N T P 4 u L P r i m e r 1 l u L P r i m e r 2 l u L 待 测 c D N A l u L 灭 菌 d d H Z O 3 7 . 7 5 u L 总 体 积 5 0 u L 扩 增 条 件 : 9 5 o C 3 o s e e 一 6 0 0 C 3 o s e e ， 7 2 o C 4 0 s e e ， 4 0 e y e l e 一 7 2 o C l o m i n 一 1 0 0 C ( 9 ) p C R 产 物 鉴 定 2 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 产 物 是 否 为 特 异 性 目 的 片 段 。 ① 酉 己 制 凝 胶 : 称 取 琼 脂 糖 0 . 6 9 放 入 2 0 O m L 三 角 烧 瓶 中 ， 加 入 3 0 m L 1 X T B E 溶 液 ， 加 热 令 其 完 全 溶 解 ， 待 冷 却 至 约 6 0 ℃ 时 加 入 Z u L 浪 化 已 锭 溶 液 ( 1 0 m g / m L ) ， 浇 板 ， 水 平 放 置 ， 避 光 待 凝 。 ② 上 样 电 泳 将 已 制 备 的 2 % 琼 脂 糖 凝 胶 放 入 电 泳 槽 ， 加 入 1 X T B E 至 高 出 凝 胶 表 面 l m m 。 1 0 u L P C R 产 物 分 别 和 Z u L 6 X 加 样 缓 冲 液 混 匀 后 上 样 电 泳 ， 另 取 6 u L 6 0 O b p D N A L a d d e r M a r k e r 作 为 D N A 片 段 大 小 的 对 照 。 8 0 V 电 压 下 电 泳 2 0 一 3 0 分 钟 。 电 泳 结 果 用 紫 外 凝 胶 一 次 成 像 及 分 析 仪 观 察 并 记 录 ， 引 物 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 、 p K G l l 、 G H R H 、 5 5 、 G H 、 p 一 a c t i n 分 别 扩 增 出 1 7 9 b p 、 Z O l b p 、 2 2 4 b p 、 1 9 o b p 、 2 9 4 b p 、 2 4 2 b p 、 2 6 9 b p 、 l o 6 b p 的 目 的 片 段 。 各 p C R 产 物 经 2 % 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 ， 结 果 显 示 条 带 清 晰 ， 片 段 一 长 度 符 合 设 计 要 求 ， 无 非 特 异 性 扩 增 ( 见 图 2 一 1 ) 。 s G C o l ， 6 C p l I x ， o 1 1 G H R H p 一 a e t i n ﹃ ﹃ 吻 ︸ 岌 三 . 目 曰 . 卜 月 目 拼 . . . . 一 . . . . 脚 侧 . 徽 脚 七 曰 曰 目 . . 图 2 一 1 P C R 扩 增 产 物 电 泳 条 带 复 口 _ 大 学 硕 十 学 位 论 文 1 . 7 . 5 P C R 产 物 回 收 及 标 准 品 的 制 备 ( 1 ) P C R 产 物 取 出 4 0 u L 加 入 2 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 l h 后 ， 将 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 的 亮 的 条 带 切 割 下 来 放 在 1 . s m L 的 E P 管 中 。 ( 2 ) 加 入 6 0 O u L 的 Q G b u f f e r 。 ( 3 ) S O o C 水 浴 1 0 分 钟 至 完 全 溶 解 ， 加 入 1 0 O u L 异 丙 醇 。 ( 4 ) 将 样 品 加 入 ( Q I A q u i c k e o l u m n ) 回 收 胶 的 柱 中 ， 1 3 ， 0 0 0 印 m X 1 m i n 离 心 ( 以 下 离 心 均 呈 此 条 件 ) ， 然 后 倒 掉 下 面 的 液 体 。 ( 5 ) 再 加 入 5 0 O u L Q G ， 离 心 后 倒 掉 下 面 的 液 体 。 ( 6 ) 加 入 7 5 0 u L 的 b u f f e r P E ( 内 加 酒 精 ) ， 离 心 后 倒 掉 下 液 ， 再 离 心 一 次 。 ( 7 ) 将 Q I A q u i e k e o l u r n n 放 入 1 . s m L 的 E p 管 中 ， 加 入 3 O u L 的 b u f f e r E B ， 静 置 1 分 钟 ， 然 后 1 3 ， 0 0 0 r p m X l m i n 离 心 ， E P 管 中 的 液 体 即 为 回 收 的 D N A 目 的 片 段 ， 一 Z O o C 保 存 。 ( 8 ) O D 值 : 取 注 射 用 水 1 9 6 u L 十 4 u L 纯 化 的 样 品 于 0 . 6 m L E P 管 中 ， 测 O D 值 。 ( 9 ) 制 备 标 准 品 标 准 曲 线 : 将 纯 化 的 P C R 产 物 分 别 取 Z u L 后 用 灭 菌 注 射 用 水 依 次 稀 释 1 0 ’ 。 、 1 0 9 、 1 0 8 、 一 0 7 、 1 0 6 、 1 0 ， 、 1 0 4 、 一 0 3 ， 分 别 取 出 2 . s u L 作 为 模 板 ， 进 行 荧 光 定 量 ， 反 应 体 系 为 2 5 u L ， 即 注 射 用 水 g u L ， R e a l t i m e P C R M a s t e r M i x 1 2 . s u L ， 引 物 上 游 O . s u L ， 引 物 下 游 O . s u L ， 模 板 2 . s u L ， 得 到 标 准 曲 线 。 1 . 7 . 6 实 时 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 式 反 应 ( r e a l 一 t i m e f l u o r e s e e n e e q u a n t i t a t i v e p C R ， F Q P C R ) ( l ) 样 品 的 荧 光 定 量 反 应 体 系 反 应 体 系 为 2 5 u L ， 即 注 射 用 水 g u L ， R e a l t i m e P C R M a s t e r M i x 1 2 . s u L ， 引 物 上 游 O . s u L ， 引 物 下 游 0 . s u L ， 模 板 2 . s u L ， 不 加 模 板 作 为 阴 性 对 照 。 ( 2 ) 扩 增 条 件 n N O S : 9 5 “ C Z o m i n 一 9 5 O C 3 O s e e ， 6 0 0 C 3 o s e e ， 7 2 O C 4 0 s e e ， 4 o e y e l e 一 6 0 一 g o o C 溶 解 曲 线 分 析 。 s G C a l : 9 5 0 C Z O m i n 一 9 5 O C 3 O s e c ， 5 6 o C 3 0 s e e ， 7 2 O C 4 0 s e e ， 4 O e y e l e 一 6 0 一 g o o C 溶 解 曲 线 分 析 。 s G C p l : 9 5 O C Z O m i n 一 9 5 O C 3 0 s e e ， 6 0 0 C 3 O s e e ， 7 2 o C 4 O s e e ， 4 O e y e l e 一 6 0 一 g o o C 溶 解 曲 线 分 析 。 P K G l l : 9 5 o C Z O m i n 一 9 5 o C 3 0 s e e ， 6 0 o C 3 O s e e ， 7 2 o C 4 O s e e ， 4 O e y e l e 一 6 0 一 9 0 o C 溶 解 曲 线 分 析 。 G H R H : 9 5 0 C Z O m i n 一 9 5 O C 3 O s e e ， 5 9 0 C 3 O s e e ， 7 2 o e 4 0 s e e ， 4 0 e y e l e 一 6 0 一 g o o e 溶 解 曲 复 且 大 学 硕 L 学 位 论 文 线 分 析 。 5 5 : 9 5 O e Z o m i n 一 9 5 O e 3 o s e c ， 6 0 0 e 3 o s e c ， 7 2 o C 4 o s e e ， 4 o e y c l e 一 6 0 一 g o o C 溶 解 曲 线 分 析 。 o H : 9 5 0 e 2 0 m i n 一 9 5 O e 3 o s e e ， 6 O O C 3 0 s e e ， 7 2 O C 4 o s e e ， 4 0 e y e l e 一 6 0 一 9 0 o C 溶 解 曲 线 分 析 。 p 一 a e t i n : 9 5 O e Z o m i n 一 9 5 “ C 3 o s e e ， 6 0 0 e 3 o s e c ， 7 2 o C 4 o s e e ， 4 0 e y e l e 一 6 0 一 g o o C 溶 解 曲 线 分 析 。 分 别 采 用 M a s t e r c y e l e r e p r e a l p l e x ( E p p e n d o r f ) 实 时 荧 光 定 量 p C R 仪 进 行 扩 增 和 分 析 ， 每 个 样 本 、 阴 性 对 照 及 标 准 品 均 设 两 个 平 行 反 应 管 ， 定 量 结 果 取 平 均 值 。 循 环 结 束 后 ， 根 据 标 准 品 制 作 标 准 曲 线 ， 得 出 每 个 样 本 初 始 拷 贝 数 。 各 个 样 本 不 同 指 标 的 定 量 结 果 均 用 相 应 的 p 一 a c t i n 定 量 结 果 标 准 化 。 部 分 指 标 的 标 准 曲 线 及 溶 解 曲 线 见 图 2 一 2 。 一 万 n N O S … 遍 ’ 弓 G C 口 I 遍 妞 ﹄ { 脚 哟 ， 哟 帆 卿 气 价 曰 冬 沪 二 侧 知 s G C p l K G 1 1 二 祠 一 遍 鱼 一 ， G H R H 月 ， 月 减 曰 伽 一 痴 确 诚 认 “ B · A C T I N 图 2 一 2 r e a l 一 t i m e P C R 标 准 曲 线 及 溶 解 曲 线 8 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 蛋 白 表 达 水 平 分 析 ( W e s t e m b l o t 方 法 ) 复 旦 人 学 硕 卜 学 位 论 文 1 . 8 . 1 W e s t e r n b l o t 方 法 : 实 验 步 骤 : ( l ) 抽 提 蛋 白 : ① 把 组 织 剪 切 成 细 小 的 碎 片 。 ② 融 解 W e s t e m 及 I P 细 胞 裂 解 液 ， 混 匀 。 取 适 当 量 的 裂 解 液 ， 在 使 用 前 数 分 钟 内 加 入 P M S F ， 使 P M S F 的 最 终 浓 度 为 l m M 。 ③ 按 照 每 2 0 毫 克 组 织 加 入 1 0 0 一 2 0 0 微 升 裂 解 液 的 比 例 加 入 裂 解 液 ( 如 果 裂 解 液 不 充 分 可 以 适 当 添 加 更 多 的 裂 解 液 ， 如 果 需 要 高 浓 度 的 蛋 白 样 品 ， 可 以 适 当 减 少 裂 解 液 的 用 量 ) 。 ④ 用 玻 璃 匀 浆 器 匀 浆 ， 直 至 充 分 裂 解 。 在 冰 上 放 置 3 0 m i n 。 ⑤ 充 分 裂 解 后 ， 4 o C 1 3 0 0 鲍 离 心 3 0 分 钟 ， 取 上 清 ， 其 中 一 部 分 按 l u L 样 品 + 4 u L P B S 稀 释 后 取 Z u L 用 于 测 蛋 白 浓 度 。 另 一 部 分 煮 沸 1 0 分 钟 一 2 0 o C 保 存 用 于 进 行 后 续 的 W e s t e r n 操 作 。 ( 2 ) 蛋 白 质 定 量 : 采 用 B C A 蛋 白 测 定 法 ① 根 据 样 品 数 量 ， 按 5 0 体 积 B C A 试 剂 A 加 1 体 积 B C A 试 剂 B ( 5 0 : l ) 配 制 适 量 B C A 工 作 液 ， 充 分 混 匀 。 B C A 工 作 液 室 温 2 4 小 时 内 稳 定 。 ② 完 全 溶 解 蛋 白 标 准 品 ， 取 1 0 微 升 稀 释 至 1 0 0 微 升 ， 使 终 浓 度 为 0 . s m g 八 n L 。 用 P B S 稀 释 标 准 品 ③ 将 标 准 品 按 0 ， l ， 2 ， 4 ， 8 ， 1 2 ， 1 6 ， 2 0 微 升 加 到 9 6 孔 板 的 标 准 品 孔 中 ， 加 用 于 稀 释 标 准 品 的 溶 液 补 足 到 2 0 微 升 。 ④ 加 上 述 稀 释 5 倍 的 样 品 Z u L 加 到 % 孔 板 的 样 品 孔 中 ， 加 用 于 稀 释 标 准 品 的 溶 液 到 2 0 微 升 。 ⑤ 各 孔 加 入 2 0 0 微 升 B C A 工 作 液 ， 3 7 o C 放 置 3 0 分 钟 。 注 : 也 可 以 室 温 放 置 2 小 时 ， 或 6 0 o C 放 置 3 0 分 钟 。 B C A 法 测 定 蛋 白 浓 度 时 ， 吸 光 度 会 随 着 时 间 的 延 长 不 断 加 深 。 并 且 显 色 反 应 会 因 温 度 升 高 而 加 快 。 如 果 浓 度 较 低 ， 适 量 在 较 高 温 度 孵 育 ， 或 延 长 孵 育 时 间 。 ⑥ 测 定 A 5 6 2 的 波 长 ， 根 据 标 准 曲 线 计 算 出 蛋 白 浓 度 。 ( 3 ) S D S 一 P A G E 电 泳 ① 根 据 目 的 蛋 白 的 分 子 量 大 小 选 择 合 适 的 凝 胶 浓 度 ， 配 制 S D S 一 P A G E 浓 缩 胶 与 分 离 胶 : 本 实 验 浓 缩 胶 为 3 . 9 % ， 分 离 胶 为 8 % 和 1 0 % 。 使 用 w h a t m a n 3 ~ 滤 纸 吸 去 分 离 胶 上 层 覆 盖 的 所 有 溶 液 ， 如 上 配 制 层 积 胶 。 用 1 0 m L 注 射 器 将 层 积 胶 加 入 板 中 至 顶 端 ， 小 心 插 入 梳 子 ， 注 意 不 要 产 生 气 泡 。 凝 胶 聚 合 1 小 时 左 右 。 凝 胶 电 泳 前 ， 拔 去 梳 子 。 每 孔 均 用 l x 电 泳 缓 冲 液 清 洗 。 上 、 下 层 电 泳 槽 中 加 入 1 x 电 泳 缓 冲 液 ， 上 层 槽 中 缓 冲 液 液 面 需 超 过 上 样 孔 顶 端 1 一 Z c m 。 B i o R a d 电 泳 槽 复 月 _ 大 学 硕 士 学 位 论 文 中 需 加 入 S O O m L 的 I X 电 泳 缓 冲 液 ( S O m L 的 1 0 x 储 存 液 + 4 5 O m L d d H Z O ) 。 ② 上 样 : 首 先 将 上 述 1 6 0 u L 样 品 加 入 4 O u L s x 上 样 缓 冲 液 再 加 入 1 0 u L 日 一 琉 基 乙 醇 煮 沸 6 分 钟 ， 根 据 不 同 目 的 蛋 白 在 总 蛋 白 中 的 含 量 ( 文 献 提 示 ) ， 一 般 总 蛋 白 在 1 0 一 1 5 0 u g 之 间 都 可 以 ， 上 样 的 体 积 根 据 不 同 浓 度 确 定 ， 一 般 < s o u L 。 本 次 实 验 上 样 量 蛋 白 6 O u g 。 将 准 备 好 的 样 品 液 和 生 物 素 标 记 的 蛋 白 质 分 子 量 标 准 分 别 上 样 ， 标 准 加 进 第 一 个 孔 中 。 ③ 电 泳 : 事 先 配 好 电 泳 缓 冲 液 先 6 0 V ， 待 样 品 到 达 分 离 胶 即 可 将 电 压 调 至 1 2 0 V ， 当 澳 芬 兰 指 示 剂 到 达 胶 的 底 部 时 即 可 停 止 电 泳 。 ( 4 ) 蛋 白 质 转 移 : ① 如 试 剂 制 备 中 所 述 ， 制 备 足 够 转 移 缓 冲 液 以 充 满 转 移 槽 ， 另 外 准 备 2 0 0 m L 用 于 平 衡 胶 和 膜 以 及 润 湿 滤 纸 。 ② 从 玻 璃 板 上 取 下 凝 胶 ， 去 除 所 有 浓 缩 胶 。 ③ 将 滤 纸 、 硝 酸 纤 维 素 膜 ( 事 先 裁 好 大 小 ) 、 海 绵 夹 浸 泡 在 转 移 缓 冲 液 中 3 0 分 全 中 。 ④ 按 照 泡 沫 、 滤 纸 、 凝 胶 、 转 印 膜 、 滤 纸 、 海 绵 夹 的 顺 序 组 装 转 移 夹 层 。 ⑤ 将 转 移 夹 放 入 转 移 槽 中 ， 确 保 转 移 夹 的 凝 胶 侧 面 向 阴 极 ( 一 ) 而 膜 侧 面 面 向 阳 极 ( 十 ) 。 向 转 移 槽 中 加 入 适 量 缓 冲 液 ， 确 保 转 移 夹 完 全 浸 没 。 将 黑 色 电 极 引 线 ( 一 ) 插 入 转 移 装 置 的 阴 极 插 孔 ， 红 色 电 极 引 线 ( + ) 插 入 阳 极 插 孔 。 连 接 阳 极 和 阴 极 引 线 至 对 应 的 电 源 输 出 端 。 转 膜 装 置 于 冰 水 中 ， 打 开 电 源 1 0 0 V 电 泳 1 一 1 . 5 小 时 转 移 完 成 后 ，从 槽 中 取 出 转 移 夹 ， 用 镊 子 小 心 打 开 转 移 叠 层 ， 纤 维 素 膜 ，在 膜 的 靠 近 胶 的 一 面 的 右 上 角 剪 个 记 号 。 ( 5 ) 免 疫 检 测 : ① 封 闭 : 取 出 转 好 的 硝 酸 纤 维 素 膜 ， 放 在 5 % 脱 脂 奶 粉 中 封 闭 1 一 2 h ， 将 膜 裁 剪 成 一 定 的 大 小 ( 利 于 节 省 抗 体 ) ， 准 备 上 抗 体 。 ② 配 一 抗 : 将 一 抗 用 一 抗 稀 释 液 配 好 ( n N O s l : 2 5 0 ， s G e a l l : 2 5 0 0 ， s G e p z l : 2 0 0 ) 。 ③ 上 一 抗 ， 将 抗 体 放 入 事 先 准 备 的 特 制 小 船 中 ， 将 膜 倒 扣 在 抗 体 上 ， 将 小 船 放 在 培 养 皿 中 ， 放 在 垂 直 摇 床 上 ， l h 后 将 之 收 入 4 度 冰 箱 过 夜 。 ④ 将 膜 取 出 正 面 向 上 后 放 在 塑 料 盒 子 中 ， 用 事 先 配 好 的 洗 液 T B S T 洗 1 0 m i n x 3 次 。 ⑤ 上 二 抗 及 G A P D H ( G A P D H I : 1 0 0 0 0 ， 羊 抗 兔 二 抗 l : 4 0 0 0 ) ， 方 法 同 一 抗 ， 摇 床 摇 l h 后 取 出 。 ⑥ T B S T 洗 I O m i n X 3 次 。 ⑦ 取 等 量 的 E C L 发 光 剂 A ， B ( 放 在 不 同 的 管 子 中 ) ， 将 硝 酸 纤 维 素 膜 正 面 向 上 放 在 保 鲜 膜 上 ， 将 A ， B 液 取 出 混 匀 滴 在 膜 上 ， l m i n 左 右 后 将 膜 上 的 发 光 剂 去 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 掉 ( 注 意 : 不 可 干 掉 ) ， 将 膜 放 置 L A S 一 4 0 0 0 m i n i ( F u j i f i l m ) 中 显 影 成 像 。 1 . 8 . 2 结 果 分 析 采 用 M u t i G a u g e V 3 . 2 ( F u j i f i l m ) 系 统 进 行 蛋 白 定 量 分 析 ， 将 每 组 n N O S 、 s G C 叭 、 s G C p l 蛋 白 条 带 光 密 度 值 与 对 应 G A P D H 蛋 白 光 密 度 值 的 比 值 进 行 统 计 学 分 析 。 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 的 蛋 白 分 子 量 分 别 为 : 1 6 l K D a 、 s o K D a 、 7 o K D a 。 1 . 9 统 计 方 法 应 用 S P S S 巧 . 0 统 计 软 件 包 ， 结 果 用 均 数 士 标 准 差 ( 义 土 s ) 表 示 。两 组 间 均 数 比 较 采 用 t 检 验 。 尸 < 0 . 0 5 认 为 差 别 有 统 计 学 意 义 ; 尸 < 0 . 0 1 认 为 差 别 有 高 度 统 计 学 意 义 。 2 结 果 2 . 1 两 组 大 鼠 胫 骨 生 长 板 宽 度 及 矿 化 沉 积 率 ， 股 骨 骨 小 梁 面 积 百 分 数 、 成 骨 细 胞 面 积 及 破 骨 细 胞 面 积 的 比 较 。 ( 见 表 2 一 3 、 2 一 4 ) 由 表 2 一 3 、 2 一 4 可 见 : 干 预 组 与 对 照 组 相 比 ， 胫 骨 生 长 板 宽 度 及 股 骨 成 骨 细 胞 面 积 明 显 增 加 ( P < 0 . 0 5 ) ， 胫 骨 矿 化 沉 积 率 、 股 骨 骨 小 梁 面 积 及 破 骨 细 胞 面 积 稍 提 高 但 与 对 照 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 。 表 2 一 3 两 组 大 鼠 胫 骨 生 长 板 宽 度 ( G P ， ~ ) 及 矿 化 沉 积 率 ( M A R ， m 耐 d ) 的 比 较 ( x 士 s ) 组 别 G P M A R 对 照 0 . 2 1 8 3 士 0 . 0 1 3 9 0 . 0 0 1 2 士 0 . 0 0 0 1 对 照 0 . 2 4 3 8 士 0 . 0 2 8 6 ‘ 0 . 0 0 1 8 士 0 . 0 0 0 2 注 : 与 对 照 组 比 较 ， ’ p < 0 . 0 5 表 2 一 4 两 组 大 鼠 股 骨 骨 小 梁 面 积 ( B V / T V ， % ) 、 成 骨 细 胞 面 积 ( O b . S / B S ， % ) 和 破 骨 细 胞 面 积 ( O e . S / B S ， % ) 的 比 较 ( 义 士 s ) 组 别 B V / T V ， % O b . S / B S ， % O e . S / B S ， % 对 照 1 8 . 0 1 士 7 . 5 0 3 4 . 2 6 士 7 . 9 3 3 2 . 2 2 士 8 . 8 5 干 预 2 2 . 6 2 士 7 . 9 7 4 5 . 7 4 土 7 . 8 1 * 3 5 . 2 2 士 6 . 5 3 注 : 与 对 照 组 比 较 ， ’ p < 。 . 0 5 2 . 2 两 组 大 鼠 血 清 G H 水 平 的 比 较 。 ( 见 图 2 一 3 ) 由 图 2 一 3 可 见 : 干 预 组 与 对 照 组 相 比 ， 血 清 G H 浓 度 明 显 升 高 ( 尸 < 0 . 0 5 ) ， 说 明 口 服 左 旋 精 氨 酸 能 够 促 进 垂 体 G H 的 合 成 和 分 泌 。 父 ! _ L 大 学 倾 卜 学 位 沦 文 G 5 t 3 0 0 0 0 0 0 0 0 侧 妊 趁 ) ︵ 、 ‘ H . 侧 。 口 … . 2 。 0 0 1 。 0 0 0 。 0 0 对 照 组 干 预 组 注 : n = 2 1 ; 与 对 照 组 比 较 ， ‘ 尸 < 0 . 0 5 图 2 一 3 两 组 大 鼠 血 清 G H 浓 度 的 比 较 ( x 士 s ) 2 . 3 两 组 大 鼠 下 丘 脑 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 、 p K G l l 、 G H R H 、 5 5 及 垂 体 G H m R N A 表 达 水 平 t 匕 较 。 ( 见 表 2 一 5 、 2 一 6 ) 由 表 2 一 5 、 2 一 6 可 见 : 干 预 组 与 对 照 组 相 比 ， 下 丘 脑 n N O S 及 S G C a l m R N A 表 达 明 显 上 调 ( P < 0 . o s ) ， 5 5 m R N A 表 达 水 平 明 显 下 调 ( P < 0 . 0 5 ) ， s G C p l 、 p K G l l 及 G H R H m R N A 表 达 水 平 稍 上 一 调 但 与 对 照 组 相 比 差 异 不 显 著 ; 垂 体 G H m R N A 表 达 水 平 显 著 上 调 ( 尸 < 0 . 0 1 ) 。 表 2 一 5 两 组 大 鼠 下 丘 脑 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 、 p K G l l m 洲 A 表 达 水 平 比 较 ( x 士 s ， 拷 贝 数 对 数 ) 组 别 月 n N O S s G C a l s G C p l p K o l l 对 照 1 5 2 . 4 5 士 0 . 2 2 2 . 6 4 士 0 . 1 9 1 . 4 3 士 0 . 1 2 2 . 7 8 士 0 . 1 5 干 预 1 5 2 . 6 6 士 0 . 2 3 ， 2 . 7 9 士 0 . 1 8 * 1 . 4 8 士 0 . 1 4 2 . 8 6 士 0 . 2 0 注 : 与 对 照 组 比 较 ， ’ P < 0 . 0 5 表 2 一 6 两 组 大 鼠 下 丘 脑 G H R H 、 5 5 及 垂 体 G H m R N A 表 达 水 平 比 较 ( 义 士 s ， 拷 贝 数 对 数 ) 组 别 G H R H 5 5 G H 对 照 ‘ ‘ 1 二 . . 勺 勺 . . 口 尸 1 . 1 0 士 0 . 2 5 1 . 3 9 士 0 . 2 8 2 . 0 6 士 0 . 2 4 干 预 1 . 2 9 士 0 . 2 6 1 . 1 1 士 0 . 3 0 ‘ 2 . 7 3 士 0 . 1 3 “ 注 : 与 对 照 组 比 较 ， 字 尸 < 0 . 0 5 ， “ 尸 < 0 . 0 1 2 . 4 两 组 大 鼠 下 丘 脑 n N O S 、 S G C a l 、 s G C p l 蛋 白 水 平 的 比 较 ( 图 2 一 4 ) 由 图 2 一 4 可 见 ， 口 服 L 一 精 氨 酸 后 大 鼠 下 丘 脑 n N O S 及 S G C a l 蛋 白水 平 明 显 上 调 父 日 . 人 ” 广 顿 ! 学 位 论 文 ( P < o . 0 5 ) ， s G c p l 蛋 白 水 平 与 对 照 组 相 比 无 明 显 差 异 。 2 1 2 2 1 2 1 2 1 2 屯 七 滚 n N O S ~ - ~ 一 s G C “ 1 一 ， ~ 一 s G C 日 1 明 禅 . . · o ^ P n H - . . 洲 冲 G ^ P n H 二 口 口 G ; P o l l A B C 吐 尸 O O 二 三 工 1 、 d 。 巴 。 日 ” 勺 、 l O d ﹃ 5 石 1 公 2 代 、 1 . 。 已 2 。 。 0 1 0 山 d ﹃ 工 三 U O O : 叱 / 1 l 巴 。 o 。 。 ” O 山 d j 注 : 。 一 6 ; 与 对 照 组 比 较 ， ’ 尸 < 0 . 0 5 ; 一 : 对 照 组 ， 2 : t 几 预 组 : A : n N o s 蛋 白 条 带 ( x 6 一 k o a ) ; B : s o C a - 蛋 白 条 ‘ { } 梦 ( 8 0 k D a ) ; C : s G e p l 蛋 白 条 ， { { 梦 ( 7 0 k D a ) ; o : 每 组 n N o S / G A p D H 蛋 白 比 值 进 行 统 计 学 分 析 结 果 ; E : 每 组 S G C 川 / G A P D H 蛋 白 比 值 进 行 统 计 学 分 析 结 果 ; F : 每 组 s G c p l / G A P D H 蛋 白 比 值 进 行 统 训 ‘ ’ 学 分 析 结 果 图 2 一 4 两 组 大 鼠 下 丘 脑 n N O S 、 s G C a l 、 s G C p l 蛋 白 水 平 的 比 较 ( x 士 s ) 3 讨 论 G H 具 有 显 著 的 促 进 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 [ 3 ’ ] 。 垂 体 G H 合 成 及 分 泌 增 加 可 通 过 血 循 环 到 达 长 骨 干 髓 端 的 软 骨 生 长 板 ， 刺 激 该 部 位 的 成 骨 细 胞 及 软 骨 细 胞 功 能 活 跃 ， 分 泌 大 量 的 胰 岛 素 样 生 氏 囚 子 一 I ( I G F 一 I ) 。 G H 可 直 接 作 用 ， 也 可 经 I G F 一 I 的 介 导 促 使 软 骨 细 胞 、 成 骨 细 胞 增 殖 ， 胶 原 及 硫 酸 粘 多 糖 增 多 ， 同 时 伴 有 骨 矿 物 质 沉 积 ， 加 速 骨 形 成 ， 从 而 促 进 骨 线 性 生 长 [ 3 2 ] 。 本 课 题 的 研 究 结 果 显 示 ， 口 服 L 一 精 氨 酸 可 促 进 垂 体 G H m R N A 的 表 达 并 提 高 血 清 G H 水 平 ， 使 得 胫 骨 生 长 板 宽 度 及 成 骨 细 胞 面 积 明 显 增 加 ， 从 而 显 著 地 促 进 长 骨 的 线 性 生 长 。 G H 是 由 垂 体 前 n 一 卜 嗜 酸 细 胞 分 泌 的 一 种 蛋 白 质 激 素 ， G H 的 合 成 、 释 放 受 下 丘 脑 G H R H 及 S S 的 调 控 。 对 G H 分 泌 起 调 竹 作 用 的 G H R H 神 经 元 分 布 于 下 丘 脑 的 弓 状 核 及 腹 内 侧 核 ， G H R H 的 作 用 为 促 进 腺 垂 体 G H 的 合 成 及 释 放 。 而 5 5 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 神 经 元 在 下 丘 脑 分 布 广 泛 ， 作 用 也 广 泛 ， 但 对 G H 分 泌 起 调 节 作 用 的 是 位 于 室 旁 核 的 5 5 神 经 元 ， 5 5 纤 维 伸 入 到 正 中 隆 起 ， 分 泌 的 5 5 经 垂 体 门 脉 系 统 作 用 于 垂 体 生 长 激 素 细 胞 ， 抑 制 G H 的 释 放 。 此 外 ， 室 旁 核 5 5 神 经 元 的 突 起 伸 入 到 弓 状 核 ， 抑 制 G H R H 神 经 元 的 作 用 ， 从 而 抑 制 垂 体 G H 的 合 成 。 大 量 研 究 证 实 精 氨 酸 主 要 通 过 抑 制 下 丘 脑 室 旁 核 神 经 元 5 5 的 分 泌 从 而 使 得 垂 体 G H 分 泌 增 加 [ 3 3 一 3 4 1 ， 这 一 结 论 目 前 已 被 广 泛 认 可 。 通 过 本 实 验 ， 我 们 亦 观 察 到 口 服 L 一 精 氨 酸 可 使 大 鼠 下 丘 脑 5 5 m R N A 表 达 明 显 下 调 而 G H m R N A 表 达 明 显 上 调 。 免 疫 组 化 显 示 n N O S 广 泛 存 在 于 哺 乳 动 物 下 丘 脑 核 团 ( 室 旁 核 、 视 上 核 ) 及 垂 体 细 胞 ( 生 长 激 素 细 胞 、 促 性 腺 激 素 细 胞 ) [ 3 5 一 3 6 ] 。 下 丘 脑 、 垂 体 组 织 细 胞 均 可 在 n N O S 作 用 下 以 L 一 精 氨 酸 为 底 物 生 成 N O 。 N O 是 重 要 的 神 经 内 分 泌 调 节 因 子 ， 涉 及 调 节 哺 乳 动 物 体 内 下 丘 脑 一 垂 体 轴 多 种 激 素 的 分 泌 ， 包 括 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 、 催 乳 素 、 黄 体 生 成 素 、 生 长 抑 素 、 生 长 激 素 等 [ 3 7 4 ’ ] 。 