科研营养支持GH博士后论文

目　　录 A部分：感染时机体营养代谢调节机制的实验与临床研究 中文摘要……………………………………………………………… 1 英文摘要……………………………………………………………… 3 前言…………………………………………………………………… 5 实验…………………………………………………………………… 7 综述…………………………………………………………………… 37 附图…………………………………………………………………… 52 B部分：谷氨酰胺对感染时机体营养代谢的作用 中文摘要……………………………………………………………… 58 英文摘要……………………………………………………………… 59 前言…………………………………………………………………… 60 实验…………………………………………………………………… 62 综述…………………………………………………………………… 71 附图…………………………………………………………………… 88 致谢…………………………………………………………………… 92 个人简历……………………………………………………………… 93 博士后期间发表的论文……………………………………………… 93 A部分　感染时机体营养代谢调节机制的实验与临床研究 The laboratory and clinical study on regulatory mechanism of nutritional metabolism in septic host 博 士 后 姓 名 张　平 流动站（一级学科）名称 吉林大学基础医学 专　业（二级学科）名称 病理学与病理生理学 研究工作起始日期1999年5月 研究工作完成日期2001年4月 吉 林 大 学（长 春） 2001年4月 A部分：感染时机体营养代谢调节机制的实验与临床研究 （中文摘要） 目的　进一步探讨感染时机体营养代谢的调节机制、病理基础和影响因素，特别是证实人重组生长激素rhGH及人参二醇组皂甙克服感染、应激时全胃肠外营养的“自身相食”现象。探讨感染时机体营养代谢的影响。以“代谢调理”角度阐明了人重组生长激素及人参二醇组皂甙对机体的调节作用及临床应用价值。 方法　动物实验：将40只雄性SD大鼠随机分成4组，正常对照组（N组n=10）仅行部分肠切除肠吻合术；感染组（S组n=10）感染时行部分肠切除肠吻合术，术后皮下注射生理盐水；生长激素组（GH组n=10）手术同S组，术后皮下注射rhGH，人参二醇组皂甙组（PDS组n=10）手术同GH组，术后注射人参二醇组皂甙。观察6天后，通过光镜电镜，RT－PCR，流式细胞仪等实验方法，对血、小肠、肝脏进行相关指标的测定及形态学观察。临床研究：选住院肠瘘伴腹腔感染病人11例随机分成两组，其中rhGH组病人在TPN营养支持的同时给予人重组人生长激素7天。对照组仅给予TPN。观察病人体重、氮平衡、血浆蛋白、IGF－1及免疫指标。 结果　GH组大鼠体重、氮平衡、肠吻合口生长、肠粘膜细胞周期，IGF－1明显大于S组，二组差别有意义（P<0.05）TNFα mRNA、NO的产生相反，二组差别也显著(P<0.05)；但GH组同N组相比各组指标无显著差异(P>0.05)。PDS组在肠粘膜周期、肠粘膜的光电镜、GSH－Px同GH组无差别(P>0.05)其它指标两组有差别(P<0.05)。临床结果两组病人比较rhGH组在体重、氮平衡、血浆蛋白、IGF－1及免疫指标明显强于TPN组(P<0.05)。 结论　人重组生长激素可以调节感染时术后的营养状况、促进蛋白合成、肠粘膜生长、降低TNFα、NO的产生、保护主要脏器。克服“自身相食”现象，发挥“代谢调理”的作用。人参二醇组皂甙可以抗应激、保护细胞、抑制细胞凋亡，对营养代谢有一定的调节作用。 关键词：人重组生长激素　人参二醇组皂甙　感染代谢　营养支持　肠外瘘 The laboratory and clinical study on regulatery mechanism of nutritional metabolism in septic host Objective:To study the regulatory mechanism pathological basis and effective factors on nutritional metebolism in septic host,especially to determine the anti-autocannibalism role of re-combined human growth hormone (rhGH) and PDS on septic host when TPN was applied,to study the effect of rhGH and PDS on bodies nutritional metabolism and to explain the regulatory effect and clinical value of rhGH and PDS on bodies in the view of metabolic regulation. Method:Animal experiments:40 male SD rats were randomly allocated in 4 groups:10 rats in control group(N group) were given partial resection and anastomosis of small intestine;10 rats in infection group (S group) were given intestinal anastomosis after they caught infections and normal saline was injected subcutaneously to them after operation;10 rats in GH group received the same operation as S group and rhGH was injected subcutaneously after operation;10 rats in PDS group received the same operation as that in S group and PDS was given after operation.Light microscope,electronic microscope RT-PCR and FACS were used to detect blood,small intestine and liver. Clinical Study:11 patients with both intra abdominal infetion and intestinal fistula were randomized into two groups:patients in rhGH group received both TPN and rhGH for 7 days,while patients in control group were given only TPN weight,nitrogen balance,blood plasmic protein,IGF-1 and immune factors were examined. Result:Rats＇weight,nitrogen balance,growth of anastomostic site cell cycle of intestinal mucosa and IGF-1 in GH group were much greater than those in S group and significant difference existed (P<0.05),There was no difference about the results between GH group and N group,No difference existed in intestinal mucosa cycle,results of light and electronic microscope and GSH-Px,while difference existed in other factors of the two groups (P<0.05),Weight,nitrogen balance,plasmic protein,IGF-1 and immune factors in rhGH group were much better than those in TPN group (P<0.05). Conclusion:rhGH was able to regulate the postoperative nutritional state,increase the production of protein,promote intestinal mucosa growth,reduce the production of TNFα and NO,protect important organs,resist autocannibalism and play a regulatory role on metabolism in septic host,PDS was able to resist stress,protect cells,inhibit cell apoptosis and regulate nutrition metebolism. Key words:rhGH PDS infections metabolism nutrition support external intestinal fistula. A部分　感染时机体营养代谢调节机制的实验与临床研究 前　　　言 严重感染，腹部手术后等情况均可继发肠衰竭，即肠道消化和吸收功能发生了障碍。此类病人需要进行临床营养支持。临床营养支持包括肠外营养及肠内营养支持，而肠外营养作为普外科临床营养支持的主要手段。自1967年美国费城医学院Dudrick等人证实其有效性以来[1]，已在世界范围内得到较为普及的应用，并已取得了良好的社会效益。但是肠外营养支持仍存在一些问题有待改进，如“自身相食”现象。这是1987年Cerra提出的，即在感染发生后机体将产生许多细胞因子与炎性介质，从而使机体蛋白质分解，尿素氮增加而出现负氮平衡。机体组织处于分解耗损状态。