实验二、萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定
(报告写作提示及思考题)
注意:实验二整体是为了完成如何在正确的总体思路的指导下合理
设计
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实验
方案
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及其细节。所以我们首先以对生物催化剂-酶的基本认识确定了酶活测定实验的总体设计思路,并在其指导下,明确了总体方案及最关键的设计细节。然后以我们比较熟悉的禾谷类种子的萌发状态及其代谢途径为具体思考对象,进行了淀粉酶活力测定相关的分析,然后认可并已完成了前人设计的实验。所以淀粉酶活力测定实验报告的结果就绝不仅仅是计算得出的两个酶活力数据,或说那两个数据只是一个必然的实验数据,“实验结果”是我们设计并完成了对淀粉酶,这类在禾谷类种子萌发过程中起关键作用的酶的活力的测定,即,是实验设计本身。所以结果分析应该是围绕实验设计展开。根据实验具体实施过程中可操作性的特点、操作误差对结果的可能影响,以实际材料完成实验后得到的具体结果数据结合相关生理功能一起思考判断,是否能初步确定该实验设计不仅理论上可行而且实验后的结果也可信,从而最终确认整个实验设计的基本合理可行可信。同时我们还利用Folin-酚法完成了其水溶性蛋白含量的测定,大家将经过实际试验最终完成蛋白含量测定的成熟实验方案及步骤和结果整合到实验二中并完成α-淀粉酶和(α- + β-)总酶比活的计算。然后通过所留思考题总结这次完全由你们自己设计的小小实验的得失成败。
实验后思考题:
1.完成这次小小的蛋白含量测定实验从设计到实施完成的自我
经验总结。
2.从酶活测定的相关实验结果判断本次实验设计的酶活测定样
品稀释倍数是否合理?为什么?
3.众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均是采取钝化β-淀粉
酶的活力而测α-淀粉酶和测总酶活力的策略,为何不采取钝化α-淀粉酶活力去测β-淀粉酶活力呢?这种设计思路说明什麽?
4. α-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟?保温后为什么要立即于冰浴中骤冷?而经如此处理,为什么在随后的40℃温浴和酶促反应中就能保证β-淀粉酶不会再参与催化反应。
5.酶的最适反应温度(一般都是生理温度)和最适保存温度(一
般0℃以下)为什么不一样?而这两个状态都是需要维护酶的
空间结构。
6.为什么3,5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再
稀释测定?
7. 在设计酶活测定的实验时,要求酶促反应初速度对底物浓度的小量变化不敏感,具体要求为:在底物浓度有10%的变化幅度范围内,而所测初速度的变化幅度小于1%。则【S】/K M应该大于多少才能保证这一点?(设定为米氏酶)
8. 转氨酶在细胞内的作用及生理意义?细胞内有众多的转氨酶,但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活力,而极少测定其它转氨酶活力,你推测可能的原因会是什么?为什么?
9、转氨酶催化的是双底物可逆反应,根据酶活力测定的总体思路,要保证测定反应的初速度,根据实验指导所提供的
资料
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,你认为是否保证了这一点?是如何保证的?
10、指导所提供的两个转氨酶活力测定实验方案,设计的酶促反应时间是多少?终止酶促反应用的什么试剂?与淀粉酶活力测定规定的酶促反应时间相比是否有差异?差异可能的原因你分析认为会是因为什么?
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