生 物 体 内 ， 可 溶 性 鸟 普 环 化 酶 ( s G c ) 是 N O 最 主 要 的 结 合 受 体 。 N O 合 成 释 放 后 在 邻 近 的 细 胞 间 迅 速 扩 散 并 激 活 细 胞 膜 上 的 s G C ， 后 者 使 细 胞 内 环 鸟 普 酸 ( c G M P ) 大 量 产 生 和 堆 积 ， 再 通 过 c G M P 依 赖 的 蛋 白 激 酶 ( P K G ) 、 c G M P 调 节 的 离 子 通 道 及 c G M P 调 节 的 磷 酸 二 酷 酶 发 挥 生 理 效 应 。 在 哺 乳 动 物 ， s G C a l 及 s G C 印 是 主 要 的 存 在 形 式 ， 高 表 达 于 脑 组 织 [ 4 2 ] ， 并 且 P K G l l 是 调 节 N O 作 用 的 主 要 下 游 因 子 [ 4 3 ] 。 N O 在 L 一 精 氨 酸 对 下 丘 脑 一 垂 体 激 素 调 节 上 起 着 重 要 作 用 ， 包 括 G H 的 分 泌 。 大 鼠 、 狗 动 物 实 验 中 均 发 现 N o 一 s G c 一 c G M P 参 与 了 G H R H 促 G H 分 泌 过 程 [ 4 4 书 〕 。 另 有 文 献 报 道 ， N O S 一 N O 一 s G C 一 c G M P 通 路 是 生 长 激 素 促 分 泌 剂 g h L r e l i n 诱 导 垂 体 G H 分 泌 的 重 要 途 径 [ 2 ’ 〕 。 本 课 题 采 用 左 旋 精 氨 酸 口 服 干 预 后 ， 血 清 G H 浓 度 显 著 升 高 ， 下 丘 脑 n N O S 、 S C G Q l 的 基 因 及 蛋 白 表 达 明 显 上 调 ， 5 5 m R N A 表 达 明 显 上 调 ， G H m R N A 表 达 上 调 。 结 果 表 明 ， 精 氨 酸 可 诱 导 n N O S 的 基 因 表 达 上 调 ， 使 中 枢 的 N O 产 生 增 多 ， 而 N O 通 过 其 信 号 转 导 通 路 s G C 一 c G M P 抑 制 5 5 m R N A 的 表 达 ， 使 垂 体 G H m R N A 表 达 上 调 ， 从 而 刺 激 垂 体 G H 的 合 成 及 分 泌 。 综 上 所 述 ， 口 服 左 旋 精 氨 酸 可 使 机 体 进 入 骨 形 成 大 于 骨 吸 收 的 正 平 衡 状 态 ， 并 显 著 促 进 长 骨 的 线 性 生 长 。 其 机 理 主 要 是 通 过 n N O S 一 N O 一 s G C 一 c G M P 通 路 抑 制 下 丘 脑 5 5 的 基 因 表 达 ， 从 而 刺 激 垂 体 G H 的 合 成 和 分 泌 。 血 清 G H 的 增 加 引 起 长 骨 生 长 板 宽 度 增 加 和 成 骨 细 胞 功 能 活 跃 ， 从 而 促 进 长 骨 的 线 性 生 长 。 本 课 题 从 神 经 内 分 泌 角 度 探 讨 口 服 精 氨 酸 促 进 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 机 制 ， 为 其 应 用 于 临 床 提 供 了 理 论 依 据 。 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 小 结 口 服 精 氨 酸 可 通 过 n N O S 一 O 一 s G C 一 c G M P 途 径 使 得 下 丘 脑 5 5 的 基 因 表 达 下 调 、 垂 体 G H 基 因 表 达 上 调 ， 从 而 使 垂 体 G H 的 合 成 及 分 泌 显 著 增 多 。 2 . 口 服 精 氨 酸 可 通 过 促 进 垂 体 G H 的 合 成 、 分 泌 增 多 ， 使 血 清 G H 的 水 平 明 显 增 高 ， 引 起 长 骨 生 长 板 宽 度 增 加 ， 成 骨 细 胞 功 能 活 跃 ， 从 而 显 著 促 进 长 骨 的 线 性 生 长 。 复 旦 少 ( 学 硕 一 } 丁 学 位 论 文 第 三 部 分 L 一 精 氨 酸 对 大 鼠 的 在 体 毒 性 研 究 L 一 精 氨 酸 是 天 然 存 在 的 活 性 氨 基 酸 ， 生 物 体 对 其 有 很 好 的 耐 受 性 。 适 当 的 补 给 精 氨 酸 对 人 类 或 动 物 体 而 言 是 安 全 的 [ 2 7 ] 。 鉴 于 局 部 器 官 组 织 学 切 片 及 超 微 结 构 可 以 更 直 观 地 反 映 机 体 组 织 学 与 特 定 细 胞 器 的 变 化 ， 我 们 重 点 观 察 口 服 精 氨 酸 后 S D 大 鼠 大 脑 皮 层 、 下 丘 脑 、 腺 垂 体 、 心 脏 、 肝 脏 、 肾 脏 等 重 要 脏 器 的 组 织 形 态 及 超 微 结 构 的 变 化 ， 观 察 其 可 能 的 毒 性 作 用 ， 以 评 价 L 一 精 氨 酸 用 于 临 床 治 疗 的 安 全 性 。 1 材 料 和 方 法 1 . 1 主 要 试 剂 配 制 0 . 2 M 磷 酸 钠 缓 冲 液 1 0 0 m L 0 . 2 m o l / L 磷 酸 二 氢 钠 水 溶 液 8 1 m L 0 . 2 m o l / L 磷 酸 氢 二 钠 水 溶 液 1 9 m L N a C I 0 . 9 9 4 % 多 聚 甲 醛 一 2 % 戊 二 醛 固 定 液 2 0 0 0 m L 多 聚 甲 醛 8 0 9 0 . 2 m o l / L 磷 酸 二 氢 钠 水 溶 液 2 0 0 m L 0 . 2 m o l / L 磷 酸 氢 二 钠 水 溶 液 8 0 0 m L d d H Z O 1 0 0 O m L 应 临 时 新 鲜 配 制 ， 加 温 至 6 0 o C ， 搅 拌 并 同 时 滴 入 I N N a O H 使 之 溶 解 ， 再 加 入 1 6 0 m L 的 2 5 % 戊 二 醛 溶 液 ， 用 l m o l 几 H C L 调 节 P H ， 4 O C 保 存 备 用 1 % 锹 酸 固 定 液 2 0 m L 2 % 饿 酸 溶 液 1 0 m L 0 . 2 M 磷 酸 钠 缓 冲 液 1 0 m L 1 . 2 主 要 仪 器 O l y m p u s B H Z 显 微 镜 日 本 L K B 一 1 型 超 薄 切 片 机 瑞 典 J E M 一 1 2 0 0 E X 透 射 电 镜 美 国 1 . 3 实 验 动 物 及 饲 养 条 件 3 5 天 S D 大 鼠 共 2 4 只 ， 雌 、 雄 各 1 2 只 ， 由 上 海 复 旦 大 学 动 物 实 验 中 ， 自 提 供 。 清 洁 级 动 物 房 ，温 度 为 ( 2 2 士 3 ) o C ， 相 对 湿 度 为 5 0 % ~ 6 0 % ， 1 2 / 1 2 h 明 暗 周 期 ， 动 物 食 用 标 准 颗 粒 饲 料 ， 自 由 饮 水 和 摄 食 。 复 旦 大 学 硕 : 卜 学 位 论 文 1 . 4 实 验 设 计 1 . 4 . 1 喂 饲 物 配 制 左 旋 精 氨 酸 由 南 京 制 药 厂 提 供 ， 以 蒸 馏 水 溶 解 ， 配 制 成 每 毫 升 含 精 氨 酸 0 . 0 4 5 9 的 口 服 溶 液 。 1 . 4 . 2 实 验 分 组 及 给 药 方 法 S D 大 鼠 随 机 分 成 对 照 组 和 干 预 组 ， 每 组 各 1 2 只 ( 雌 、 雄 各 半 ) 。 在 普 通 饲 料 喂 养 基 础 上 ， 对 照 组 喂 饲 生 理 盐 水 ; 干 预 组 喂 饲 精 氨 酸 口 服 溶 液 ; 每 只 I O m l 瓜 g 体 重 ， 每 天 1 次 ， 疗 程 1 2 周 。 1 . 4 . 3 石 蜡 组 织 切 片 干 预 结 束 后 ， 每 组 取 6 只 动 物 ( 雌 、 雄 各 半 ) 用 1 0 % 水 合 氯 醛 ( 0 . 3 m l / I O 0 g ) 腹 腔 麻 醉 ， 将 其 仰 卧 固 定 于 解 剖 板 上 ， 剑 突 下 开 胸 暴 露 心 脏 ， 找 到 心 尖 部 ， 直 视 下 将 磨 钝 的 穿 刺 针 经 左 心 室 插 入 升 主 动 脉 ， 在 右 心 耳 剪 开 一 小 口 放 血 ， 同 时 打 开 输 液 器 开 头 ， 先 用 2 0 0 一 2 5 O m L 生 理 盐 水 快 速 灌 注 ， 之 后 减 慢 灌 注 速 度 冲 洗 至 流 出 液 清 亮 ， 随 后 换 用 中 性 福 尔 马 林 2 5 0 m L 快 速 灌 注 ， 之 后 稍 减 慢 灌 注 速 度 继 续 固 定 。 在 灌 注 过 程 中 ，可 以 观 察 到 大 鼠 全 身 肌 肉 颤 动 ，后 逐 渐 僵 硬 、 强 直 ，此 时 断 头 取 脑 及 垂 体 ， 开 胸 取 心 脏 ， 开 腹 取 肝 脏 及 肾 脏 ， 置 入 上 述 相 同 固 定 液 中 后 固 定 2 一 3 d ， 然 后 用 生 理 盐 水 冲 洗 组 织 以 洗 去 固 定 液 ， 梯 度 酒 精 脱 水 ， 二 甲 苯 透 明 ， 石 蜡 包 埋 。 将 石 蜡 包 块 连 续 切 片 ， 切 片 厚 度 为 4 u m ， 行 常 规 H E 染 色 。 H E 染 色 步 骤 如 下 : ( l ) 烤 片 : 脱 蜡 前 ， 将 切 片 6 5 o C 左 右 恒 温 箱 内 烤 3 0 一 6 0 分 钟 ( 2 ) 脱 蜡 : ① 二 甲 苯 I I O m i n ② 二 甲 苯 1 1 1 o m i n ( 3 ) 复 水 : ① 无 水 酒 精 5 m i n ② 9 5 % 酒 精 s m i n ③ 8 0 % 酒 精 s m i n ④ 7 0 % 酒 精 s m i n ⑤ 蒸 馏 水 5 m i n ( 4 ) 染 色 ① 苏 木 精 液 中 5 一 1 0 m i n ② 用 自 来 水 洗 去 切 片 上 残 余 的 染 液 ③ 用 1 % 盐 酸 酒 精 分 色 数 分 钟 ④ 在 蒸 馏 水 中 浸 片 刻 复 旦 人 学 硕 十 学 位 论 文 ⑤ 入 l % 氨 水 浸 洗 ， 使 之 蓝 化 ⑥ 在 蒸 馏 水 中 浸 片 刻 ⑦ 0 . 5 % 伊 红 酒 精 溶 液 中 染 色 2 ~ 5 m i n ( 5 ) 脱 水 ① 7 5 % 酒 精 1 一 3 m i n ② 8 5 % 酒 精 l 一 3 m i n ③ 9 5 % 酒 精 ( I ) s m i n ④ 9 5 % 酒 精 ( 1 1 ) s m i n ⑤ 无 水 酒 精 ( x ) s m i n ⑥ 无 水 酒 精 ( 1 1 ) s m i n ( 6 ) 透 明 ① 1 : 1 无 水 酒 精 、 二 甲 苯 s m i n ② 二 甲 苯 ( I ) s m i n ③ 二 甲 苯 ( 1 1 ) s m i n ( 7 ) 封 片 擦 去 标 本 周 围 的 二 甲 苯 ， 在 材 料 中 央 滴 适 量 树 胶 ， 加 盖 玻 片 封 固 。 1 . 4 . 4 电 镜 组 织 切 片 : 其 余 动 物 用 1 0 % 水 合 氯 醛 ( 0 . 3 m l / l 0 0 9 ) 腹 腔 麻 醉 ， 将 其 仰 卧 固 定 于 解 剖 板 上 ， 剑 突 下 开 胸 暴 露 心 脏 ， 找 到 心 尖 部 ， 直 视 下 将 磨 钝 的 穿 刺 针 经 左 心 室 插 入 升 主 动 脉 ， 在 右 心 耳 剪 开 一 小 口 放 血 ， 同 时 打 开 输 液 器 开 头 ， 先 用 2 0 0 一 2 5 0 m L 生 理 盐 水 快 速 灌 注 ， 之 后 小 减 慢 灌 注 速 度 冲 洗 至 流 出 液 清 亮 ， 随 后 换 用 4 % 多 聚 甲 醛 一 2 % 戊 二 醛 ( p H 7 4 ) 混 合 固 定 液 2 5 0 m L 快 速 灌 注 ， 之 后 稍 减 慢 灌 注 速 度 继 续 固 定 。 在 灌 注 过 程 中 ， 可 以 观 察 到 大 鼠 全 身 肌 肉 颤 动 ， 后 逐 渐 僵 硬 、 强 直 ， 此 时 断 头 取 脑 及 垂 体 ， 开 胸 取 心 脏 ， 开 腹 取 肝 脏 及 肾 脏 ， 解 剖 分 离 出 大 脑 额 叶 皮 层 、 下 丘 脑 、 腺 垂 体 、 左 心 室 、 ’ 肾 皮 质 、 肝 小 叶 ， 取 l r n n 1 X I ~ x l ~ 左 右 的 小 块 ， 立 即 置 入 相 同 固 定 液 中 。 4 o C 固 定 2 4 h 后 ， 用 o . o l m o l 几 磷 酸 缓 冲 生 理 盐 液 ( p H 7 . 4 ) 将 固 定 好 的 组 织 冲 洗 3 次 ， 每 次 1 0 m i n 。 然 后 用 1 % 饿 酸 固 定 Z h 。 再 用 0 . O l m o l 几 磷 酸 缓 冲 生 理 盐 液 ( p H 7 . 4 ) 将 固 定 好 的 组 织 冲 洗 3 次 ， 每 次 1 o m i n 。 冲 洗 完 毕 后 用 乙 醇 、 丙 酮 梯 度 脱 水 ( 3 0 % 乙 醇 1 0 m i ~ 5 0 % 乙 醇 1 o m i n 一 7 0 % 乙 醇 I O m l n 一 9 0 % 乙 醇 一 o m i n 一 1 0 0 % 丙 酮 一 o m i n X 3 次 ) ， 环 氧 树 脂 包 埋 。 将 包 块 连 续 切 片 ， 切 片 厚 度 约 5 0 一 7 0 n m 。 超 薄 切 片 经 饱 和 醋 酸 钠 铀 一 构 栋 酸 铅 染 色 后 在 J E M 一 1 2 0 O E X 透 射 电 镜 下 观 察 。 2 结 果 2 . 1 光 镜 观 察 结 果 父 旦 大 学 顾 士 学 位 论 文 对 照 组 可 见 : 大 脑 皮 层 神 经 细 胞 数 量 多 ， 细 胞 排 列 整 齐 ， 胞 浆 丰 富 ， 神 经 细 胞 核 大 而 圆 ， 核 仁 明 显 ( 图 3 一 l ) ; 下 丘 脑 细 胞 完 整 ， 胞 浆 丰 富 ， 胞 核 深 染 ， 核 仁 清 晰 ， 无 水 肿 和 坏 死 ， 未 见 炎 性 细 胞 浸 润 ( 图 3 一 3 ) ; 垂 体 嗜 酸 性 细 胞 呈 圆 形 ， 胞 质 内 充 满 粗 大 ， 整 齐 嗜 酸 性 颗 粒 ; 嗜 碱 性 细 胞 较 嗜 酸 性 细 胞 大 ， 胞 浆 蓝 染 ， 各 种 细 胞 比 例 及 分 布 未 见 异 常 ( 图 3 一 5 ) ; 心 肌 纤 维 排 列 规 则 ， 纵 横 纹 清 晰 可 见 ， 内 外 膜 结 构 完 整 ， 肌 核 清 晰 可 见 ， 心 肌 间 质 血 管 扩 张 不 明 显 ( 图 3 一 7 ) ; 肝 小 叶 结 构 清 楚 ， 肝 细 胞 排 列 整 齐 ， 未 见 肝 细 胞 变 性 坏 死 ， 中 央 静 脉 及 肝 窦 扩 张 不 明 显 ， 汇 管 区 未 见 炎 细 胞 浸 润 ( 图 3 一 9 ) ; 肾 小 球 完 整 ， ’ 肾 小 管 结 构 清 楚 、 正 常 ， ‘ 肾 小 管 上 皮 细 胞 无 明 显 肿 胀 和 坏 死 ， 肾 间 质 及 肾 小 球 无 充 血 和 炎 症 细 胞 浸 润 ( 图 3 一 1 1 ) ; 干 预 组 与 对 照 组 相 比 ， 以 上 组 织 均 未 见 病 理 学 改 变 ( 图 3 一 2 、 3 一 4 、 3 一 6 、 3 一 8 、 3 一 1 0 、 3 一 1 2 ) 。 图 3 一 1 对 照 组 大 脑 皮 层 组 织 ( X 4 O O ) 图 3 一 2 干 预 组 大 脑 皮 层 组 织 ( X 4 0 0 ) 图 3 一 3 对 照 组 下 丘 脑 组 织 ( X 4 0 0 ) 图 3 一 4 干 预 组 下 丘 脑 组 织 ( X 4 0 0 ) 艾 { { 人 学 顾 1 学 位 沦 义 咚 ! 3 一 5 对 照 组 垂 体 组 织 ( x 4 0 0 ) 咚 1 3 一 6 卜 预 红 1 . 