而这种耗损又非外源性营养所能补充[2]。营养对外科感染病人甚为重要，至少应保持细胞代谢所需要的营养底物，而促进术后的愈合，但是严重感染对机体组织有“自身相食”与代谢严重紊乱的现象，外源性营养支持实为困难，因此，如何为感染等应激病病人给予营养支持，成为当代研究的重点课题[3]。 1987年Cerra提出代谢支持的概念，目的是为机体提供必需的营养底物，而又不增加机体器官的负荷，低热高氮。这方法对某些病人的确起到了营养支持的作用，而严重感染病人分解代谢紊乱严重，采用代谢支持的方法仍然不能达到临床要求，而出现一些并发症。 1988年shaco提出代谢调理理论的概念。希望采用抑制分解代谢产生的方法，降低分解代谢。或是应用促进蛋白质合成的方法，以减低负氮平衡[4]。在代谢支持、代谢调理的同时，许多学者提出在常用营养物质外，添加一些能促进蛋白质合成、细胞生长、抑制凋亡、对免疫机制有调节作用的物质，如重组人生长激素。 生长激素是脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素。其生物功能是直接的代谢作用和间接的促生长作用。主要表现为促进葡萄糖氧化从而提高能量水平，纠正负氮平衡、维持体重。促进脂肪分解和糖异生，在转录及翻译水平上促进蛋白质的合成，促进胶原的合成。与些同时，生长激素在感染时，还能抑制局部组织炎性介质基因的表达，使心肝肺肾TNFαmRNA的表达下降，从而保护重要脏器[5]。生长激素还能提高中性粒细胞的粘附性，有预激活中性粒细胞的作用，提高免疫反应，促进炎症消退和愈合。这对改善患者的肠道功能，减少应激反应很有意义[6]。 我们认为人重组生长激素在克服“自身相食”，纠正感染病人负氮平衡有着重要作用。通过这方面的研究可以对感染时手术病人，在临床营养方面提供新的理论基础。为建立新的手术和治疗方法提供依据。这无疑将对提高临床工作具有重要的理论意义和实用价值，目前国内尚未有这方面的研究 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。 人参二醇组皂甙（PDS）是人参总皂甙亚型中的四环三萜皂甙。主要包括Rb1Rb2Rb3RcRdRo等。据文献报道可能有以下作用：①通过激活谷胱甘肽过氧化物酶等增加氧自由基清除。②人参二醇组皂甙　可通过降低脏器NOS的活性，减少脏器损伤过程中NO的产生，对损伤器官产生保护作用。③对细胞及细胞结构有保护作用。通过PDS与生长激素的对比研究，可以发现两者的异同点，为PDS应用于临床探索一条新的途径。 实验材料与实验方法 1　实验材料 1.1 主要仪器 静脉插管用硅胶管 　　　　　　　　　　　　上海 铝制背扣　　　　　　　　　　　　　　　　　北京 螺旋式不锈钢弹簧　　　　　　　　　　　　　北京 套针式旋转器　　　　　　　　　　　　　　　美国 代谢笼　　　　　　　　　　　　　　　　　　长春 静脉输液管　　　　　　　　　　　　　　　　上海 电子调速式微量输液泵　　　　　　　　　　　德国 台式离心机　　　　　　　　TGL－16C　 　　上海 托盘扭力天平　　　　　　　TN－100B　　 　上海 光学显微镜　　　　　　　　Olympus　　　 　日本 照相机　　　　　　　　　　DF－2型　　　 　上海 微量加样器　　　　　　　　　　　　　　　　 法国 电热恒温水浴箱　　　　　　　　　　　　　 　武汉 荧光分光光度计　　　　　　RF－540型　　　 日本 光柵分光光度计　　　　　　722型　　　　　 上海 超薄切片机　　　　　　　　LKB－Ⅲ型　　　 瑞典 透射电镜　　　　　　　　JEM－1200EX型　　日本 图像分析仪　　　　　　 　Luzex-F　 　　　日本 流式细胞仪　　　　　　　　FACS　can　　　 美国 分析软件　　　　　　　　　CELLQUEST　　 美国 万能材料测试仪　　　　　　Iastron 4466　　　 美国 高效液相色谱仪　　　　　　GR－421　　　 　日本 半自动图像分析仪　　　　　Crzex-F型　　　　法国 自动生化仪　　　　　　　　Olywpus800　　　 美国 高速低温台式离心机　　　　Jouan MR1812　 　上海 PCR扩增仪　　　　　　　　TC480　　　 　 　美国 微型水平电泳仪　　　　　　　　　　　　　　　瑞典 超净工作台　　　　　　　　XJ－8687型 　　　苏州 激光密度扫描仪　　　　　　LKB－2202型　中国北京 紫外分光光度仪　　　　　　UV－261　　　　　美国 紫外灯　　　　　　　　　　FS－312　 　　　　长春 －70℃冰箱　　　　　　　　　　　　　　　　　日本 1.2主要试剂 50%Glucose 中国人民解放军9088厂　　　　　　 中国 7%Vamin无锡华瑞制药有限公司SSPC　　　　　　中国 20%Iutralipid无锡华瑞制药有限公司SSPC 中国 Soluvit无锡华瑞制药有限公司SSPC 中国 Uitalipid无锡华瑞制药有限公司SSPC 中国 盐酸氯胺酮注射液　上海第一生化药业公司 中国 肝素钠注射液　山东莱阳生物化学制药厂 中国 MCCO4/MNO3　长春化学试剂厂 中国 叠氯化钠磷酸缓冲液　北京化学试剂厂 中国 1. 0MGSH溶液　上海生物化学试剂厂 中国 1.25~1.50 m NH2O2 长春化学试剂厂 中国 DTNB显色液 上海生物化学试剂厂 中国 总RNA分离试剂盒GibcoBRL 美国 反转录试剂盒MBI 美国 IGF－1试剂盒（D－RIA－CT）　　　　　　　　　美国 TNFα酶联免疫试剂盒 中国 人重组生长激素 长春金赛药业 中国 人参二醇组皂甙 吉林大学新民校区 中国 病理与病理生理教研室 异硫氰酸胍　promega 美国 焦碳酸酸乙酯　sigma 美国 重蒸酚promegn 中国 三氯甲烷　天津化学试剂一厂 中国 乙酸钠　沈阳试剂三厂 中国 异丙醇　预防化院实验化工厂 中国 异戊醇　北京化学试剂厂 中国 无水乙醇　长春化学试剂厂 中国 β－二巯斟乙醇　promega 中国 柠檬酸钠　沈阳试剂一厂 中国 十二烷斟磺酸钠　promega 中国 EDTA　北京化学试剂二厂 中国 逆转录酶（AMV酶）promega 美国 4d NTR　 promega 美国 Tag酶　promega 美国 琼脂糖　promega 美国 Tris盐（三羟甲斟氨斟甲烷）北京化学试剂厂 中国 溴酚兰　　北京化学试剂厂 中国 oligo-d T sigma 美国 MARK(Φ×174HaeⅢ) promega 美国 2 实验方法 　　2.1 实验动物及制作动物模型 2.1.1 实验动物及分组 选择雄性清洁级SD大鼠40只，平均体重200±20g（由白求恩医科大学实验动物中心提供）在实验饲养5~7天，适应环境后均获满意生长曲线，然后随机分成四组：正常对照组（N组n=10）用代谢笼喂养，TPN营养支持，仅行部分肠切除肠吻合术；感染组（S组n=10）同样代谢笼喂养，TPN支持，在建立腹腔感染模型24h后行肠切除肠吻合术，皮下注射生理盐水共6天，生长激素治疗组（GH组n=10）手术同GH组，同样代谢笼喂养TPN支持，术后皮下注射rhGH1.5u /kg·d(金磊生长素、长春金赛药业有限公司)人参二醇组皂甙组（PDS组，n=10）手术同GH组，同样代谢笼喂养，术后皮下注射人参二醇组皂甙5mg/kg·d(吉林大学新民校区病理生理教研室赠) TPN方法：热量180kcal/kg·d、氮量：1.5g/kg·d提供，实验持续6天，观察动物代谢情况。 TPN液的配制： 在无菌层流洁净台上配制，详见表1 肠外营养液配方（每100ml溶液含量）　　表1 　成分　　　　　　　　　　含量 　50%Glucose 24ml 7%Vamin 59ml 20%Intralipid 16ml soluvit 0.4ml Vitalipid 0.4ml 肝素 80u 含氮量 660mg 总热量 389.ukJ 氮/热卡 1:140 脂肪乳占能量比重 30% 2.1.2 动物模型制作 2.1.2.1制作TPN模型 术前禁食一天，术前称体重，以氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉，生效后将大鼠仰卧位固定在手术台上，在颈及肩胛区剃毛，消毒局部皮肤，选择颈外侧锁骨方向垂直切口长约1.5~2cm，切开皮肤后稍加分离皮下及筋膜即显露右颈内静脉，于静脉下方穿过二根00丝线，以备远端颈内静脉结扎，近端颈内静脉插管后固定。将右颈内静脉剪开一小口，将直径0.9mm(内径0.5mm)的硅胶管顺向心方向插入上腔静脉约1.5cm，避免插入右心房，硅胶管的另一端连接充满10u/ml肝素生理盐水的1ml注射器。结扎静脉远端，近端结扎固定导管两次。做同侧颈背部皮下隧道，于两肩胛间皮肤将导管引至颈背部，回血通畅后借助导管铝制背扣将导管固定在背部皮肤，导管再经套针性旋转器（可向任意方向旋转）连接静脉输液系统，输液速度为1ml/100g hour，使之恒速并保持连续性。 2.1.2.2 感染模型的制作 插管完毕后开腹，距回盲部1.5cm处用1号丝线结扎，注意保持回肠的通畅，然后用9号针头，在结扎部以下穿刺，造成肠穿孔，完成感染模型。将大鼠放入特制的代谢笼内，大鼠在持续输液状态下可在代谢笼内自由活动。24小时后，切除距回盲部5cm处小肠2~3cm，再行肠吻合术。 注：插管固定过程中要间断使用10u/ml肝素生理盐水冲洗导管，防止导管内凝血，同时严格限制注入量和防止插管的发生气栓，以免导致肺水肿出血倾向和动物死亡[7-9]。 2.2标本的采集 分别于术后第3、6天进行。将四组大鼠称体重后以氯胺酮100mg/kg行腹腔注射麻醉，仰卧位固定在手术台上，剖腹取出吻合口肠段观察吻合口的情况，测量吻合口的抗张强度，羟脯氨酸的含量，然后用肝素化的注射器于左颈内静脉采静脉血3ml，标本采集后迅速做预处理，每只大鼠的血样存入6只抗凝瓶中（各0.5ml）分别用于IGF－1、血蛋白、TNFα、NO等的测定。 2.3实验指标的测定： 2.3.1 氮平衡的测定 氮平衡NB＝入氮Ninpont－出氮Noutpout　　 24小时氮入量＝每百毫升肠外营养液的氮量mg%×24小时肠外营养液实入量 出氮量：尿氮采用微量凯氏定氮法 2.3.2肠吻合口抗张强度的测定： 　步骤：四组动物于术后3、6天，进腹取出吻合口肠段，经Instron4466万能材料测试仪测定吻合口的抗张强度，单位：牛顿。 2.3.3吻合口羟脯氨酸的含量及血羟脯氨酸的含量测定： 步骤：每一吻合口标本在力学测试后，在吻合口标本上下各3cm处切下称重，液氮冷冻碾磨处理后用GR－421高效液相色谱法检测。单位 umol/g。