垂 体 亥 1 } 织 ( X 4 0 0 ) J 冬 1 3 一 7 又 寸 照 到 } _ 心 J J ) L 全 } I ‘ 织 ( 又 4 0 0 ) ! 纠 3 一 8 1 二 r 贞 全 1 1 . ， 已 、 ) J ) L 全 { } 织 ( 只 4 0 0 ) l 冬 1 3 一 9 对 J 狱 夕 ! { j { I ; ) J 卜 ) 至 I } 织 ( X 4 0 0 ) 咚 】 3 一 1 0 } 1 预 竺 ! L ) { 1 二 玫 1 至 1 上 织 ( X 4 O O ) 义 以 大 学 硕 士 学 位 论 文 图 3 一 n 对 照 组 肾 脏 组 织 ( X 4 O O ) 图 3 一 1 2 干 预 组 肾 脏 组 织 ( x 4 0 0 ) 2 . 2 透 射 电 镜 观 察 结 果 对 照 组 可 见 : 大 脑 皮 层 神 经 元 细 胞 形 态 完 整 ， 可 见 丰 富 的 粗 面 内 质 网 、 游 离 核 糖 体 和 线 粒 体 ; 线 粒 体 峭 清 晰 ， 排 列 规 则 ; 核 膜 清 晰 ， 核 内 染 色 质 以 常 染 色 质 为 主 ， 核 仁 明 显 ， 突 起 内 可 见 明 显 的 微 管 、 神 经 丝 ; 突 出 结 构 正 常 ; 髓 鞘 板 层 结 构 完 整 ( 图 3 一 A ) 。 下 丘 脑 组 织 神 经 元 核 形 态 规 则 ， 核 膜 完 整 ， 染 色 质 分 布 均 匀 ; 细 胞 器 丰 富 ， 粗 面 内 质 网 分 布 规 则 ， 网 腔 均 匀 一 致 ， 表 面 附 有 较 多 核 糖 体 颗 粒 ; 胞 质 中 还 可 见 许 多 大 小 一 致 、 分 布 均 匀 的 游 离 核 糖 体 ; 线 粒 体 发 达 ， 其 双 层 膜 和 内 部 的 晴 清 晰 可 见 ; 高 尔 基 复 合 体 极 性 明 显 ， 囊 腔 规 则 ( 图 3 一 C ) 。 垂 体 组 织 细 胞 形 态 完 整 ， 结 构 清 晰 ， 含 有 各 种 大 小 不 等 、 形 态 不 一 的 分 泌 ; 细 胞 核 形 态 规 则 ， 核 膜 光 滑 ， 染 色 质 分 布 均 匀 ; 细 胞 器 结 构 正 常 ( 图 3 一 E ) 。 心 肌 组 织 细 胞 肌 原 纤 维 的 肌 丝 排 列 较 紧 密 ， 并 呈 有 规 律 的 排 列 ， 润 盘 清 晰 ; 线 粒 体 规 则 地 排 列 于 肌 原 纤 维 两 侧 ， 形 状 大 多 呈 椭 圆 形 ， 晴 清 晰 可 见 ， 较 丰 富 ， 核 为 椭 圆 形 ， 核 膜 光 滑 ， 有 1 一 2 个 核 仁 ( 图 3 一 G ) 。 肝 脏 组 织 细 胞 形 态 规 则 ， 细 胞 浆 中 见 少 量 脂 滴 ， 有 丰 富 的 线 粒 体 粗 面 内 质 网 和 糖 原 颗 粒 ， 线 粒 体 靖 正 常 而 清 晰 ， 核 呈 圆 形 ， 有 1 一 2 个 核 仁 ， 核 内 以 常 染 色 质 为 主 ， 着 色 较 浅 ( 图 3 一 I ) 。 肾 脏 组 织 细 胞 核 核 膜 完 整 、 核 仁 清 晰 、 核 染 色 质 分 布 均 匀 ， 近 端 小 管 刷 状 缘 微 绒 毛 结 构 完 整 、 排 列 紧 密 而 规 则 ( 图 3 一 K ) ; 干 预 组 与 对 照 组 相 比 ， 以 上 组 织 均 未 见 超 微 结 构 的 改 变 ( 图 3 一 B 、 3 一 D 、 3 一 F 、 3 一 H 、 ) 3 一 J 、 3 一 L ) 。 父 l ! . 人 学 硕 卜 学 位 论 文 图 3 一 A 对 照 组 大 脑 皮 层 组 织 ( x 3 8 0 0 ) 图 3 一 B 干 预 组 大 脑 皮 层 组 织 ( X 3 8 0 0 ) 图 3 一 C 对 照 组 下 _ l 创 1 亩 组 织 ( x 4 0 0 0 ) 图 3 一 D 干 预 组 下 丘 脑 组 织 ( X 3 8 0 0 ) 图 3 一 E 对 照 f l l . 垂 体 组 织 ( x 3 7 5 0 ) 图 3 一 F 干 预 组 垂 体 组 织 ( X 4 8 0 0 ) 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 图 3 一 G 对 照 组 心 肌 组 织 ( X 3 6 5 0 ) 图 3 一 H 干 预 组 心 肌 组 织 ( x 4 0 0 0 ) 图 3 一 I 对 照 组 肝 脏 组 织 ( 又 2 8 5 0 ) 图 3 一 J 干 预 组 肝 脏 组 织 ( X 2 8 5 0 ) 图 3 一 K 对 照 组 肾 脏 组 织 ( X 3 8 0 0 ) 图 3 一 L 干 预 组 肾 脏 组 织 ( X 4 2 0 0 ) 复 巨 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 讨 论 除 合 成 蛋 白 质 外 ， L 一 精 氨 酸 主 要 转 化 成 一 氧 化 氮 、 鸟 氨 酸 、 脯 氨 酸 、 肌 酸 、 精 胺 及 尿 素 [ 4 6 】 ， 这 些 代 谢 产 物 对 维 持 机 体 的 健 康 有 着 重 要 作 用 。 当 机 体 处 于 疾 病 状 态 ( 如 : 应 激 、 创 伤 、 炎 症 ) 或 发 育 阶 段 ( 如 : 胎 儿 、 新 生 儿 、 婴 幼 儿 等 未 成 年 个 体 ) ， 靠 自身 合 成 是 远 远 不 够 的 ， 还 需 要 额 外 补 充 L 一 精 氨 酸 1 4 7 ] 。 目 前 的 研 究 认 为 L 一 精 氨 酸 的 安 全 性 主 要 取 决 于 其 用 量 和 用 法 ( 口 服 、 灌 胃 、 静 脉 滴 注 或 腹 腔 注 射 ) ， 适 当 的 补 给 L 一 精 氨 酸 对 人 类 和 动 物 体 没 有 毒 性 作 用 / 副 作 用 。 新 生 仔 猪 、 怀 孕 母 猪 和 成 年 大 鼠 耐 受 的 精 氨 酸 最 大 口 服 剂 量 分 别 是 0 . 6 2 、 0 . 2 1 、 2 . 1 4 9 瓜 g 体 重 旧 [ 4 8 ] 。另 外 ， 研 究 表 明 成 人 每 日 口 服 9 g 或 3 0 分 钟 内 静 脉 滴 注 3 0 9 精 氨 酸 不 会 产 生 任 何 不 良 反 应 1 4 9 ] 。 L 一 精 氨 酸 主 要 由 肝 脏 合 成 ， 并 经 肾 脏 排 泄 ， 体 内 代 谢 过 程 十 分 复 杂 [ 5 0 一 ， ’ ] 。 L - 精 氨 酸 及 其 代 谢 产 物 对 机 体 许 多 脏 器 和 器 官 均 有 重 要 影 响 。 此 外 观 察 局 部 器 官 组 织 学 切 片 可 以 更 直 观 地 反 映 组 织 的 病 理 学 改 变 ， 观 察 组 织 的 超 微 结 构 可 以 更 直 观 地 反 映 特 定 细 胞 器 的 变 化 。 因 此 ， 我 们 主 要 探 讨 长 期 口 服 精 氨 酸 后 大 鼠 大 脑 皮 层 、 下 丘 脑 、 腺 垂 体 、 心 脏 、 肝 脏 及 肾 脏 的 病 理 组 织 学 变 化 与 特 定 细 胞 器 的 超 微 结 构 变 化 。 本 实 验 病 理 切 片 观 察 ， 每 组 大 鼠 的 大 脑 皮 层 、 下 丘 脑 、 腺 垂 体 、 心 脏 、 肝 脏 及 肾 脏 均 没 有 炎 症 反 应 或 者 组 织 结 构 的 改 变 。 电 镜 观 察 超 微 结 构 显 示 ， 大 脑 皮 层 、 下 丘 脑 、 腺 垂 体 、 心 脏 、 肝 脏 、 肾 脏 的 细 胞 核 、 细 胞 膜 及 各 细 胞 器 均 无 明 显 变 化 。 说 明 该 课 题 中 左 旋 精 氨 酸 的 剂 量 和 疗 程 均 在 安 全 范 围 内 ， 对 重 要 脏 器 无 明 显 毒 副 作 用 。 刁 、 结 本 课 题 中 左 旋 精 氨 酸 的 剂 量 和 疗 程 均 在 安 全 范 围 内 ， 对 重 要 脏 器 无 明 显 毒 副 作 用 。 复 旦 大 学 硕 十 学 位 论 文 结 论 口 服 精 氨 酸 能 够 促 进 矮 小 儿 童 身 高 的 增 长 ， 并 使 骨 质 代 谢 处 于 正 平 衡 状 态 ， 且 无 明 显 不 良 反 应 。 2 . 口 服 精 氨 酸 可 通 过 n N O S 一 N O 一 s G C 一 c G M P 途 径 使 得 下 丘 脑 5 5 的 基 因 表 达 下 调 、 垂 体 G H 基 因 表 达 上 调 ， 从 而 使 垂 体 G H 的 合 成 及 分 泌 显 著 增 多 。 3 . 口 服 精 氨 酸 可 通 过 促 进 垂 体 G H 的 合 成 、 分 泌 增 多 ， 使 血 清 G H 的 水 平 显 著 增 高 ， 引 起 长 骨 生 长 板 宽 度 增 加 ， 成 骨 细 胞 功 能 活 跃 ， 从 而 显 著 促 进 长 骨 的 线 性 生 长 。 4 . 本 课 题 中 左 旋 精 氨 酸 的 剂 量 和 疗 程 均 在 安 全 范 围 内 ， 对 重 要 脏 器 无 明 显 毒 副 作 用 。 创 新 点 1 . 提 出 了 采 用 左 旋 精 氨 酸 口 服 ， 以 持 续 而 缓 和 地 刺 激 腺 垂 体 分 泌 G H ， 从 而 促 进 身 材 矮 小 患 儿 身 高 增 长 的 想 法 。 2 . 从 N O 依 赖 的 信 号 转 导 通 路 对 下 丘 脑 一 垂 体 生 长 轴 功 能 的 促 进 作 用 的 角 度 ， 探 讨 口 服 精 氨 酸 促 进 长 骨 线 性 生 长 的 作 用 机 制 。 复 旦 少 、 学 硕 卜 学 位 论 文 参 考 文 献 【 l ] P a s s C ， M a e R a e V E ， A h l n e d S F ， e t a l . I n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d t h e G H / I G F 一 I a X I S : n 0 V e l a c t i o n s o n b o n e g r o w t h 【 J l . C e l l B i o e h e m F u n c t ， 2 0 0 9 ， 2 7 ( 3 ) : 1 1 9 一 1 2 7 . 【 2 」 v a n V u g h t A J ， N i e u w e n h u i z e n A G ， B r u m m e r R J ， e t a l . E f f e e t s o f o r a l i n g e s t i o n o f a m i n o a c i d s a n d P r o t e i n s o n t h e s o m a t o t r o P i e a x i s [ J ] . J C l i n E n d o c r i n o l M e t a b ， 2 0 0 8 ， 9 3 ( 2 ) : 5 8 4 一 5 9 0 . [ 3 ] 王 卫 平 . 儿 科 学 「 M ] . 第 1 版 . 北 京 ， 高 等 教 育 出 版 社 ， 2 0 0 4 ， 3 2 7 一 3 3 1 . 【 4 」 d e O n i s M ， F r o n g i l l o E A ， B l o s s n e r M . I s m a l n u t r i t i o n d e e l i n i n g ? A n a n a l y s i s o f e h a n g e s i n l e v e l s o f e h i l d m a l n u t r i t i o n s i n c e 1 9 8 0 [ J 」 . B u l l W o r l d H e a l t h O r g a n ， 2 0 0 0 ， 7 8 ( 1 0 ) : 1 2 2 2 一 1 2 3 3 . [ 5 l 支 涤 静 ， 沈 水 仙 ， 赵 诸 慧 等 . 身 材 矮 小 儿 童 5 2 3 例 病 因 分 析 [ J 1 . 实 用 儿 科 临 床 杂 志 ， 2 0 0 6 ， 2 1 ( 8 ) : 4 7 7 一 4 7 8 . [ 6 」 S t e i n h a u s e n H C ， D o r r H G ， K a n n e n b e r g R ， e t a l . T h e b e h a v i o r P r o f i l e o f e h i l d r e n a n d a d o l e s c e n t S W i t h s h o r t s t a t u r e [ J 」 . J D e v B e h a v p e d i a t r ， 2 0 0 0 ， 2 1 ( 6 ) : 4 2 3 一 4 2 5 . 【 7 」 V i s s e r 一 v a n B a l e n H ， S i n n e m a G ， G e e n e n R . G r o w i n g u P w i t h i d i o P a t h i e s h o r t s t a t u r e : P s y c h o s o c i a l d e v e l o P m e n t a n d h o r m o n e t r e a t m e n t : a e r i t i e a l r e v i e w [ J ] . A I c h D i s C h i l d ， 2 0 0 6 ， 9 1 ( 5 ) : 4 3 3 一 4 3 9 . 【 8 」 S a r t o r i o A ， C o n t i A ， M o l i n a r i E ， e t a l . G r o w t h ， g r o w - t h h o r m o n e a n d e o g n i t i v e f u n c t i o n s 【 J 〕 · H o r m R e s ， 1 9 9 6 ， 4 5 ( 1 一 2 ) 二 2 3 一 2 9 . 「 9 ] A P t e r A ， G a l a t z e r A ， W e i z m a n A ， e t a l . P s y e h o l o g i e a l a s P e c t s o f d e v e l o P m e n t a l e n d o c r i n o p a t h i e s i n a d o l e s C e n e e [ J l . I s r J p s y e h i a t 仃 R e l a t s e i ， 1 9 9 4 ， 3 1 ( 4 ) : 2 4 6 一 2 5 3 . 「 1 0 1 顾 学 范 . 身 材 矮 小 的 鉴 别 诊 断 和 处 理 [ J ] . 临 床 儿 科 杂 ， 2 0 0 2 ， 2 0 ( 2 ) : 1 2 4 一 1 2 8 . 【 1 1 」 C h e v a l l e y T ， R i z z o l i R ， M a n e n D ， e t a l . A r g i n i n e i n e r e a s e s i n s u l i n 一 l i k e g r o w t h f a e t o r 一 1 p r o d u c t i o n a n d e o l l a g e n s y n t h e s i s i n o s t e o b l a s t 一 l i k e e e l l s 【 J ] . B o n e ， 1 9 9 8 ， 2 3 ( 2 ) : 1 0 3 一 1 3 9 . [ 1 2 ] Z a j a e A ， P o P r z e e k i S ， Z e b r o w s k a A ， e t a l . A r g i n i n e a n d o r n i t h i n e s u P P l e m e n t a t i o n i n e r e a s e s g r o w t h h o r m o n e a n d i n s u l i n 一 l i k e g r o w t h f a e t o r 一 1 s e r u m l e v e l s a f t e r h e a V y 一 r e s i s t a n c e e X e r c i s e i n s t r e n g t h 一 t r a i n e d a t h l e t e s 【 J 」 . J S t r e n g t h C o n d R e s ， 2 0 1 0 ， 2 4 ( 4 ) : 1 0 8 2 一 1 0 9 0 . 