血羟脯氨酸含量测定，收集术后3、6天抗凝血浆标本，同上法采用高效液相色谱法测定，单位umol/L。2.3.4全血谷胱甘肽过氧化物酶的测定[10]（DTNB直接法）。 2.3.4.1测定原理： 　　　　　　　GSH－Px 2GSH+H2O2 GSSG+2 H2O 此反应式中谷胱甘肽过氧化物酶的活力以催化反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶存在的条件下也能进行氧化还原反应（称非酶反应），所以最后计算此酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少部分。GSH与DTNB作用生成的5－硫代2－硝基苯甲酸阴离子呈较稳定的黄色，测定此离子在422~440mm波长的吸收值即可计算出GSH的量。 2.3.4.2测定步骤： 　　量取全血10ul，用双蒸水稀释至1.00ml，取0.40ml的血样稀释液，加1.0 mMGSH0.4ml，在37℃水浴预温5min，加入37℃预热的H2O20.2ml在37℃在水浴准确反应3min，加偏磷酸4.0ml，取上清液2.0ml，加DTNB显色液0.5ml，反应1分钟后5min内在722型光栅分光光度计上于422nm波长下读取OD值。 2.3.4.3计算方法： 　　规定每1ml样本，每分钟扣除非酶反应的Log〔GSH〕降低后，使Log〔GSH〕降低1为一个酶活力单位。具体公式如下： 　　　　　　　　　　　　非酶管Log〔GSH〕－样品管Log〔GSH〕 GPx活力单位数（U/ml）＝ 3min×0.004ml Log(非酶管　－定血管　－Log（样品管　－定血管　） ＝ 　　　　　　　　　　3min×0.004ml 2.3.5 形态学的观察 2.3.5.1光镜：标本经10%中性福尔马林固定24h，乙醇系列脱水，常规石腊包埋后切片，经HE染色后进行形态学的观察、照相，并用Luzex-F型半自动图像分析仪随机全盲测定小肠绒毛高度、隐窝深度、小肠全层及粘膜层厚度。 2.3.5.2电镜：标本经4%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，Epon812包埋，LKB－Ⅲ型超薄切片机切片，醋酸钠－柠檬酸铅的重染色，JEM－1200EX型透射电镜观察小肠粘膜上皮细胞微绒毛及核上区线粒体的变化及照相，并用Luzex－F型半自动图像分析仪随机全盲测定小肠粘膜上皮细胞微绒毛高度及肝脏细胞的变化。 2.3.6流式细胞仪检测小肠粘膜及肝脏细胞的增殖及凋亡情况 2.3.6.1组织单细胞悬液制备 　　制备模型后于感染手术后第6天取小肠标本及肝脏标本，置于PBS液中用毛玻璃研磨。用管吸取组织液过200目筛网，离心1000rpm、5min，去上清再用PBS洗二次，离心1000rpm、5min，除细胞碎片，再用350目尼龙筛网过滤去除细胞团块调细胞数为2×106/ml。 2.3.6.2流式细胞仪检测： 　　取1 ml细胞悬液，加入RNAase（1mg/ml），37℃水浴中可孵育30min，PBS洗二次，再次离心沉淀溶于0.4mlPBS中并加400UPI（50 ug/ml），在4℃避光条件下进行DNA染色30min应用流式细胞仪，氩离子激发波长488nm，测定每个样本记数1000个细胞，经计算机系统分析，绘制细胞数与DNA分布图，从中计算出凋亡率及细胞增值率。 2.3.7　IGF－1的检测 采用IGF－A试剂盒（D－RIA－CT） 原理放射免疫法 2.3.8 血浆NO及组织中NOS的检测 2.3.8.1血浆NO测定采用Criess反应试剂盒 2.3.8.2 NOS免疫组织化学染色 1 组织标本（小肠、肝脏）取出后，放入10%中性福尔马林固定液中行后固定，约48h~72h后用全自动切片机进行脱水，蜡包埋做4um厚连续切片，做5um厚切片备染常规HE染色对比备染NOS免疫组织化学染色。 2 染色方法及步骤 　　免疫组织化学方法采用S－P法，S－P试剂购自北京中山生物技术公司。步骤如下： 　　1、切片脱蜡充分水化； 　　2、PBS洗5 min×3； 　　3、高温高压热修复10min； 　　4、PBS洗5 min×3； 　　5、3%H2O2阻断； 　　6、PBS洗5 min×3； 　　7、室温5% 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 猪血清封闭30min； 8、去血清，加一抗，4℃过夜； 9、PBS洗5 min×3； 10、滴加二抗室温30min； 　　11、PBS/洗5 min×3； 　　12、滴加三抗室温30min； 　　13、PBS洗5 min×3； 　　14、DAB显色水洗中止； 　　15、苏木清染核1min~2min； 　　16、脱水透明中性树胶封片 2.3.9血TNFα及肝组织中TNFαmRNA的测定，血TNFα测定用酶联免疫吸附法试剂盒测定。 　　肝TNFαmRNA转录水平分析：用RT－PCR法，按操作说明进行（试剂购自美国promega公司）。 2.3.9.1引物合成 　　引物设计：根据引物设计的原则并参考电脑基因库核苷酸顺序资料，由上海生工生物工程公司合成纯化。 　　大鼠TNFαcDNA引物序列： 　　上游5＇－GCCAATGGCATGGATCTCAAAG－3＇ 　　下游5＇－CAGAGCAATGACTCCAAAGT－3＇ 　　　　TNFα扩增产物的DNA全长为357bp。 2.3.9.2组织总RNA的提取 （1） 采用异硫氰酸胍法： （1）取100mg冻存于液氮中的肝组织标本置于EP管中，将组织剪碎，充分研磨、匀浆。（2）加入预冷的变性液（异硫氰酸胍＋CSB缓冲液）0.4ml/管，间断、反复充分振荡（弹振），静置15min，待其充分变性裂解至澄清、透明。（3）加入三蒸水0.2ml/管。（4）加入2mol乙酸钠（pH4.0）60μl/管，充分混匀。（5）加入酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）0.6ml/管，充分弹振。（6）加氯仿：异戊醇（24:1）0.3ml管，充分弹振。（7）离心：15000rpm×8min，4℃。（8）移取上层水相至另一EP管中。（9）加等体积的异丙醇（0.6ml/管），充分弹振。（10）沉淀：-70℃,2h以上或过夜。（11）离心：15000rpm×15min,4℃。（12）轻轻弃去上层液体，稍干燥，加DEPC水0.5ml/管，充分弹振，静置15min，待充分溶解。（13）加氯仿：异戊醇（24:1）0.5ml/管，弹振。（14）离心：12000rpm×5min, 4℃。（15）取1.5mlEP管加乙酸钠40μl/管。（16）取（14）离心后EP管吸取上清0.4ml移入（15）之EP管。（17）-70℃,2h以上，亦可过夜。 （2） 组织中总RNA的浓度 测定20份标本组织总RNA，在紫外分光光度仪260/280nm处的OD比值为1.88±0.06，根据公式，实际OD260×核酸稀释倍数×40/1000，计算出RNA的浓度为80.4±18.35μg/mg组织，提示异硫氰酸胍法提取RNA适量有较高纯度和活性的总RNA。RNA经0.9%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳，明显可见28s及18s核糖体RNA条带，28s与18sOD值比值接近于2，说明样品未被降解。 2.3.9.3逆转录 （1） 取冻存RNA的EP管离心，15000rpm 10min, 4℃。（2）徐徐倒出上清液体，缓缓加入75%乙醇1.0ml/管。（3）离心12000rpm 5min, 4℃。（4）轻轻弃液体，倒置离心管，使之干燥。（5）配逆转录反应液，每12份样本用量按如下比例，逆转录酶（AMV）缓冲液（5×）48μl /,4d NTP24μl,oligo-d T 6μl，蒸馏水10μl。混匀，将上述反应液按7μl/管，预先加入已编号的0.2mlEP管。（6）溶解RNA模板：在（4）之已干燥的EP管中加DEPC水10μl/管反复抽打，使RNA溶解。（7）移取RNA模板5μl/管，加入（5）之0.2mlEP管中，抽打混匀。（8）变性：90℃,5min。（9）加AMV8μl/管（12份标本按100μl蒸馏水加7μlAMV原液）。（10）灭活酶类，90℃，5min,-70℃保存。 2.3.9.4 cDNA扩增 （1）配PCR反应液（每12份标本用量）：PCR　buffer缓冲液（10×）30μl,MgCl2 30μl,d NTP 6μl,引物1加3μl，引物2加3μl，参照引物1加6μl，参照引物2加6μl，蒸馏水190μl，Taq DNA多聚酶3.5μl，混匀。23μl/管加入0.2ml EP管。（2）取逆转录之c DNA 2μl/管，加入PCR反应液之EP管，抽打混匀。（3）上PCR仪扩增，反应条件：94℃,45S。72℃,1min30。全部扩增循环30次后，在72℃做5min终止前延伸。（4）取扩增产物-70℃保存，备电泳分析。 2.3.9.5　PCR产物的分析 取5μlPCR扩增产物，在2.5%的琼脂糖凝胶水平电泳上做扩增产物检测分析，电压50伏，0.5-1h，溴化乙啶（EB）染色。紫外灯下观察、拍摄电泳条带，激光密度扫描仪扫描底片。计算曲线下峰面积做为PCR产物含量，用下列公式计算目的扩增产物m RNA的表达水平： 产物的含量＝目的扩增产物的光密度值/参照系统β-actin扩增产物的光密度值×100% 3　临床研究 3.1 临床资料 病人选择　选择住院的肠瘘伴腹腔感染病人11例，其中男6例，女5例，年龄在33～62（42.3±10.26）岁，病人入选条件符合ACCP/SCCM的Sepsis诊断标准[11]，且腹腔感染已经检查明确证实。排除肿瘤或有肿瘤病病史病人，研究过程中均未用皮质激素。 3.2 病人分组与处理　11例病人随机分为对照组6例和rh GH组5例。两组病人年龄、性别组成和病程基本相似。入院后均给予相同处置，包括：补液、抗生素治疗和腹腔引流管冲洗引流等。病人生命体征、内稳态相对稳定后进行研究。其中rh GH组病人在TPN营养支持同时给予重组人生长激素（长春金赛药业有限公司）4.5×2/d，皮下注射，连续7天，对照组仅予TPN。观察病人研究过程中体重、血浆蛋白、IGF－1、免疫功能。 数据处理 采用统计学方法。所有数据均以X±S表示，在计算机上利用SAS6.22软件进行方差分析和Q检验，以P＜0.05为差异显著。 4　实验结果 4.1 动物实验 4.1.1 氮平衡 感染后第1天，各组大鼠迅速处于负氮平衡。感染后第6天，GH组恢复正氮平衡，而此时感染组大鼠仍为负氮平衡。