「 1 3 」 王 德 芬 . 生 长 激 素 与 生 长 激 素 治 疗 [ M 」 ， 第 1 版 . 上 海 ， 上 海 科 学 技 术 文 献 出 版 社 ， 1 9 9 8 ， 3 3 一 4 3 . ! 1 4 ] 诸 福 棠 . 实 用 儿 科 学 [ M ] . 第 7 版 . 北 京 ， 人 民 卫 生 出 版 社 ， 2 0 0 2 ， 3 9 一 4 2 . 复 口 _ 人 学 硕 } 学 位 论 文 [ 巧 〕 蔡 德 培 . 正 常 青 春 发 育 及 其 临 床 评 价 [ J ] . 中 国 实 用 儿 科 杂 志 ， 2 0 0 6 ， 2 1 ( 7 ) : 4 8 3 - 4 8 5 . 1 1 6 1 蔡 德 培 . 滋 阴 泻 火 中 药 为 主 对 改 善 性 早 熟 儿 童 骨 骼 发 育 作 用 及 机 理 的 探 讨 [ J ] . 中 医 杂 志 ， 1 9 9 7 ， 3 8 ( 1 0 ) : 6 1 5 一 6 1 7 . 【 1 7 」 A n d r e a s s e n T T ， J o r g e n s e n P H ， F l y v b j e r g A ， e t a l . G r o w t h h o r m o n e s t i m u l a t e s b o n e f o r m a t i o n a n d s t r e n g t h o f e o r t i e a l b o n e i n a g e d r a t s l J 〕 . J B o n e M i n e r R e s ， 1 9 9 5 ， 1 0 ( 7 ) : 1 0 5 7 一 1 0 6 7 . 【 1 8 」 D i e g u e z C ， P a g e M D ， S e a n l o n M F . G r o w t h h o r m o n e n e u r o r e g u l a t i o n a n d i t s a l t e r a t i o n s i n d i s e a s e s t a t e s [ J ] . C l i n E n d o e r i n o l ， 1 9 8 8 ， 2 8 ( 1 ) : 1 0 9 一 1 4 3 . 1 1 9 ] K a t o Y ， M u r a k a m i Y ， S o h l l l i y a M ， e t a l . R e g u l a t i o n o f h u m a n g r o 叭 h h o r m o n e S e c r e t i o n a n d i t s d i s o r d e r s [ J 」 . I n t e r n M e d ， 2 0 0 2 ， 4 1 ( l ) : 7 一 1 3 . [ Z O J F r o l l m a n L A ， D o 二 5 T R ， C h o m c z y n s k i P . R e g u l a t i o n o f g r o w t h h o r m o n e s e c r e t i o n [ J 」 . F r o n t N e u r o e n d o e r i n o l ， 1 9 9 2 ， 1 3 ( 4 ) : 3 4 4 一 4 0 5 . [ 2 1 ] R o d r i g u e z 一 P a e h e c o F ， L u q u e R M ， T e n a 一 S e m P e r e M ， e t a l . G h r e l i n i n d u c e s g r o w t h h o r m o n e s e e r e t i o n v i a a n i t r i e o x i d e / e G M P s i g n a l l i n g P a t h w a y t J 」 . J o u r n a l o f N e u r o e n d o e r i n o l o g y ， 2 0 0 8 ， 2 0 ( 3 ) : 4 0 6 书 2 2 . [ 2 2 ] M e r i m e e T J ， L i l l i e r a P D A ， R a b i n o w i t z D . E f f e c t o f a r g i n i n e o n s e r u m 一 l e v e l s o f h u m a n g r 0 W t h 一 h o r m o n e 【 J ] . L a n c e t ， 1 9 6 5 ， 2 ( 7 4 2 4 ) : 6 6 8 一 6 7 0 . [ 2 3 ] A d r i 巨 o M ， C h r i s m a n C J ， B i e l a v s k y M ， e t a l . A r g i n i n e i n e r e a s e s g r o w t h h o r m o n e g e n e e x p r e s s i o n i n r a t p i t u i t a r y a n d G H 3 e e l l s 【 J ] . N e u r o e n d o e r i n o l o g y ， 2 0 0 4 ， 7 9 ( l ) : 2 6 - 3 3 . [ 2 4 ] G h i g o E ， B e l l o n e J ， M a z z a E ， e t a l . A r g i n i n e P o t e n t i a t e s t h e G H R H 一 b u t n o t t h e P y r i d o s t i g m i n e 一 i n d u e e d G H s e e r e t i o n i n n o r m a l s h o r t c h i l d r e n . F u r t h e r e v i d e n c e f o r a s o m a t o s t a t i n s u P P r e s s i n g e f f e e t o f a r g i n i n e 【 J ] . C l i n E n d o c r i n o l ， 1 9 9 0 ， 3 2 ( 6 ) : 7 6 3 一 7 6 7 . 仁 2 5 1 G h i g o E ， C e d a G P ， V a l e a v i R ， e t a l . L o w d o s e s o f e i t h e r i n t r a v e n o u s l y o r o r a l l y a d m i n i s t e r e d a r g i n i n e a r e a b l e t o e n h a n c e g r o w t h h o r m o n e r e s P o n s e t o g r o w t h h o r m o n e r e l e a s i n g h o r m o n e i n e l d e r l y s u b j e e t s [ J ] . J E n d o e r i n o l I n v e s t ， 1 9 9 4 ， 1 7 ( 2 ) : 1 1 3 一 1 1 7 . 【 2 6 」 S u m i n s k i R R ， R o b e r t s o n R J ， G o s s F L ， e t a l . A e u t e e f f e e t o f a m i n o a e i d i n g e s t i o n a n d r e s i s t a n e e e x e r e i s e o n p l a s m a g r o w t h h o r m o n e e o n e e n t r a t i o n i n y o u n g m e n 【 J l . I n t J S p o r t N u t r ， 1 9 9 7 ， 7 ( l ) : 4 8 一 6 0 . [ 2 7 ] W u G ， B a z e r F W ， D a v i s T A ， e t a l . A r g i n i n e m e t a b o l i s m a n d n u t r i t i o n i n g r o w t h ， h e a l t h a n d d i s e a s e 【 J l . A m i n o A e i d s ， 2 0 0 9 ， 3 7 ( 1 ) : 1 5 3 一 1 6 8 . [ 2 8 」 B l u m A ， C a n L n o n R O 3 r d ， C o s t e l l o R ， e t a l . E n d o e r i n e a n d l i P i d e f f e e t s o f o r a l 4 2 复 旦 人 学 硕 七 学 位 论 文 L 一 a r g i n i n e t r e a t m e n t i n h e a l t h y p o s t m e n o p a u s a l w o m e n [ J ] . J L a b C l i n M e d ， 2 0 0 0 ， 1 3 5 ( 3 ) : 2 3 1 一 2 3 7 . 【 2 9 」 C o l l i e r S R ， C a s e y D P ， K a n a l e y J A . G r o w t h h o r m o n e r e s P o n s e s t o v a r y i n g d o s e s o f o r a l a r g i n i n e 【 J 」 · G r o w t h H o r m I G F R e s ， 2 0 0 5 ， 1 5 ( 2 ) : 1 3 6 一 1 3 9 . 【 3 0 ] d e C a s t r o B a r b o s a T ， L o u r e n e o P o y a r e s L ， F a b r e s M a e h a d o U ， e t a l . C h r o n i e o r a l a d m i n i s t r a t i o n o f a r g i n i n e i n d u e e s G H g e n e e x P r e s s i o n a n d i n s u l i n r e s i s t a n e e 【 J 」 . L i f e S e i ， 2 0 0 6 ， 7 9 ( 1 5 ) : 1 4 4 4 一 1 4 4 9 . [ 3 1 ] v a n d e r E e r d e n B C ， K a 印 e r i e n M ， W i t J M . S y s t e m i e a n d l o e a l r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h P l a t e [ J } . E n d o e r R e v ， 2 0 0 3 ， 2 4 ( 6 ) : 7 8 2 一 8 0 1 . [ 3 2 ] R o s e n C J ， D o n a h u e L R ， H u n t e r S J . I n s u l i n 一 I i k e g r o 叭 h f a e t o r s a n d b o n e : t h e o s t e o p o r o s i s c o n n e c t i o n [ J ] . p r o c S o e E x p B i o l M e d ， 1 9 9 4 ， 2 0 6 ( 2 ) : 8 3 一 1 0 2 . 1 3 3 ] C a s a n u e v a F F . P h y s i o l o g y o f g r o w t h h o r m o n e s e e r e t i o n a n d a e t i o n f J ] . E n d o e r i n o l M e t a b C l i n N o r t h A m ， 1 9 9 2 ， 2 1 ( 3 ) : 4 8 3 一 5 1 7 . 【 3 4 ] A l b a 一 R o t h J ， M u l l e r O A ， S e h o P o h l J ， e t a l . A i g i n i n e s t i m u l a t e s g r o w t h h o r m o n e s e e r e t i o n b y s u P P r e s s i n g e n d o g e n o u s s o m a t o s t a t i n s e e r e t i o n 【 J 」 . J C l i n E n d o e r i n o l M e t a b ， 1 9 8 8 ， 6 7 ( 6 ) : 1 1 8 6 一 1 1 8 9 . 【 3 5 ] B r e d t D S ， S n y d e r S H . I s o l a t i o n o f n i t r i e o x i d e s y n t h e t a s e ， a c a l m o d u l i n 一 r e q u i r i n g e n z y m e l J 」 . P r o e N a t l A e a d S e i U S A ， 1 9 9 0 ， 8 7 ( 2 ) : 6 8 2 一 6 8 5 . [ 3 6 ] Q i a n X ， J i n L ， L l o y d R V . P e r e o l l d e n s i t y g r a d i e n t 一 e n r i e h e d P o P u l a t i o n s o f r a t P i t u i t a r y e e l l s : i n t e r l e u k i n 6 s e e r e t i o n ， P r o l i f e r a t i v e a e t i v i t y ， a n d n i t r i e o x i d e s y n t h a s e e x P r e s s i o n 【 J ] . E n d o e r P a t h o l ， 1 9 9 8 ， 9 ( l ) : 3 3 9 一 3 4 6 . [ 3 7 } M o r e t t o M ， L o P e Z F J ， N e g r o 一 V i l a r A . N i t r i e o X i d e r e g u l a t e s l u t e i n i z i n g h o r m o n e - r e l e a s i n g h o r m o n e s e e r e t i o n [ J ] . E n d o e r i n o l o g y ， 1 9 9 3 ， 一 3 3 ( 5 ) : 2 3 9 9 一 2 4 0 2 . 