PDS组同感染组变化不大，详见表2 实验前后各组动物氮平衡变化情况　　表2 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　第1天　　　 第3天　　 　第6天 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 N　　-13.25±5.12 -5.51±3.2 5.50±1.8 S -34.13±6.18 -20.15±3.2 -14.42±2.173) GH -15.13±3.42 -6.25±3.1 3.52±1.51) PDS -28.12±5.17 -19.18±2.5 -13.12±3.12) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1)与感染组3)比较有统计学差异（P＜0.05） 4.1.2 体重 大鼠腹腔感染后体重明显下降，GH可以促进体重恢复。实验第6天时GH组体重明显高于感染组，接近对照组。PDS组同感染组无明显差异，详见表3 各组动物体重变化情况　　　　表3 　 　　　　第1天　　　 第3天　　 　第6天 　 N　　 237±19 182±11 193±14 S 235±21 171±18 160±102) GH 232±17 180±12 190±111) PDS 230±10 170±110　　　159±12 　 1）与本组第3天比较有统计学差异（P<0.05） 1）与感染组2）比较有统计学意义（P<0.05） 4.1.3 吻合口瘘的发生率： 因有些大鼠发生吻合口瘘后并发腹腔脓肿无法行吻合口的其他指标而摒除，故各组均增加了样本量，经X2检验，S组大鼠吻合口瘘发生率（26.1%）明显高于GH组（5.7%）P<0.05，PDS组同样高于GH组为（8.7%），但两者差异不显著（P>0.05）。 4.1.4 血羟脯氨酸的浓度（μmol/L），详见表4 各组动物血羟脯氨酸变化情况　　　 表4 　 第1天　　　 第3天　　 　第6天　 　 N　　　　21.5±3.88 46.67±3.15 62.7±6.18 S 　 22.1±4.46 28.94±6.2 31.21±7.162) GH 　21.3±3.17 41.89±7.8 47.89±7.81) PDS 　21.8±6.17 29.21±5.3 33.29±6.183) 　 1) 与S组2)比较P<0.05。　1)与PDS组3)比较P<0.05 PDS组同S组差异不显著 4.1.5吻合口羟脯氨酸浓度（μmol/L），详见表5 　　各组动物吻合口羟脯氨酸变化情况　表5 第3天　　 　第6天 N　　 0.53±0.31 1.21±0.29 S 0.43±0.11 0.68±0.312) GH 0.52±0.17 9.97±0.131) PDS 0.41±0.2 0.70±0.303) 1) 与S组2)比较P<0.05； 　1)与PDS组3)比较P<0.05 PDS组同S组差异不显著 4.1.6 肠吻合口抗张强度（Newton），详见表6 各组动物肠吻合口抗张强度变化情况　表6 　 第3天　　　　　第6天 　 N 0.236±0.027 1.027±0.121 S 0.143±0.021 0.534±0.1362) GH 0.204±0.039 0.897±0.1421) PDS 0.142±0.011 0.587±0.1913) 1)与S组2)比较(P<0.05)； 1)与PDS组3)比较P<0.05 PDS组同S组无差别 4.1.7 小肠组织形态学观察及测定结果 病理图像分析：用多媒体彩色病理图像分析仪，测量小肠组织病理切片中肠粘膜厚度、隐窝深度和绒毛高度，每张切片测量15个视野，详见表7　图A1～3 各组小肠粘膜变化情况　　 　　　　　表7 检测指标　　　 N　　　 　 S　　　　 PDS　　　　 GH 绒毛高度 400.7±13.82 350.3±9.712) 380.2±13.103) 396.8±13.601) (μm) 隐窝深度 200.3±9.71 136.1±9.072) 172.2±8.133) 197.4±8.631) (μm) 粘膜厚度 584.9±10.20 535.6±8.722) 562±9.123) 581.2±11.981) (μm) 1) 同S组2)比较有统计学意义(P<0.05) 1)同PDS组3)比较无统计学意义(P>0.05) 3)同S组2)比较有统计学意义(P<0.05) 4.1.8 小肠绒毛的电镜观察　见图A4～9 4.1.9 小肠及肝脏细胞增值及凋亡情况　见图A10～13 　　用全自动流式细胞分析仪测定肠粘膜上皮细胞周期G0－G1%、G2M%和S%，通过计算增殖指数（proliferation index,PI=〔S+G2M〕×100%）和S期细胞比率系数(sgnthesis part fanction,SPF=S%)，详见　　　　　　　　　　　　　　　　　　表8 各组动物小肠及肝脏细胞增殖情况　　　　　表8 检测指标　　　 N　　　 　 S　　　 PDS　　　　 GH PI 小肠　 7.81±2.07 3.68±1.853) 6.25±1.782) 7.65±1.971) 肝　　　10.25±3.41 6.23±2.033) 8.91±2.982) 9.87±3.211) SPF 小肠 　7.28±1.87　　3.27±1.623) 6.21±1.712) 7.38±1.891) 肝　　　11.31±4.01 6.85±2.173) 8.16±2.412) 9.76±3.111) 1) 同S组比较P<0.05有统计学意义 1）同PDS组比较P>0.05无统计学意义 4.1.10 全血谷胱甘肽过氧化物酶的测定结果，详见表9 　　　　　　全血谷胱甘肽过氧化物酶变化情况　　　 表9 　　　　第1天　　　　第3天　　　 第6天(U/ml) N　　 15.21±1.12 18.51±1.21 20.24±1.93 S 8.21±1.11 9.41±1.32 10.57±1.12 GH 10.51±1.311) 15.32±1.421) 21.01±1.731) PDS 11.31±1.312) 16.01±1.102) 19.81±1.252) 1)同S组比较有统计学意义(P<0.05) 2)同S组比较有统计学意义(P<0.05) 4.1.11 血NO及小肠肝脏组织中NOS的测定结果，详见表10　图A14～17 　全血NO的变化情况 表10 　　 　　第1天　　　 第3天　　 　第6天 N　　 60.4±0.4 52.3±0.3 50.1±0.5 S 235.1±19.4 180.2±17.1 160.1±10.1 GH 221±18.51) 130±13.21) 70.1±0.91) PDS 225±19.82) 140±11.22)　 80.2±0.82) 1) 同S组比较有统计学意义(P<0.05) 　 2) 同S组比较有统计学意义(P<0.05) 1) 同2)比较无统计学差异（P>0.05） 各组小肠及肝脏NOS观察结果：采用S－P免疫方法，应用鼠抗NOS单克隆抗体，用免疫组化染色法，通过底物显色，NOS在组织片分布，以阳性细胞数＞20%为强阳性（＋＋），阳性细胞数＞10%为阳性（＋），阳性细胞数＜10%为阴性（－）。 GH组同S组比较有统计学意义P＜0.05； PDS组同S组比较有统计学意义P＜0.05； GH组同 PDS组无统计学意义P＞0.05. 4.1.12 各组大鼠血液中IGF－1的测定，详见表11 　　　血液中IGF－1变化情况 表11 　　　　第1天　　　 第3天　　 　 第6天 N　　 32.41±3.12 32.21±2.69 33.18±3.21 S 31.21±2.98 32.28±2.79 33.16±2.43 GH 33.17±3..05 45.29±4.511) 68.12±5.131) PDS 31.87±3.17 33.21±2.98　　　32.19±2.78 1) 同S组、PDS组比较有显著差异(P<0.01) 4.1.13 血TNFα及肝脏组织TNFα　mRNA的测定结果 　　TNFα　mRNA转录水平的分析： 　　S组呈高表达，比GH组及PDS组显著增多，分别为肝脏小肠：3.9、3.5，而GH组为1.0、0.8，PDS组：0.9、1.1，正常对照组为0.15、 0.4。见图A18～19 　　GH组同S组比较有统计学意义P＜0.05 PDS组同S组比较有统计学意义P＜0.05 　　GH及PDS统计学上无差异 　　临床研究 4.2 临床研究结果 4.2.1 两组病人体重表现，详见表12 　　　治疗前后体重变化情况　　　 表12 治疗前　　 第4天　　　第7天 TPN组　　　　56±8　　　55±10　　　53±10 TPN＋GH组　 55±5 54±12 55±7 　 GH组体重基本上没有变化，而TPN组平均下降5.8% 4.2.2 两组病人氮平衡的变化，详见表13 　　　治疗前后氮平衡变化情况　　　　　表13 　　　　　　第1天　　　第3天　　 　第7天 　 TPN组 -11.15±3.12 -5.28±2.13 -3.17±1.21 TPN＋GH组 –10.12±2.21 -1.25±2.1 3.32±1.5 　 TPN+GH组到3～4天逐渐恢复正氮平衡 而TPN组第7天还是负氮平衡 4.2.3 两组病人蛋白代谢结果，详见表14 治疗前后蛋白变化情况　 　　　　表14 治疗前　　　　第4天　　　　第7天 血清白蛋白(g/L) TPN组 25.30±4.51 28.21±3.05 29.53±4.21 GH组 25.78±3.99 30.31±4.02 35.78±4.67 前白蛋白(g/L) TPN组 0.38±0.03 0.99±0.25 1.01±0.15 GH组 0.37±0.9 1.51±1.21 5.03±1.87 转铁蛋白(g/L) TPN组 1.89±0.66 1.99±0.33 2.07±0.53 GH组 1.91±0.71 2.31±0.67 6.01±0.98 GH组与对照组TPN组比较P＜0.05 4.2.4 两组病人免疫球蛋白的结果(g/L)，详见表15 　　　　　　　　治疗前后免疫球蛋白变化情况　 　　　表15 　 治疗前　　　　第4天　　　　第7天 lgG TPN组 13.04±0.68 　 14.21±2.07 16.31±3.12 TPN+GH组 13.41±0.92 　15.52±1.99 19.34±1.05 lgA TPN组 1.89±0.05 2.01±0.92 2.29±0.81 TPN+GH组 1.90±0.57 2.36±0.82 3.01±0.90 lgM TPN组 2.13±0.23 3.38±0.13 3.42±0.21 TPN+GH组 2.27±0.37 3.67±0.22 4.81±0.16 　 GH组与对照组比较P＜0.05 5　讨论 营养支持素为临床医师所重视，但在七十年代以前，因无有效的肠外营养支持措施，当病人的肠道功能发生障碍时，营养支持很难实现。1968年，Dudrick与Wilmore提出的“静脉高营养”（intravenous hgperalimentation）方法在临床实施后，临床营养支持出现了一个转折点。当肠道不能消化吸收营养时，肠外营养可提供必要的营养物质以维持机体的所需，有利于继续治疗。以此为基础，有关临床营养支持的方法与各类病人的代谢改变，在20世纪的最后30年有了迅速的发展与进步。我国自1970年后也逐渐应用于临床，八十年代后有较快的发展。 首先是对营养支持的目的有进一步深入的理解。在七十年代初期，营养支持重在维持病人的氮平衡。随着研究的深入，认识到各类疾病病人有着不同的代谢改变，对营养物质的需要与代谢亦不同。同时，营养支持并不是单纯地提供营养，更重要的是使细胞获得所需的营养底物而进行正常或近似正常的代谢以维持其基本功能，这样才能保护或改善器官组织的功能和结构，才能改善包括免疫功能在内的各种生理功能，以达到有利于病人康复的目的。当基本功能单位细胞的营养底物不够时，ATP能量产生不足，会加速、增多细胞凋亡，直接参与了器官功能障碍的产生，因而营养支持在治疗学中的重要性为之突出。然而在疾病的病理生理改变中，可能出现高代谢、代谢失代偿状态，均可能对外源性营养产生不应性，使营养支持的难度为之加大，许多问题有待解决，从而增加了代谢与营养支持研究的浓度与广度。怎样解决这些问题，是当前临床营养支持中的研究热点。 当前，生命科学有很大的发展。治疗学各个领域都有所扩大，许多危重疾病的治疗有明显的进展，营养支持的需要性和迫切性增加。根据文献报告，我国现有住院病人中有40～50%属营养不良，需要营养支持，而实际能获得这一治疗者不足20%。同时，当前的营养支持从应用方法到实践理论都还没有达到完美程度。，肠外或肠内营养的制剂，输注方法与护理都还有不足处，有待进一步改进。 一般营养不良病人的营养支持能获得好的效果，但在危重、应激、感染病人，机体已呈高分解状况，组织蛋白处于自身分解，对外源性营养又有不应性，因此，在这一类病人中，营养支持的效果不甚满意。八十年代以后有从营养物质的量与质上加以高速的代谢支持（metabolic support）与从高速分解代谢激素的分泌与改进合成代谢的调理（metabolic intervention）学说与方法，从高速分解代谢与合成的比例着手，以提高危重病人营养支持效果。本课题根据上述理论研究了感染病人营养代谢的机制，使营养支持的目的从维持氮平衡、保持瘦肉体，深入到是维护细胞代谢，改善与修复组织、器官的结构、高速生理功能，以促进病人的康复。 5.1 感染后机体的代谢改变 腹部外科病人由于创伤、感染等应激因素机体发生严重的代谢紊乱，其表现为大量分泌激素及众多炎症介质的释放所致的高代谢。此时，蛋白质的净分解大于净合成，由于胰岛素有阻抗现象，葡萄糖利用障碍，机体能量消耗有赖于内源性组织蛋白质的大量分解，以满足异常增高的能量需要。同时蛋白质迅速分解，提供每天需要的某些氨基酸，以作为大量急性相蛋白质合成基质，使白蛋白短期急剧下降，肌蛋白大量丢失，尿氮排出增多及负氮平衡，最后导致器官功能障碍。 急性腹腔内感染的病理机制主要包括：①局部炎症反应。参与组成腹腔内防御屏障的细胞主要是腹腔内巨噬细胞和中性白细胞。腹腔内感染后，病灶能否局限首先取决于这种早期防御反应的强度[12]。②全身炎症反应。如果腹腔内感染不能得到有效控制，细菌及其代谢产物从感染灶入血，引起全身脓毒血症；刺激全身其它组织的巨噬细胞产生细胞因子，从而引起血液中细胞因子浓度升高[13]，促发级链式全身炎症反应（SIRS），导致多脏器功能障碍（MODS）最终发展到多脏器功能衰竭（MOF）而死亡[14]。 我们的研究结果表明，在炎症的发生和发展中，血循环及组织微环境的TNFαmRNA的转录水平，NO的水平增高，而GSH－Px含量明显下降。 TNF是一种分子量为17Kda的可溶性多肽，在严重感染时，巨噬细胞、T细胞和NK细胞在革兰氏阳性杆菌和脂多糖的作用下，产生大量的TNF，它在复杂的细胞因子网络中可能起核心作用，其产生的网络效应，相互协同作用是感染导致MODF或MOF的主要机制[15]。 一氧化氮（NO）是一种水分子气体，是由L－精氨酸中的胍基氮原子经一氧化氮合成酶（NOS）催化而产生的，它是细胞功能的介质，递质或调节物，NO能参与细胞介导的免疫反应。内毒素、TNFα、白细胞介素、血小板活化因子等多种细胞因子可使内皮细胞巨噬细胞、平滑肌细胞产生大量NO。NO能松驰血管平滑肌、使血管扩张、抗血小板、白细胞粘附作用。但血管的广泛、过度扩张，又会导致重要脏器的微循环发生障碍[16]。 人们已认识到NO是一种自由基，近年来研究又表明，在感染时，炎性细胞因子水平上升，而后者诱发产生的NO可能参与炎症病情进展和全身并发症的过程[17]。Konturek等[18]认为急性感染时，内毒素可以使TNFα和NO浓度增加，两者对组织损伤有协同作用。 氧自由基在组织损伤的成因中起重要作用。还原型谷胱甘肽GSH是保护组织免受氧自由基损伤的主要抗氧化剂。机体通过保持组织中的还原型谷胱甘肽的储备，间接抵抗抗氧自由基对生物膜的损伤[19]。 本实验观察到，腹腔感染时机体的GSH－Px含量明显减少，不能使GSH结合氧自由基形成氧化型谷胱甘肽（GSSG），便生成的自由基不能及时清除，这些活性氧化分子与细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，结果导致肠组织细胞损伤进一步加剧。肠粘膜受到损害后，从而发生肠粘膜通透性增高，重者进一步发展为肠道细菌移位，导致败血症甚至多器官功能衰竭[20]。 5.2 腹腔感染后蛋白质代谢改变 血清白蛋白水平既是病人营养指标，也是预后的重要指标，血清白蛋白浓度与病情严重程度和死亡率密切关系[21]，低蛋白血症常提示预后不良[22]，腹腔感染后病人广泛存在低白蛋白血症，发生率高达92.4%。这是由于外科手术病人术前常有营养不良、术中和术后又有蛋白丢失和消耗，临床上广泛应用输注人体白蛋白来纠正病人的低蛋白血症，这还会导致抑制白蛋白基因表达，抑制内源性白蛋白的合成[23]，增加白蛋白分解[23]，增加血管负荷，减弱凝血机制[24]。 本研究提示，创伤和感染后机体蛋白明显下降。说明创伤和感染已严重影响机体的蛋白代谢状态，使机体蛋白处于高分解代谢状态。这是由于创伤和感染使机体处于应激状态，高感神经－肾上腺髓质系统和下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴兴奋，使机体　茶酚胺和肾上腺皮质激素明显升高，进而抑制蛋白合成，促进蛋白分解，以便为机体提供能量和合成急性期蛋白的原料。 5.3 营养支持在感染后蛋白质代谢中的作用 营养支持可以提供足够的代谢底物，已成为感染等应激病人的重要治疗措施。然而，过量的营养物不仅未能改善代谢紊乱，反而有可能加重脏器损害，增加机体代谢负担。八十年代后期，Cerra等学者提出“代谢支持”原则[25]。包括：（1）非蛋白热量不超过30～35kcrl/kg，（2）以脂肪和糖共同供能，糖脂比4：6；（3）适当提高供氮量，将非蛋白热量与氮的比例降至100～120kcrl:1g氮。根据这些原则，提供合理数量、比例的能量底物顺应了应激后机体的代谢变化，有利于器官结构和功能维护。然而，由于未能改变异常代谢经路，机体对外源性营养要素存在着利用障碍。在感染条件下单纯TPN，并不能显著提高血浆白蛋白、白蛋白、转铁蛋白和肌肉蛋白浓度。 5.4 人参二醇组皂甙（PDS）和人重组生长激素（rhGH）在营养支持中的作用。 5.4.1 人参二醇组皂甙是人参总皂甙亚型中的四环三萜皂甙，主要包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Ro等，它可以通过抑制5－羟色胺的释放或加速分解，改善微循环[26]；对细胞及亚细胞结构有保护作用[27]。 PDS组还表明GSH－Px的活性显著增高。GSH－Px可以通过增强免疫系统（B－淋巴细胞、T－淋巴细胞、巨噬细胞等）中的活性，控制H2O2的释放来调节杀伤和保护自身[28]。PDS可以减少NO的产生，防止NO对重要脏器微循环的损伤。它的机理可能是通过增加GSH－Px，保护组织免受氧自由基的损伤，稳定细胞膜，改善微循环，从而增强了各脏器对毒素的耐力而发挥保护作用[29]。 5.4.2 生长激素（GH）是垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，它在人体中除有促生长作用外，还起到促进机体蛋白质合成及脂肪分解的代谢调理作用。最初获得的GH制剂主要从牛垂体中提取，也可以通过另外途径得到少量人的生长激素。1985年，重组人生长激素（rhGH）合成成功并正式获准在临床使用以来，其促进生长，尤其是促进合成代谢的作用越来越受到重视，由于rhGH的安全性和易获得性，其在临床应用的适应症不断扩大。 感染及应激是微循环障碍，缺血和再灌注损伤的过程，其确切的发病机理仍未完全阐明[30]。我们的研究结果表明，在感染及应激发生和发展中，血循环及组织微环境的TNFαmRNA的转录水平有高表达，其产生的网络效应，相互交叉的协同作用，可以诱导致NO等细胞介质的产生，是全身炎性反应综合症（SIRS）或MOF的主要机制，从肝脏及小肠电镜上也可以看到这些细胞、亚细胞和分子转录水平的病理变化均提示了SIRS，全身性感染及后继病损成统一的连续体。这一过程本质是SIRS。本实验结果证实，rhGH应用可以减轻内毒素血症，并不同程度抑制感染中脏器TNFαmRNA表达，而且血中TNFα和NO均有明显降低，提示rhGH能有效防止多器官损伤可能与抑制局部组织炎性介质基因表达有关[31]，其机理可能是生长激素通过促进骨髓细胞成熟刺激呑噬细胞迁移，触发呑噬细胞产生超氧阴离子，如GSH－Px及细胞因子和提高调理等作用来保护宿主免受损伤。 我们经过动物实验表明，在腹腔感染的条件下，行肠切除肠吻合，术后应用生长激素，不仅明显减缓体重丢失，恢复正氮平衡，而且能提高肠吻合及血中羟脯氨酸的含量。而羟脯氨酸是酸原蛋白的主要基质，胶原合成是肠吻合口愈合的特征，胶原的含量与吻合口强度正相关[32]，胶原蛋白含量增加促进肠吻合口的愈合，增加了肠吻合口的抗张力。术后2～3天吻合口强度依赖于缝线缝于已存在的胶原纤维，新形成的胶原用于修复吻合口使之恢复原有强度。