【 3 8 ] A g u i l a M C . G r o w t h h o r m o n e 一 r e l e a s i n g f a e t o r i n e r e a s e s s o m a r o s t a t i n r e l e a s e a n d m R N A l e v e l s i n t h e r a t P e r i v e n t r i e u l a r n u e l e u s v i a n i t r i c o x i d e b y a e t i v a t i o n o f g u a n y l a t e e y c l a s e 【 J 〕 . P r o e N a t l A e a d S e i U S A ， 1 9 9 4 ， 9 1 ( 2 ) : 7 8 2 一 7 8 6 . 【 3 9 ] D u v i l a n s k i B H ， Z a m b r u n o C ， L a s a g a M ， e t a l . R o l e o f n i t r i c o x i d e / e y c l i e G M P P a t h w a y i n t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f G A B A a n d d o P a m i n e o n P r o l a e t i n r e l e a s e 「 J ] . J N e u r o e n d o e r i n o l ， 1 9 9 6 ， 8 ( 2 2 ) : 9 0 9 一 9 1 3 . 【 4 0 ] C e e e a t e l l i S ， H u l t i n g A L ， Z h a n g X ， e t a l . N i t r i e o x i d e s y n t h a s e i n t h e r a t a n t e r i o r P i t u i t a r y g l a n d a n d t h e r o l e o f n i t r i e o x i d e i n r e g u l a t i o n o f l u t e i n i z i n g h o r m o n e S e c r e t i o n 【 J 」 · p r o c N a t l A e a d S e i U S A ， 1 9 9 3 ， 9 0 ( 2 3 ) : 1 1 2 9 2 一 1 1 2 9 6 . 【 4 1 」 K a t o M . I n v o l v e m e n t o f n i t r i e o x i d e i n g r o w t h h o r m o n e ( G H ) 一 r e l e a s i n g h o r m o n e 一 i n d u c e d G H s e e r e t i o n i n r a t p i t u i t a r y c e l l s 【 J ] . E n d o c r i n o l o g y ， 1 9 9 2 ， 1 3 1 ( 5 ) : 复 口 . 人 学 硕 : 1 学 位 论 文 2 1 3 3 一 2 1 3 8 . 【 4 2 」 P y r i o e h o u A ， P a P a P e t r o P o u l o s A . S o l u b l e g u a n y l y l e y e l a s e : m o r e s e c r e t s r e v e a l e d 【 J 〕 . C e l l S i g n a l ， 2 0 0 5 ， 1 7 ( 4 ) : 4 0 7 一 4 1 3 . 【 4 3 1 D i n g J D ， B u r e t t e A ， N e d v e t s k y P l ， e t a l . D i s t r i b u t i o n o f s o l u b l e g u a n y l y l e y e l a s e i n t h e r a t b r a i n ! J 」 . J C o m P N e u r o l ， 2 0 0 4 ， 4 7 2 ( 4 ) : 4 3 7 一 4 4 8 . [ 4 4 ] H a r t t D J ， O g i w a r a T ， H o A K ， e t a l . C ) ‘ e l i e G M P s t i m u l a t e s g r o w t h h o r m o n e r e l e a s e i n r a t a n t e r i o r p i t u i t a r y e e l l s [ J 」 . B i o e h e m B i o p h y s R e s C o m m u n ， 1 9 9 5 ， 2 1 4 ( 3 ) : 9 1 8 一 9 2 6 . 【 4 5 ] V a l v e r d e l ， P e n a l v a A ， G h i g o E ， e t a l . I n v o l v e m e n t o f n i t r i e o x i d e i n t h e r e g u l a t i o n o f g r 0 W t h h o r m o n e s e c r e t i o n i n d o g s 【 J ] . N e u r o e n d o c r i n o l o g y ， 2 0 0 1 ， 7 4 ( 4 ) : 2 1 3 一 2 2 9 . [ 4 6 ] M o r r i s S M J r . A i g i n i n e m e t a b o l i s m : b o u n d a r i e s o f o u r k n o w l e d g e [ J ] . J N u t r ， 2 0 0 7 ， 1 3 7 ( 6 S u P P 1 2 ) : 1 6 0 2 5 一 1 6 0 9 5 . 【 4 7 ] W u G ， M e i n i n g e r C J ， K n a b e D A ， e t a l . A r g i n i n e n u t r i t i o n i n d e v e l o P m e n t ， h e a l t h a n d d i s e a s e 「 J 」 . C u r r O P i n C l i n N u t r M e t a b C a r e ， 2 0 0 0 ， 3 ( l ) : 5 9 一 6 6 . 〔 4 8 」 W u G ， B a z e r F W ， C u d d T A ， e t a l . P h a n n a e o k i n e t i e s a n d s a f e t y o f a r g i n i n e s u P P l e m e n t a t i o n i n a n i m a l s 【 J ] . J N u t r ， 2 0 0 7 ， 1 3 7 ( 6 S u P P 1 2 ) : 1 6 7 3 5 一 1 6 8 0 5 . 【 4 9 ] S h a o A ， H a t h e o e k J N . R i s k a s s e s s m e n t f o r t h e a m i n o a e i d s t a u r i n e ， L 一 g l u t a m i n e a n d L 一 a r g i n i n e [ J } . R e g u l T o x i c o l P h a r m a e o l ， 2 0 0 8 ， 5 0 ( 3 ) : 3 7 6 一 3 9 9 . 【 5 0 」 W u G ， M o r r i s S M J r . A r g i n i n e m e t a b o l i s m : n i t r i e o x i d e a n d b e y o n d [ J 」 . B i o e h e m J ， 1 9 9 8 ， 3 3 6 ( P t l ) : l 一 1 7 . [ 5 1 」 B r o s n a n M E ， B r o s n a n J T . R e n a l a r g i n i n e m e t a b o l i s m L J 」 . J N u t r ， 2 0 0 4 ， 1 3 4 ( 1 0 S u P P I ) : 2 7 9 1 5 一 2 7 9 5 5 . 复 旦 大 学 硕 ! : 学 位 论 文 综 述 一 氧 化 氮 在 L 一 精 氨 酸 促 生 长 激 素 分 泌 中 的 作 用 蒋 明 玉 综 述 蔡 德 培 审 校 ( 复 旦 大 学 附 属 儿 科 医 院 ， 上 海 2 0 1 1 0 2 ) [ 摘 要 1 氨 基 酸 是 促 进 垂 体 生 长 激 素 ( G H ) 分 泌 的 潜 在 刺 激 因 子 。 所 有 氨 基 酸 中 ， 左 旋 精 氨 酸 ( L 一 精 氨 酸 ) 促 生 长 激 素 分 泌 作 用 最 为 明 显 。 临 床 上 精 氨 酸 滴 注 被 常 规 用 作 生 长 激 素 激 发 试 验 。 L 一 精 氨 酸 在 一 氧 化 氮 合 酶 作 用 下 催 化 生 成 一 氧 化 氮 困 O ) 。 作 为 内 分 泌 系 统 重 要 的 神 经 递 质 / 神 经 调 质 ， N O 对 下 丘 脑 一 垂 体 系 统 多 种 激 素 的 分 泌 起 着 调 节 作 用 ， 包 括 生 长 激 素 的 分 泌 。 L 一 精 氨 酸 促 垂 体 生 长 激 素 的 分 泌 可 能 牵 涉 到 多 种 机 制 ， 但 一 氧 化 氮 依 赖 的 可 溶 性 鸟 营 酸 环 化 酶 一 环 鸟 营 酸 一 蛋 白 激 酶 G ( s G C 一 c G M P 一 P K G ) 信 号 转 导 通 路 在 此 过 程 中 起 着 重 要 作 用 。 【 关 键 词 】 精 氨 酸 ; 一 氧 化 氮 ; 生 长 激 素 ; 神 经 内 分 泌 系 统 T h e r o l e o f n i t r i c o x i d e i n L 一 a r g i n i n e 一 s t i m u l a t e d g r o w t h h o r m o n e J I A N G M i n g y U ， C A I D e P e i ( C h i l d r e n 一 5 H o s P i t a l o f F u d a n U n i v e r s i t y ， S h a n g h a i 2 0 1 1 0 2 ， C h i n a ) [ A b s t r a e t ] A m i n o a c i d s h a v e a l s o b e e n p o i n t e d o u t a s p o t e n t s t i m u l a t o r s o f g r o w t h h o r m o n e ( G H ) s e e r e t i o n . A m o n g t h e m ， L 一 a r g i n i n e 1 5 e o n s i d e r e d o n e o f t h e m o s t e f f e e t i v e G H r e l e a s e r s . I n t r a v e n o u s a r g i n i n e i n f u s i o n 1 5 u s e d e l i n i c a l l y a s a P r o v o e a t i 、 ‘ e t e s t t o e s t a b l i s h G H d e f i e i e n e i e s . N i t r i e o x i d e 困 O ) 1 5 s y n t h e s i z e d f r o m L 一 a r g i n i n e b y t h e e n z y m e N O s y n t h a s e 困 0 5 ) . N O ， a s a n e u r o t r a n s m i t t e r / n e u r o m o d u l a t o r i n t h e e n d o e r i n e s y s t e m ， h a v e b e e n s h o w n t o b e i n v o l v e d i n r h e e o n t r o l o f s e e r e t i o n o f m a n y h o r m o n e s a l o n g t h e H y P o t h a l a m u s 一 P i t u i t a r y a x i s ， i n e l u d i n g t h e s o m a t o t r o P h i e a x i s . G H s e e r e t i o n t o L 一 a r g i n i n e e a n b e m e d i a t e d b y s e v e r a l s i g n a l i n g s y s t e m s ， b u t N O 一 s G C 一 e G M P 一 P K G 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 P a t h w a y P l a y a k e y r o l e i n t h e P r o c e s s o f L 一 a r g i n i n e 一 s t i m u l a t e d g r o w t h h o r m o n e . [ K e y w o r d s ] A r g i n i n e : N i t r i e o x i d e ; G r o w t h h o r m o n e ; N e u r o s e e r e t o r y S y s t e m s L 一 精 氨 酸 在 许 多 生 物 学 过 程 中 发 挥 着 重 要 作 用 ， 如 : 促 进 创 伤 愈 合 、 调 节 内 分 泌 功 能 以 及 增 强 免 疫 活 性 等 。 除 合 成 蛋 白 质 外 ， L 一 精 氨 酸 还 可 代 谢 生 成 N O 、 尿 素 、 肌 配 和 谷 氨 酸 。 N O 在 体 内 分 布 广 泛 ， 是 重 要 的 信 号 转 导 分 子 ， 参 与 机 体 许 多 生 理 功 能 的 调 节 ， 包 括 神 经 内 分 泌 的 调 节 。 近 年 来 研 究 发 现 : L 一 精 氨 酸 及 其 产 物 N O 涉 及 调 节 动 物 体 内 下 丘 脑 一 垂 体 轴 多 种 激 素 的 分 泌 ， 包 括 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 、 催 乳 素 、 黄 体 生 成 素 、 生 长 抑 素 、 生 长 激 素 等 【 ‘ 2 ] 。 本 文 将 对 N o 及 其 在 L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 过 程 中 的 作 用 进 行 综 述 。 1 . L 一 精 氨 酸 一 N O 通 路 L 一 精 氨 酸 是 N O 的 天 然 前 体 物 质 。 生 物 体 内 广 泛 存 在 L 一 精 氨 酸 一 N O 通 路 。 随 着 对 N O 生 理 作 用 的 深 入 研 究 ， 发 现 多 种 组 织 细 胞 ， 如 : 内 皮 细 胞 、 神 经 细 胞 、 巨 噬 细 胞 、 中 性 粒 细 胞 、 肝 细 胞 等 均 可 以 L 一 精 氨 酸 为 底 物 合 成 N O 。 体 内 L 一 精 氨 酸 在 一 氧 化 氮 合 酶 州 0 5 ) 作 用 下 ， 与 分 子 氧 反 应 ， 以 磷 酸 尼 克 酞 胺 腺 嚓 岭 二 核 营 酸 为 辅 酶 ， 生 成 N O 和 L 一 瓜 氨 酸 。 