可见术后2～7天吻合口强度最弱，是吻合口瘘发生的高峰期，因此，肠切除合并腹腔感染患者手术后，早期应用生长激素对吻合口的愈合显然有正性作用，它提高肠吻合口局部羟脯氨酸含量的同时，刺激肠粘膜Ⅰ型胶原mRNA转录，从而更早形成胶原纤维，减少了吻合口瘘的发生[33～34]。应用生长激素的肠切除术后吻合口瘘的发生率为5.7%，明显低于对照组（26.1%）。同时，生长激素可促进腹腔感染大鼠肠粘膜增殖，维持粘膜正常结构的同时，促进肠粘膜吸收功能的恢复，表现为rhGH组细胞的增殖指数PI（7.65）明显高于S（3.68）而细胞的凋亡率（7%）明显低于S（14%）。 生长激素是体内主要的促蛋白合成激素，具有广泛的代谢效应。大量的动物和临床实验表明，rhGH可以减少创伤，手术后肌肉分解，促进正氮平衡、血浆蛋白质的合成以及烧伤创面的组织愈合等[35]。rhGH促进蛋白合成的作用是通过诱导肝细胞合成IGF－1而实现的。IGF既胰岛素样生长因子，是一种机体生长发育及代谢具有广泛作用的分泌蛋白。目前，已发现胰岛素样生长因子－1（IGF－1）及胰岛素样生长因子－2（IGF－2）两种形式的IGF，其中IGF－1是当前研究代谢作用的重点[36]。本研究表明rhGH组大鼠，创伤和感染后出现了IGF－1降低。此结果与wojnor等[37]和Ross等[38]的结果基本一致。同时亦有研究证实，严重创伤机体IGF－1以循环中的清除速度加快，这些可能是急性应激期机体IGF－1水平降低的主要原因。 rhGH促进腹腔感染后机体蛋白合成的机理可能是，rhGH对感染大鼠肝脏白蛋白mRNA表达有促进作用，在离体的培养肝细胞中也表现出显著的白蛋白合成效应，显示rhGH对肝脏具有直接影响。这种效应可能是通过与肝细胞GH受体结合，引起细胞内第二信使的变化所介导。rhGH通过介质IGF－1可促进感染后受抑制的蛋白翻译过程的启动[39]，在转录与翻译两个层次提高蛋白合成水平。本研究也证明rhGH组大鼠IGF－1明显提高，同时也明显提高了血清白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白浓度，提示对感染后机体血浆蛋白合成有显著促进作用。此外，通过促进腹腔感染后肠粘膜对谷氨酰胺的利用，维持粘膜正常的结构和功能，减少肠腔细菌与毒素易位至体循环rhGH可部分减轻炎性细胞因子释放，内环境的进一步恶化对机体蛋白合成的抑制作用。 生长激素有多种不同的调节功能，主要为参与DNA和RNA的合成，组织对氨基酸的摄取有细胞间蛋白转运等[40]。而最近的动物实验发现，GH可促进肠道代偿，使肠粘膜细胞明显增殖，致肠粘膜的重量明显增加及DNA和RNA的含量增加和粘膜皱壁的加深[[41-42]。我们进行了动物实验了解rhGH对小肠粘膜增殖与代偿的作用，并探讨其作用机理。 小肠绒毛高度、隐窝深度和粘膜厚度可从形态学角度反映小肠吸收能力。小肠粘膜上皮细胞的再生来源于小肠隐窝内具有分化潜能的未分化干细胞，这些细胞可能变成分化干细胞在机体需要时及生长激素作用下能缩短细胞周期，加快分化增殖，并迁移至绒毛表面，以更新衰老变性的干细胞[43]。我们的实验研究中rhGH组小肠绒毛高度、隐窝深度和粘膜厚度的增加表明rhGH的应用促进小肠粘膜的增生。 细胞增殖是通过周期实现的，在细胞分裂周期中，S期最能反映细胞的增殖活性。正常及生长缓慢的组织S期所占的比率很小，随着细胞增殖，DNA合成加速，S期比率增大，因此通过对S期测定可反映细胞的增殖程度。本实验研究中rhGH组PI数和S期细胞比率分数均较对照组增高，证明rhGH可以明显促进小肠粘膜的增殖性。 5.5 人重组生长激素在感染病人中的应用 肠外瘘是腹部外科的严重并发症。肠外瘘发生后，虽经合理治疗，　需8～12周始能自行愈合。如不能自愈还得等待3个月以上，方能接受确定性手术。在这一过程中及确定性手术的围手术期间并发症发生率和病死率均较高。因此，通过简单的引流手术和非手术疗法，以促进肠外瘘快速自愈是缩短治疗时间、减少治疗费用和降低病死率的关键。应用全肠外营养（TPN）后，提高了自愈率。近年来，应用生长激素改善蛋白质的合成与促进组织愈合取得了满意的疗效[44]。 腹部外科病人由于创伤、感染等应激因素，机体发生严重的代谢紊乱，其表现为大量分解激素及众多炎症介质的释放所致的高代谢。此时，蛋白质的净分解大于净合成，由于胰岛素的阻抗现象，葡萄糖利用障碍，机体能量消耗有赖于内源性组织蛋白质的大量分解，以满足异常增高的能量需要。同时蛋白质迅速分解提供每天需要的某些氨基酸，以作为大量急性相蛋白质合成的基质，使白蛋白短期急剧下降，肌蛋白大量丢失，尿氮排出增多及负氮平衡，最后导致器官功能障碍。本组病人前白蛋白、转铁蛋白明显降低，负氮平衡明显。目前营养支持已成为严重应激病人的重要治疗手段。然而常规的肠外营养支持在提供了充足的热卡和底物的同时，却不能有效逆转分解代谢，促进蛋白质合成，同时许多研究亦表明，严重应激病人单纯TPN不能使氮整体达到平衡及显著提高白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白的血浆浓度。为追求正氮平衡给予过高的营养物质，反而加重器官和功能损害。 生长激素是体内主要的促蛋白合成类激素现已证实，它具有明显的节氮效应，逆转负氮平衡，减少创伤、感染后肌肉分解，增加蛋白血浆蛋白合成，促进脂肪分解，并可提高机体对外源性营养底物的转换利用，相应减少肠外营养物质的输入。rhGH对蛋白质的代谢的作用机制，主要是通过胰岛素样生长因子（IGF－1）调节的，rhGH可促进肌肉、肝脏中IGF－1合成与释放，IGF－1具有抑制蛋白分解及明显增加细胞对氨基酸摄取的效应。从本组11例病人应用的结果可以看出，病人4天后达到正氮平衡，血浆白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白以及IGF－1较应用前明显增加，差异显著，病人恢复较快。需要说明的是本组6例在应用rhGH前行TPN支持一周以上，同时间断输入白蛋白、血浆制品、但氮平衡及血浆蛋白各项指标无明显改善，而应用rhGH加TPN却很快获得满意效果。因此，rhGH与TPN联合应用，必将成为危重病人较理想的营养支持方法。 rhGH对机体免疫系统有调节作用[45]。生长激素是人体内主要的促进蛋白质合成的激素，近年来大量的动物和临床实验表明[46-47]，重组生长激素可以减少创伤感染后肌肉蛋白质的分解，减少尿素氮的排出量，促进自身脂肪氧化供能，促进蛋白质的合成，且rhGH显著促进肝细胞白蛋白基因表达和白蛋白的合成[48]。本研究发现感染后病人血浆蛋白浓度有一个进行性下降时期，重组人生长激素（金赛）加低热量肠外营养支持能明显改善术后病人血浆白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白浓度、对感染后低蛋白症有明显的治疗作用。 免疫功能关系到抗感染能力，康复和最终预后，感染及创伤等使机体免疫功能短时间内受到抑制。我们研究发现，感染后病人lgA 、lgM、lgG明显下降，重组人生长激素可改善术后病人的免疫功能，提高lgA 、lgM、lgG的浓度。还有学者观察到rhGH能提高术后病人的淋巴结亚群，增强病人的免疫功能。 总之，本研究中动物实验部分为我们提供了在腹腔感染条件下，应用生长激素能促进肠切除吻合口愈合的理论依据。而本组临床病例的成功不但证实了这一设想的可能性，也为将来改变肠瘘治疗策略，早期行肠瘘确定性手术带来希望。同时对PDS的作用进行了探讨，为PDS在营养方面的应用提供了新的经验。 6　结论 人重组生长激素可以调节感染时术后的营养状况、促进蛋白合成、肠粘膜生长、降低TNFα、NO的产生、保护主要脏器。克服“自身相食”现象，发挥“代谢调理”的作用。人参二醇组皂甙可以抗应激、保护细胞、抑制细胞凋亡，对营养代谢有一定的调节作用。 参考文献 [1]Dndrick S.J,Wilmore D.W,Vars H.M,Roads JE,longterm total porenteral nutrition with growth,development,and positive nitrogen balance.Surgery,1968,64:134. [2]黎介寿.肠功能障碍.中国胃肠外科杂志.1998,1(1):1. [3]Jiang ZM,Zhang FS,Zhu Y,etal.Evaluation of parenteral nutrition in postoperative patient.Surg Gyn Obst,1988,166:115. [4]蒋朱明.等.重组生长激素对术后营养支持患者人体组分和肌肉功能的影响.中国医学科学院学报.1994,16:443-447. [5]张群华.倪泉兴.蔡端等.生长激素和生长激素对急性坏死性胰腺炎肝损伤的保护作用　中华医学杂志.1998,78:621. [6]蒋朱明.等.手术后患者应用生长激素及肠外营养的代谢效应.中华外科杂志,1995,33:704. [7]Steiger E,et al A technique for long-term intravenous feeding in unrestrainel rats Surg,1982,104(3):330. [8]花天放.等.大鼠长期静脉喂养的输液技术.上海医学.1984,7(2):116. [9]张泽斌.等.大鼠完全胃肠外营养的动物模型.中华实验外科杂志,1996,7(2):92. [10]夏奕明.朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽氧化物酶活力的测定方法.