N O S 广 泛 表 达 于 哺 乳 动 物 的 各 种 组 织 和 细 胞 ， 是 N O 合 成 最 关 键 的 限 速 酶 ， 主 要 存 在 三 种 形 式 : 神 经 型 N O S ( n N O S 、 N O S 一 1 ) 、 内 皮 型 N O S ( e N O S 、 N O S 一 3 ) 、 诱 导 型 N O S ( i N O S 、 N O S 一 2 ) 。 前 两 者 又 称 为 结 构 型 N O S ( c N O S ) ， 其 活 性 依 赖 钙 离 子 或 钙 调 蛋 白 ， 催 化 反 应 迅 速 而 短 暂 ， 生 成 少 量 N O ， 主 要 介 导 正 常 生 理 功 能 并 有 细 胞 保 护 作 用 ; i N O S 一 般 需 在 内 毒 素 或 某 些 细 胞 因 子 ( 如 肿 瘤 坏 死 因 子 、 白 介 素 等 ) 诱 导 下 表 达 ， 不 需 要 钙 离 子 及 钙 调 蛋 白 的 参 与 ， 催 化 反 应 持 续 时 间 长 ， 生 成 较 多 的 N O ， 合 成 N O 的 水 平 较 c N O S 合 成 N O 的 浓 度 约 高 1 0 0 0 倍 ， 主 要 介 导 细 胞 毒 作 用 并 调 制 免 疫 应 答 [ 3 月 。 2 . L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 作 用 生 长 激 素 主 要 由 垂 体 生 长 激 素 细 胞 合 成 和 分 泌 。 下 丘 脑 生 长 激 素 释 放 激 素 ( G H R H ) 及 生 长 抑 素 ( 5 5 ) 通 过 调 节 生 长 激 素 细 胞 的 活 性 影 响 垂 体 生 长 激 素 ( G H ) 的 分 泌 ， 前 者 促 进 ， 后 者 抑 制 。 近 年 来 研 究 发 现 : g h r e l i n ， 由 胃 腺 的 壁 细 胞 分 泌 的 2 8 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 多 肤 ， 具 有 较 强 的 促 G H 分 泌 活 性 [ 5 ] 。 除 了 G H R H 和 g h r e l i n ， 氨 基 酸 亦 可 促 进 垂 体 生 长 激 素 的 分 泌 。 在 所 有 氨 基 酸 中 ， L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 作 用 最 为 明 显 l 6 ] 。 精 氨 酸 可 以 提 高 G H m R N A 的 表 达 水 平 已 在 大 鼠 体 内 外 实 验 中 被 证 实 [ 7 ] 。 正 常 人 静 脉 滴 注 L 一 精 氨 酸 可 显 著 提 高 血 清 生 长 激 素 水 平 ， 且 这 一 水 平 与 精 氨 酸 的 剂 量 呈 正 比 。 临 床 上 将 精 氨 酸 滴 注 常 规 用 作 生 长 激 素 激 发 试 验 ， 以 检 测 腺 垂 体 G H 的 储 备 功 能 。 口 服 L 一 精 氨 酸 亦 可 刺 激 复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文 垂 体 G H 的 分 泌 。 对 于 健 康 青 年 男 性 ， 每 日 5 ~ 9 克 精 氨 酸 口 服 量 是 促 进 垂 体 生 长 激 素 分 泌 的 最 佳 剂 量 ， 剂 量 超 过 9 克 可 能 会 引 起 胃 肠 道 不 适 、 腹 泻 等 [ 8 ] 。 L 一 精 氨 酸 一 方 面 通 过 促 进 垂 体 G H 的 释 放 间 接 刺 激 肝 脏 分 泌 i n s u l i n h k e g r o w t h f a c t o r 一 I ( I G F 一 I ; 胰 岛 素 样 生 长 因 子 一 l ) ， 另 一 方 面 可 直 接 作 用 于 骨 骼 部 位 引 起 I o F 一 I 分 泌 的 增 加 。 e h e v a l l e y 等 [ 9 ] 发 现 小 鼠 成 骨 样 细 胞 M e 3 T 3 一 E I 经 精 氨 酸 ( 7 . 5 一 7 5 0 0 m m o l / L ) 孵 育 后 I G F 一 I 的 m R N A 及 蛋 白 表 达 量 均 上 升 。 G H 一 I G F 一 I 轴 与 儿 童 至 青 春 期 长 骨 的 线 性 生 长 密 切 相 关 。 因 此 ， 精 氨 酸 的 补 充 有 助 于 刺 激 生 长 轴 并 促 进 骨 骼 生 长 [ l 0 ] 。 在 法 国 ， 精 氨 酸 已 用 于 治 疗 儿 童 垂 体 G H 分 泌 不 足 引 起 的 身 材 矮 小 症 [ l 1 ] 。 3 . L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 的 作 用 机 制 L 一 精 氨 酸 促 垂 体 生 长 激 素 分 泌 的 作 用 机 制 尚 未 完 全 阐 明 。 前 期 研 究 发 现 该 氨 基 酸 主 要 通 过 抑 制 下 丘 脑 室 旁 核 神 经 元 生 长 抑 素 的 分 泌 从 而 使 得 垂 体 G H 分 泌 增 加 ， 这 一 结 论 目 前 己 被 广 泛 认 可 。 生 长 抑 素 分 泌 的 减 少 一 方 面 刺 激 下 丘 脑 G H R H 的 释 放 ， 另 一 方 面 可 激 活 蛋 白 激 酶 ( P K A 和 P K C ) ， 使 得 垂 体 内 某 些 特 殊 转 录 因 子 ( 如 P T l l ) 磷 酸 化 增 加 ， 最 终 促 使 G H 分 泌 增 加 。 近 年 来 体 外 实 验 提 示 精 氨 酸 诱 导 促 生 长 细 胞 的 膜 去 极 化 可 能 是 促 使 垂 体 G H 分 泌 的 又 一 机 制 [ 7 ， ’ 2 ] 。 另 有 实 验 证 实 L 一 A r g 的 代 谢 产 物 N O 参 与 了 L 一 精 氨 酸 促 生 长 激 素 的 分 泌 过 程 【 ’ 〕 。 4 . L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 与 N O 的 相 关 性 N O 具 有 广 泛 的 生 理 功 能 ， 如 松 弛 血 管 平 滑 肌 、 抑 制 血 小 板 聚 集 ， 神 经 传 递 及 介 导 免 疫 应 答 等 【 ’ 3 ] 。 N O 作 为 细 胞 间 信 息 交 换 的 载 体 ， 是 L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 过 程 中 的 重 要 信 号 转 导 分 子 。 4 . 1 N O 促 G H 分 泌 作 用 许 多 研 究 表 明 : N O 是 神 经 内 分 泌 调 节 因 子 ， 对 垂 体 G H 的 分 泌 有 着 促 进 作 用 。 u r e t s k y 等 【 ’ 4 】 用 不 同 浓 度 的 N o 供 体 ( s N A P 、 s N P ) 刺 激 体 外 培 养 的 金 鱼 垂 体 细 胞 分 泌 G H ， 发 现 l 一 1 0 0 u M S N A P 、 1 0 及 1 0 0 u M S N P 是 诱 导 G H 分 泌 的 最 佳 浓 度 ， 且 在 此 范 围 内 G H 分 泌 的 多 少 与 N O 的 生 成 量 呈 正 比 。 B e a g l e 犬 静 脉 滴 注 N O S 抑 制 剂 ( L 一 N A M E ) 3 0 0 u g 众 g 后 能 使 下 丘 脑 G H R H 促 G H 分 泌 活 性 减 弱 ， 间 接 证 实 N O 有 刺 激 垂 体 分 泌 G H 的 作 用 【 ’ 5 1 。 R u b i n e k 等 【 ’ “ 】 将 孕 2 1 一 2 4 周 人 体 胎 儿 的 垂 体 细 胞 暴 露 于 l m M S N P 4 小 时 后 G H 分 泌 增 加 了 5 0 % 以 上 ， 相 当 于 1 0 n M G H R H 所 产 生 的 作 用 。 此 外 ， 研 究 还 发 现 N O 对 于 青 春 期 前 大 鼠 垂 体 G H 分 泌 是 必 需 的 ， 但 成 年 雄 性 w i s t a r 大 鼠 腹 腔 注 射 N A M E ( 4 0 m g / k g ) 5 天 后 血 清 促 黄 体 生 成 素 浓 度 明 显 升 高 ， G H 浓 度 的 变 化 无 明 显 差 异 【 ‘ 7 ] ， 表 明 N o 对 垂 体 G H 分 泌 的 作 用 存 在 年 龄 差 异 。 4 . 2 L 一 精 氨 酸 一 N O 通 路 与 C H 的 分 泌 复 ， 旦 少 ( 学 硕 一 f : 学 位 论 文 免 疫 组 化 显 示 n N O S 广 泛 存 在 于 哺 乳 动 物 下 丘 脑 核 团 ( 室 旁 核 、 视 上 核 ) 及 垂 体 细 胞 ( 生 长 激 素 细 胞 、 促 性 腺 激 素 细 胞 ) 。 L 一 精 氨 酸 一 N O 通 路 广 泛 存 在 于 下 丘 脑 及 垂 体 组 织 ， 并 对 这 些 部 位 激 素 的 分 泌 起 着 重 要 的 调 节 作 用 ， 包 括 促 G H 的 分 泌 。 v a l v e r d e 等 【 ” ] 用 L 一 精 氨 酸 滴 注 后 使 得 L 一 N A M E 抑 制 G H 分 泌 的 作 用 减 弱 ， 推 测 出 二 者 通 过 作 用 于 相 同 的 N O 信 号 转 导 通 路 分 别 促 进 、 抑 制 垂 体 G H 的 分 泌 。 生 物 体 内 ， 可 溶 性 鸟 普 酸 环 化 酶 ( s G C ) 是 N O 最 主 要 的 结 合 受 体 。 N O 合 成 释 放 后 在 邻 近 的 细 胞 间 迅 速 扩 散 并 激 活 细 胞 膜 上 的 S G C ， 后 者 使 细 胞 内 环 鸟 普 酸 ( c G M P ) 大 量 产 生 和 堆 积 ， 再 通 过 c G M P 依 赖 的 蛋 白 激 酶 ( P K G ) 对 平 滑 肌 细 胞 增 殖 、 血 小 板 聚 集 、 骨 骼 生 长 及 激 素 分 泌 等 多 种 生 理 功 能 进 行 调 节 。 N O 供 体 ( L 一 精 氨 酸 、 S N P ) 可 使 下 丘 脑 及 垂 体 部 位 第 二 信 使 c G M P 浓 度 增 加 ; c G M P 的 增 加 有 利 于 进 一 步 刺 激 猪 及 人 体 胎 儿 的 垂 体 细 胞 分 泌 G H [ ’ “ · ’ 8 ] 。 L u q u e 等 [ 5 ] 发 现 生 长 激 素 促 分 泌 剂 g h r e l i n 除 通 过 蛋 白 激 酶 A ( P K A ) 和 蛋 白 激 酶 C ( P K C ) 途 径 ， 还 经 N O S 一 N O 一 s G C 一 c G M P 通 路 诱 导 猪 垂 体 G H 的 分 泌 。 另 外 有 研 究 表 明 : L e P t i n ， 一 种 调 节 食 欲 和 体 重 的 关 键 物 质 ， 主 要 经 N O 依 赖 的 信 号 通 路 诱 导 猪 垂 体 细 胞 及 外 周 血 单 核 细 胞 分 泌 G H 【 ’ ” ， 2 0 ] 。 随 着 研 究 的 不 断 深 入 ， P i n i l l a 等 [ 2 ’ 〕 还 发 现 S N P 起 初 经 N O 一 s G C 一 c G M P 途 径 ， 随 后 通 过 c A M P 依 赖 机 制 促 进 G H 的 分 泌 。 结 论 综 上 所 述 L 一 精 氨 酸 及 其 代 谢 产 物 N O 参 与 下 丘 脑 、 垂 体 功 能 的 调 节 ， 包 括 G H 的 分 泌 。 N O 一 s G C 一 c G M P 一 P K G 通 路 在 L 一 精 氨 酸 促 G H 分 泌 过 程 中 起 着 重 要 作 用 。 G H 是 促 进 生 长 的 重 要 激 素 ， 有 利 于 未 成 年 个 体 的 生 长 。 在 某 些 特 殊 情 况 下 ， 补 充 L 一 精 氨 酸 使 生 长 轴 发 挥 作 用 是 一 个 很 好 的 选 择 。 目 前 对 于 N O 的 合 成 前 体 L 一 精 氨 酸 已 日 益 受 到 医 学 及 相 关 科 学 工 作 者 的 广 泛 关 注 。 随 着 研 究 的 深 入 ， L - 精 氨 酸 在 临 床 卜 有 着 更 广 阔 的 应 用 前 景 。 参 考 文 献 : [ l ] W u q B a z e r F W ， D a v i S I … A ， e t a l . A r g i n i n e m e t a b o l i s m a n d n u t r i t i o n i n g r o w t h ， h e a l t h a n d d i s e a s e 【 J ] · A m i n o A e i d s ， 2 0 0 9 ， 3 7 ( 1 ) : 1 5 3 一 1 6 8 . 【 2 〕 M e C o n e l l G K . E f f e e t s o f L 一 a r g i n i n e s u P P l e m e n t a t i o n o n e x e r e i s e m e t a b o l i s m [ J 」 . C u r r O P i n C l i n N u t r M e t a b C a r e ， 2 0 0 7 ， 1 0 ( l ) : 4 6 一 5 1 . 【 3 」 B o u d k o D Y B i o a n a l y t i e a l P r o f i l e o f t h e L 一 a r g i n i n e / n i t r i e o x i d e p a t h w a y a n d i t s e v a l u a t i o n b y c a P i l l a r y e l e e t r o P h o r e s i s [ J ] . J C h l o m a t o g r B A n a l y t T e e h n o l B i o m e d L i f e S e i ， 2 0 0 7 ， 8 5 1 ( l 一 2 ) : 1 8 6 一 2 1 0 . [ 4 ] v a n E i j k H M ， L u i k i n g Y C ， D e u t z N E ， e t a l . M e t h o d s u s i n g s t a b l e i s o t o P e s t o m e a s u r e n i t r i e o x i d e ( N O ) s y n t h e s i s i n t h e L 一 a r g i n i n e 闪 0 P a t h w a y i n h e a l t h a n d d i s e a s e 【 J 」 . J 复 口 _ 大 学 子 吹 卜 学 位 论 文 C h r o m a t o g r B A n a l y t T e e h n o l B i o m e d L i f e S e i ， 2 0 0 7 1 5 ， 8 5 1 ( 1 一 2 ) : 1 7 2 一 1 8 5 . 【 5 」 R o d r i g u e z 一 P a c h e e o F ， L u q u e R M ， T e n a 一 S e m P e r e M ， e t a l . G h r e l i n i n d u c e s g r o w t h h o r m o n e S e c r e t i o n V i a a n i t r i e o X i d e / c G M P s i g n a l l i n g P a t h w a y [ J ] . J o u r n a l o f N e u r o e n d o e r i n o l o g 又 2 0 0 8 ， 2 0 ( 3 ) : 4 0 6 一 4 1 2 . 〔 6 】 v a n V u g h t A J ， N i e u w e n h u i z e n A G ， B r u m m e r R J ， e t a l . E f f e e t s o f O r a l I n g e s t i o n o f A m i n o A e i d s a n d P r o t e i n s o n t h e S o m a t o t r o P i e A x i s 【 J 」 . J C l i n E n d o c r i n o l M e t a b ， 2 0 0 8 ， 9 3 ( 2 ) : 5 8 4 一 5 9 0 . [ 7 1 A d r i a o M ， C h r i s m a n C J ， B i e l a v s k y M ， e t a l . A r g i n i n e i n e r e a s e s g r o w t h h o r m o n e g e n e e X p r e s s i o n i n r a t p i t u i t 娜 a n d G H 3 e e l l s [ J ] . N e u r o e n d o e r i n o l o g y ， 2 0 0 4 ， 7 9 ( l ) : 2 6 一 3 3 . [ 8 」 C o l l i e r S R ， C a s e y D P ， K a n a l e y J A ， e t a l . G r o w t h h o r m o n e r e s P o n s e s t o v a r y i n g d o s e s o f o r a l a r g i n i n e 〔 J 〕 、 G r o w t h H o r m I G R e s ， 2 0 0 5 ， 1 5 ( 2 ) : 1 3 6 一 1 3 9 . 【 9 ] C h e v a l l e y T ， 死 z z o l i R ， M a n e n D ， e t a l . A r g i n i n e i n e r e a s e s i n s u l i n 一 l i k e g r o w t h f a c t o r 一 1 P r o d u c t i o n a n d e o l l a g e n s y n t h e s i s i n o s t e o b l a s t 一 l i k e c e l l s [ J 〕 . B o n e ， 1 9 9 8 ， 2 3 ( 2 ) : 1 0 3 一 1 0 9 . [ 1 0 ] Z a j a e A ， P o P r z e e k i S ， Z e b r o w s k a A ， e t a l . A r g i n i n e a n d o m i t h i n e s u P P l e m e n t a t i o n i n e r e a s e s g r o w t h h o r m o n e a n d i n s u l i n 一 l i k e g r o w t h f a c t o r 一 1 s e r u m l e v e l s a f t e r h e a v y 一 r e s i s t a n e e e x e r c i s e i n s t r e n g t h 一 t r a i n e d a t h l e t e s 【 J I . J S t r e n g t h C o n d R e s ， 2 0 1 0 ， 2 4 ( 4 ) : 1 0 8 2 一 1 0 9 0 . 〔 川 B l a z e j e w s k i s ， G e o r g e s A ， F o r e s t K ， e t a l . T h e e h r o n i e o r a l a d m i n i s t r a t i o n o f a r g i n i n e a s p a r t a t e d e c r e a s e s s e c r e t i o n o f I G F 一 1 a n d I G F B P 一 3 i n h e a l t h y v o l u n t e e r s 【 J 」 . F u n d a m C l i n P h a r m a e o l ， 2 0 0 9 ， 2 3 ( 3 ) : 3 3 9 一 3 4 4 . 【 1 2 ] d e C a s t r o B a r b o s a T ， L o u r e n e o P o y a r e s L ， F a b r e s M a e h o d a U ， e t a l . C h r o n i e o r a l a d m i n i s t r a t i o n o f a r g i n i n e i n d u e e s G H g e n e e x P r e s s i o n a n d i n s u l i n r e s i s t a n e e [ J ] . L i f e S e i ， 2 0 0 6 ， 7 9 ( 1 5 ) : 1 4 4 4 一 1 4 4 9 . [ 1 3 ] K J l o t t A B ， B o s s y 一 W e t z e l E . N i t r i e o x i d e i n h e a l t h a n d d i s e a s e o f t h e n e r v o u s s y s t e m 【 J ] . A l l t i o x i d R e d o x S i g n a l ， 2 0 0 9 ， 1 1 ( 3 ) : 5 4 1 一 5 5 4 . 【 1 4 1 U r e t s k y A D ， C h a n g J P . E v i d e n e e t h a t n i t r i e o x i d e 1 5 i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f g r 0 W t h h o r m o n e S e c r e t i o n i n g o l d f i s h l J 」 . G e n C o m p E n d o e r i n o l ， 2 0 0 0 ， 1 1 8 ( 3 ) : 4 6 1 - 4 7 0 . [ 1 5 」 V a l v e r d e l ， P e n a l v a A ， G h i g o E ， e t a l . I n v o l v e m e n t o f n i t r i e o x i d e i n t h e r e g u l a t i o n o f g r 0 W t h h o r m o n e s e e r e t i o n i n d o g s l J ] . N e u r o e n d o e r i n o l o g y ， 2 0 0 1 ， 7 4 ( 4 ) : 2 1 3 一 2 2 9 . 【 1 6 〕 R u b i n e k T ， R u b i n f e l d H ， H a d a n i M ， e t a l . N i t r i e o x i d e s t i m u l a t e s g r o w t h h o r m o n e s e c r e t i o n f r o m h u m a n f e t a l P i t u i t a r i e s a n d c u l t u r e d P i t u i t a r y a d e n o m a s 【 J 」 . E n d o e r i n e ， 2 0 0 5 ， 2 8 ( 2 ) : 2 0 9 一 2 1 6 . 复 口 少 、 学 顿 卜 学 位 论 文 【 1 7 ] P i n i l l a L ， G o n z a l e z L C ， T e n a 一 S e m P e r e M ， e t a l . E f f e e t s o f s y s t e m i e b l o e k a d e o f n i t r i e o x i d e s y n t h a s e s o n P u l s a t i l e L H ， P r o l a c t i n ， a n d G H s e e r e t i o n i n a d u l t m a l e r a t s [ J l . H o r m R e s ， 2 0 0 1 ， 5 5 ( 5 ) : 2 2 9 一 2 3 5 . [ 1 8 ] L u q u e R M ， R o d r 宜 g u e z 一 P a c h e e o F ， T e n a 一 S e m P e r e M ， e t a l . D i f f e r e n t i a l e o n t r i b u t i o n o f n i t r i e o x i d e a n d e G M P t o t h e s t i m u l a t o r y e f f e e t s o f g r o w t h h o r m o n e 一 r e l e a s i n g h o r m o n e a n d l o w 一 e o n e e n t r a t i o n s o m a t o s t a t i n o n g r o w t h h o r m o n e r e l e a s e f r o m s o m a t o t r o P h s 【 J ] . J N e u r o e n d o e r i n o l ， 2 0 0 5 ， 1 7 ( 9 ) : 5 7 7 一 5 8 2 . [ 1 9 ] B a r a t t a M ， S a l e r i R ， M a i n a r d i G L ， e t a l . L e P t i n r e g u l a t e s G H g e n e e x P r e s s i o n a n d s e c r e t i o n a n d n i t r i e o x i d e p r o d u e t i o n i n p i g p i t u i t a 仃 e e l l s 【 J 」 . E n d o e r i n o l o g y ， 2 0 0 2 ， 1 4 3 ( 2 ) : 5 5 1 一 5 5 7 . [ 2 0 ] D i x i t V D ， M i e l e n z M ， T a u b D D ， e t a l . L e P t i n i n d u e e s g r o w t h h o r m o n e s e e r e t i o n f r o m P e r i P h e r a l b l o o d m o n o n u e l e a r e e l l s v i a a P r o t e i n k i n a s e C 一 a n d n i t r i c o x i d e - d e p e n d e n t m e c h a n i s m [ J ] . E n d o c r i n o l o g y ， 2 0 0 3 ， 1 4 4 ( 1 2 ) : 5 5 9 5 一 5 6 0 3 . 【 2 1 」 P i n i l l a L ， T e n a 一 S e m P e r e M ， A g u i l a r E . N i t r i e o x i d e s t i m u l a t e s g r o w t h h o r m o n e s e e r e t i o n i n v i t r o t h l o u g h a c a l e i u m 一 a n d e y e l i e g u a n o s i n e m o n o P h o s P h a t e - i n d e p e n d e n t m e e h a n i s m [ J ] . H o r m R e s ， 1 9 9 9 ， 5 1 ( 5 ) : 2 4 2 一 2 4 7 . S 0 复 旦 人 学 硕 卜 学 位 论 文 在 校 期 间 发 表 文 章 蒋 明 玉 ， 蔡 德 培 。 一 氧 化 氮 在 L 一 精 氨 酸 促 生 长 激 素 分 泌 中 的 作 用 。 国 际 内 分 泌 代 谢 杂 志 ， 已 录 用 。 2 . M i n g 一 Y u J I A N G ， D e 一 P e i C A I . O r a l a r g i n i n e i m P r o v e s l i n e a r g r o w t h o f l o n g b o n e s a n d t h e n e u r o e n d o e r i n e m e e h a n i s m . N e u r o s e i B u l l ， J u n e l ， 2 0 1 1 ， 2 7 ( 3 ) : - 复 旦 夕 心 学 硕 士 学 位 论 文 致 谢 值 此 论 文 完 成 和 研 究 生 阶 段 即 将 结 束 之 际 ， 衷 心 感 谢 给 予 我 极 大 帮 助 的 老 师 、 同 学 和 朋 友 。 首 先 对 我 的 导 师 蔡 德 培 教 授 表 示 衷 心 的 感 谢 和 深 深 的 敬 意 ， 感 谢 恩 师 三 年 来 对 我 的 学 习 、 工 作 、 生 活 及 思 想 上 给 予 的 悉 心 指 导 和 无 微 不 至 的 关 怀 ， 使 我 顺 利 完 成 学 业 。 我 的 每 一 点 进 步 都 离 不 开 导 师 的 鼓 励 和 支 持 。 导 师 渊 博 的 知 识 、 高 瞻 远 瞩 的 学 术 指 导 、 严 谨 求 实 的 治 学 态 度 、 精 益 求 精 的 学 术 风 格 和 孜 孜 不 倦 的 工 作 精 神 给 了 我 极 大 的 鼓 舞 和 帮 助 ， 我 将 铭 记 于 心 ， 受 益 终 生 。 特 别 感 谢 孔 元 原 师 姐 在 课 题 设 计 及 实 验 室 生 活 中 给 予 我 细 致 耐 心 的 指 导 、 无 微 不 至 的 帮 助 。 衷 心 感 谢 复 旦 大 学 放 射 医 学 研 究 所 骨 代 谢 研 究 室 高 建 军 、 金 慧 芳 老 师 在 骨 形 态 计 量 学 测 定 及 分 析 过 程 中 给 予 的 大 力 支 持 和 帮 助 。 衷 心 感 谢 复 旦 大 学 动 物 实 验 中 心 周 文 江 老 师 在 标 本 取 材 过 程 中 给 予 的 帮 助 。 衷 心 感 谢 儿 研 所 杨 毅 教 授 、王 莹 老 师 、 熊 曼 老 师 、吴 冰 冰 老 师 、核 医 学 科 季 志 英 老 师 、 病 理 科 陈 莲 主 任 、 电 镜 室 俞 彰 老 师 在 课 题 完 成 过 程 中 所 给 予 的 鼎 力 帮 助 。 衷 心 感 谢 孙 雯 、 朱 琳 、 杨 柳 、 张 簧 健 、 钟 华 清 、 郑 翠 芳 、 刘 静 等 同 学 在 课 题 完 成 和 生 活 中 给 予 的 无 私 帮 助 。 衷 心 感 谢 我 的 家 人 ， 我 的 爸 爸 妈 妈 ， 远 在 外 地 的 他 们 ， 为 了 我 含 辛 茹 苦 ， 给 我 始 终 如 一 地 关 爱 、 理 解 、 鼓 励 和 支 持 。 感 谢 我 的 爱 人 ， 时 刻 同 我 一 起 ， 与 我 分 享 成 功 的 喜 悦 ， 为 我 分 担 失 败 的 痛 苦 。 由 衷 的 感 谢 他 默 默 无 闻 的 奉 献 和 关 怀 。 感 谢 每 一 个 关 心 过 我 、 帮 助 过 我 的 人 !