卫生研究.1987,16(4):28 [11]Members of American College of Chest Phgsicians Society of Critical Care Medicine Consensns Confererce Committce Definitions for sepsis and organ failure and guide lines for the use of innovative therapies in sepsis.Crit Care Med,1992;20:864. [12]Dunn DL,Barke RA.Role of resistend macrophages,periphenal neutrophils,and transly mphatic absorption in bacterial clerace from the peritoneal cavity Infect Immnn,1985;45:257. [13]Takesue Y.Experimental study on the development of endotoxemia in peritonitis with special reference to route absorption of endotoxin,J Jap Sur Soc,1987,88:327. [14]Dunn DL.Gram-negative bacterial sipsis and spsis sgndrome.Surg Clin North Am,1994,74:621. [15]Hugkes CL,Gaber LW,Kotb M,et al.Indution of acute pancreatitis in germ free rats:Evidence of a primarg rote for tumor necrosis facton alpha,Surgerg,1995,117:201. [16]杨镇.有关外科感染值得深入研究的几个问题.中华实验外科,1997,14:321-322. [17]Yoshifumi K,Toorn S,Akihiko S,et al.Therole nitric oxide in mouse cenulein-induced pancreaiti S with and without lippolysaccharide pretreatment pancrease,1996,12:68. [18]Konturek SJ,Bilski J,Konturek PK,et al.Role of endogenons nitric oxide in the control of canine pancreatic exocrine secretion in pigs,Am J physid,1994,266:206. [19]张忠涛.王宇.谷氨酰胺抗感染及氧化损伤作用机理研究进展.中国临床营养杂志,1994,2(3):127. [20]Trvis S,Menzies I.Intestinal permeability:fanctional assessment and sihnificance[J],clin sci,1992,82:411. [21]黎介寿,李爱华,陈刚,等.严重腹腔感染病人的血清白蛋白与支链氨基酸的变化.解放军医学杂志,1982,7:86. [22]Kung SP.Serun albumin concentration as a prognostic indi cator yor acute surgical patients [J].Chung Hua I Hsuen Tsa child(Taipei),1999,(2):61. [23]Guthrie RD,Hincs C,Vse of intravenous albumin in the criticag,all patient[J].Am J Gastroenterol,1991,86:255. [24]Rothschild MA,Oratz M,Schreiber SS,Serum albumin[J].Hepat obgg,1988,8:385. [25]Cerra FB,Hgpermetabolism,organ failure and metabolic support,Surgery,1987,101:11. [26]刘缓缓.白求恩医科大学学报1991,17:365. [27]杨世杰.白求恩医科大学学报.1991,17:20. 28.夏奕明.硒的研究进展概况.中华医学杂志.1993,73(11):694. [29]张忠涛,王宇.谷氨酰胺抗感染及氧化损伤作用机理研究进展.中国临床营养杂志,1994,2(3):127. [30]Kaplan O,Kaplan D,Cafif E,et al.Effects of delayed administration of Qctretide in acute experimental pancreatitis J sarg Res,1996;62:109. [31]邱海波,等.全身炎症反应综合症与多器官功能障碍综合症的临床研究.中华外科杂志,1997;35:402. [32]Christensen H, Oxlund H, Laurberg S. Growth hormone increases the bursting strengty of colonec anasto-moses:an experimental study in the rat[J]. Int J Colorectal Dis, 1990,5:130~134. [33]Christensen H, Flyvbijerg A. Dose-dependent stimulatory effect of human growth hormone on the strength and collagen depositio of colonic anastomoses in the rat[J]. Acta Endocrinoloica, 1992,126:438~443. [34]Christensen H, Oxlund. Growth hormone increases the collagendeposition rate and breaking strength of left colonic anastomoses in rats[J]. Surgery, 1994,116:550~556. [35]Vara-Thorbeck R,Guerreo JA,Rosell J,et al,Exogenous growth hormone effects on the catabolic response to surgically produced acute stress and on prstoperative immune fanction World J Surg,1993;17:530. [36]Kotacin P.Structure,evolution,expression and regulation of insulinlike growth factor 1 and 2[J].Growth Factor,1991,5:3～18. [37]Wojnar MM,Fou J,Frost RA,et al,Alteration in the insulin-like growth factor system in trauma patients.Am J Physicl,1995,268:970-977. [38]Ross R,Mieel T,Frecman E,et al Critically ill patients have high basal growth hormone levels with attenunted oscillatory activity associated with low levels of insulin-like growth factor-1,Clin Eudocrinol,1991,35:47-54. [39]Junasinski CV,Vary TC,Insulin lide growth factor I accelerates protein shnthesis in skeletal muscle duming sepsis,Am J phgsive,1995;269:977. [40]Word He,Proteid and energg metabolism with biosynthetic human growth hormone after gastrointestinal surgery,Am surg,1987;206:56. [41]Dudrcck.Management of the short bowel syndrome,Surg Clin North Am,1991;71:625. [42]Dowling RH,Faller R,Ulshen MH,et al,Small and large kowel Mrna in the intestinal adaption of growth hormonl in transgenic mice,Gut,1991;32:A 1208. [43]Wright NA,Pike C,Elia G,Induction of a novel epidermal growth factor secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastro in testinal stem cells,Nature,1990;343:82. [44]顾军,黎介寿,李维勤,等.重组生长激素对严重感染后蛋白质代谢影响的实验研究.中华外科杂志.1997;76:104. [45]Donaghy A,Ross R,wicks C,et al Growth hormone therapy in Patients with cirnhosis;A pilo study of officacy and sofely,Gastaoenterology,1997;113:1617. [46]Manson JM,Smith RJ,Wilmore DW,Growth Normone stimulates protein symthesis during hypocaloric porenterd nutrition [J],Ann Surg,1989,208(2):137. [47]Warp MC,Naniday D sim AJ,Protein and energy metabolosm with biosynthetic human growth hormonl after Gastrointestinal Surgery [J],Ann Surg,1987,206(1):56. [48]程邦昌,陈克能,梅强,等.食管癌患者外周T淋巴细胞恶群,肿瘤坏死因子的改变及相关因素研究[J].中华实验外科杂志.1998,5(8):226. A部分综述 生长激素在外科的应用进展 生长激素（GH）是垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，由191个氨基酸残基组成，具有高度的种属特异性。最初获得的GH制剂主要从牛垂体中提取，也可通过另外途径得到少量人的生长激素，并作为激素替代疗法用于治疗儿童GH缺乏性侏儒症，同时对其代谢研究表明，GH有节氮效应。1985年，重组人生长激素（rhGH）合成成功并正式获准在临床使用以来，其促进生长，尤其是促进合成代谢的作用越来越受到重视，由于rhGH的安全性和易获得性，其在临床应用的适应症不断扩大。外科病人处于手术、创伤、感染等应激状态时，常需解决营养、伤口愈合、高分解代谢下蛋白质合成受抑和过度的炎性反应等问题，常规的营养支持不能解决这些问题，人们试图通过代谢支持、代谢调理来改变这种异常的代谢状态，降低分解，促进合成，从而减轻损伤，有利于机体修复。 1 作用机制 目前认为rhGH对促进生长发育、物质代谢和调节机体免疫有重要作用。GH的绝大部分作用是通过胰岛素样生长因子（IGF）介导。IGF是一种受GH调节的单链多肽，包括IGF－1、IGF－2等，GH大多数效应是由IGF－1介导。很多组织都能合成、分泌IGF，血液中的IGF－1主要来源于肝。IGF的合成释放由GH刺激引起，通过内分泌、旁分泌和自分泌作用于细胞。IGF－1在血循环中半衰期短，主要以与IGF结合蛋白（IGFBPs）结合的形式存在。迄今为止，共发现六种IGFBPs，它们既是IGF－1的载体蛋白，又是IGF－1重要的调控因素，其中IGFBP－1是封闭因子，IGFBP－3是激活因子。近年来，对GH./IGF/IGFBPs轴系统的研究越来越深入。 Wojnar等[1]研究了外科ICU中创伤病人GH－IGF轴的改变，对照组为禁食18h的健康志愿者，结果发现创伤病人GH水平在第1天比对照组升高了25倍，最后一天仍大于5倍左右，在整个ICU期间循环IGF－1浓度降低50%~60%，IGFBP－3下降55%~75%，IGFBP－1在此期间升高3倍以上。Lang等[2]在健康志愿者身上研究注射大肠杆菌内毒素（LPS）后GH－IGFs的急性改变，静脉注射LPS后连续收集5h血标本，结果注射LPS后GH浓度出现显著而短暂的升高，总IGF－1浓度显著降低。IGFBP－1在注射后2h升高5倍以上，以后逐渐降至基础值，而IGFBP－3水平在监测期间无明显改变。 Thissen等[3]在鼠肝细胞培养中研究IL－1、IL－6、TNF－α对肝IGF－1mRNA的表达的影响，结果发现这些细胞因子显著抑制肝IGF－1mRNA的表达，提示创伤感染后循环IGF－1下降可能是肝细胞水平的细胞因子直接作用造成。Hermansson等[4]在9例择期手术病人研究骨骼肌GH受体mRNA的表达，发现在手术后3天时GHR－mRNA表达显著下降，伴随着骨骼肌内谷氨酰胺（Gln）的流失，结果提示：术后蛋白质的分解代谢部分可能由于GHR基因表达下降而导致对GH不敏感造成的。Petersen等[5]研究认为，GH－IGFs轴密切调节病人代谢状态，而且GH与IGF－1联用效果更好的原因之一，可能是rhGH刺激IGFBP－3的合成，从而延长了IGF－1的半衰期。这些对GH/IGF/IGFPBs轴系统的研究提示，应激后病人蛋白质代谢的改变可能与该轴的改变相关，并为应用GH或其中介物IGF－1、IGFBP－3以促进蛋合成提供了理论依据。 GH使用过程中，常伴有胰岛素升高，在应激状时，胰岛素的糖代谢受限，并不影响其促进合成的作用，因此，在蛋白合成上可能有协同作用。Wolf等[6]报道了GH与胰岛素联合应用促蛋白合成作用较单用效果更好。GH还可能减轻糖皮质激素的蛋白分解作用。GH促进脂肪分解、氧化可能是GH的直接作用，因为IGF－1在脂肪细胞表面无受体表达，且IGF与胰岛素一样有抗脂解作用。另外，GH作为胰岛素的营养剂和拮抗剂，能增加肝和肌肉糖原贮备，促进糖原异生，升高血糖和致糖尿病的作用（diabetogenic effect）[7],rhGH的致糖尿病的可能性目前仍是临床一个难题，特别在严重应激时可出现不可控制的高血糖症。 2 促进蛋白质合成 机体丢失整体蛋白的20%即可引起生理功能的显著下降，标准的营养支持增加体脂和细胞外水的蓄积，而对蛋白质的增加很有限。Hill等研究认为，机体丢失总体蛋白的30%以上，标准营养支持才出现净蛋白质合成。营养支持的目的应是维持与改善机体器官、细胞的功能与代谢，促进病人康复，而不是以保持甚至增加病人的体重为目的。要做到这一点并不容易。许多学者是研究解决营养不良及创伤应激后分解代谢导致的机体蛋白质丢失问题，近年来利用rhGH强大的合成代谢作用，在临床应用中取得了良好的效果。 GH与低蛋白血症 Byrne等[8]首次研究GH对一组病情平稳，接受PN和（或）EN的营养不良病人蛋白质合成及机体组成的影响，结果发现，GH组获得了正氮平衡。在机体组成上，GH组瘦组织群（LBM）的增加为对照组的2倍，而且以蛋白质部分的显著增加为特点，伴有总体水（TBW）的增加，但细胞内水（ICW）和细胞外水（ECW）比例不变；对照组瘦组织群（LBM）的增加以ECW不成比例地增加为特点，ICW轻度减少，蛋白质基本不变。两组对底物的氧化也有显著差异，对照组呼吸商（RQ）＝1.17±0.5，表明过多的热量转化为脂肪贮存；GH组RQ＝0.94±0.02，血游离脂肪酸的浓度及IGF－1比对照组明显升高，表明GH可通过动员体内或营养液内脂肪氧化供能，而有利于蛋白质合成、贮存，这也就是GH的促脂肪分解作用（Lipolytic effect）。 Gatzen等[9]研究认为，GH可能有稳定细胞膜的作用，减少了严重疾病后机体内水的异常分布，阻止ECW的增加，保存ICW，这可能是通过加强细胞结构和功能性蛋白质的合成或改变细胞膜泵的能量机制，另外GH刺激胰岛素分泌，减少肌细胞内Gln的释放，二者对稳定细胞膜均有协同作用。慢性营养不良和长期分解代谢疾病，会导致体脂丢失和瘦组织成分的改变，表现为细胞的蛋白质和其支持成分ICW减少而ECW增加，GH可稳定细胞膜、保存细胞内水，也即保存了富含蛋白的、有代谢活性的体细胞总体。 近年来，有研究在感染HIV者应用rhGH后对蛋白代谢的影响[10]，结果发现：GH的促进蛋白合成作用与病情显著相关，仅HIV阳性组，蛋白合成率上升11%，而AIDS组不论是否伴有体重丢失，蛋白合成率下降42%。提示在疾病的终末阶段，GH对肌肉蛋白质的合成反应受抑。 GH与创伤 轻度创伤时，蛋白质分解率变化不大，合成率下降；中重度创伤时，体内蛋白质转换率加强，蛋白质合成和分解速度均加快，但分解代谢占优势，导致净蛋白丢失，负氮平衡。肝糖异生加快，血糖升高，脂肪持续动员和利用并成为主要的供能物质，静息能量消耗（REE）增加肝利用氨基酸的能力下降，大量由骨骼肌分解而来的氨基酸（主要是丙氨酸和Gln）转而合成急性相蛋白，用来维持酸碱平衡和支持免疫细胞及损伤的修复，而血浆转运蛋白如白蛋白和转铁蛋白合成下降。这一伤后早期的代谢改变，是机体延缓病情的一种适应性功能，由一系列神经内分泌因素调节，应激激素和炎性介质、细胞因子的大量释放，是在创伤和脓毒症时蛋白质代谢的潜在调节者，短期内的蛋白质分解加速，对维持血糖水平、合成急性相蛋白有益，但持续过久，会导致严重的代谢紊乱和内稳态失衡[11]。 严重疾病时给予外源性营养物质的作用目前仍是一个主要的研究领域。在这种高分解代谢下如何提供适当的、最佳的营养供给十分重要，过度营养和营养不足一样有害。1987年，Gerra首先提出代谢支持（metabolic support）的概念，主要是改变了所供给的营养素的量和比例，其目的是保护和支持器官的结构和功能，防止底物限制性代谢，减少碳水化合物所产生CO2减轻肺的负荷。临床应用发现，单纯的代谢支持仅有限地影响体细胞总体的丢失，即可阻止蛋白降解，而不能刺激蛋白合成，因此，需要进一步研究如何调控分解代谢或促进合成代谢。1988年，Shaw提出代谢调理（metabolic intervention）的概念。当前，除研究肠道和肠道外营养的辅助治疗外，还加具有合成作用的刺激因子，以减少肌肉总体的分解。已发现在急性病的初期，生长激素是增加的，可能通过巨噬细胞释放自由基的刺激而产生。最近，亦有报道创伤病人生长激素水平下降[12]，提示生长激素相对缺乏；有可能解释相关的重症病人较早地出现显著的低白蛋白血症，因此，补充GH可能有益。目前，GH已应用于临床作为重症病人营养支持的辅助治疗，在促进机体蛋白质合成上取得了良好的临床效果。 R.Vara-Thorbeck等[13]将180例择期胆囊切除术后的病人分为两组：对照组仅给予低热量肠外营养，治疗组加用rhGH(8U/d)，结果发现GH组在术后24h以后即达正氮平衡，术后5天时，白蛋白、总蛋白、急性相蛋白没有明显下降，血浆GH、IGF－1、胰岛素水平显著升高，而对照组白蛋白、总蛋白、胰岛素水平下降，GH、IGF－1水平没有明显改变。在另一组试验中，作者选择38例胃肠道手术的病人，对照组给予TPN（1.7BEE），治疗组加用rhGH（4U/d），得到类似结果，表明GH有促进蛋白质合成的作用。 Mjaaland等[14]将20例择期腹部手术的病人随机分为对照组和GH组（24U/d），术前两组前臂肌肉氨基酸流出无明显差异，术后第2、第4天，GH组前臂Gln、3－MH、总氨基酸和非必需氨基酸流出均较对照组减少，尿3－MH排出量也显著减少。由于3－MH在禁食时主要由肌肉分解产生，在体内不参加蛋白再循环，故可反映肌肉分解的程度。这说明rhGH除促进蛋白合成以外，同时也具有减轻蛋白分解的作用。 Peterson等[15]用静脉恒速输入18N－甘氨酸（glycine,Gly）的方法对20例严重创伤病人的蛋白动力学研究发现，治疗组用GH0.15mg/(kg·d)，7天后，氮平衡为－41±18mg N/(kg·d)，较对照组（－121±18mg N/kg·d -1）明显改善。与健康正常值相比，创伤后血浆GH、IGF－1水平显著下降，对照组单用TPN7天后GH、IGF分别提高了193%和86%，而加用GH组则分别提高了212%、736%。蛋白动力学研究发现，创伤后蛋白质分解率、合成率分别比正常人高36%、26%，处于负氮平衡，用静脉营养后两组蛋白降解率分别降低28%、31%，没有显著差异。由此可见，GH组氮平衡的改善是并不主要由于蛋白降解减少引起，而是以促进蛋白质合成为主。严重创伤或脓毒症时，肌肉分解累及隔肌是引起重症病人脱离呼吸机困难的原因之一。Knox等[16]将GH用于术后呼吸衰竭的病人，结果提高了呼吸肌力量，使ICU中不能脱机者脱机。 Roth等[17]观察了rhGH对14例多发伤病人创伤早期氮代谢的影响，治疗组（GH0.2U/kg·d-1）7天后血浆GH、IGF－1、IGFBP－3、Ins均显著升高，但两组BUN、血氨基酸、Alb水平无统计学差异，治疗组氮平衡无改善。结果表明，在分解代谢的高峰期内给予GH并不能减轻氮丢失的继续加重，也不能促进肝蛋白的合成。机制可能在IGF－1水平，包括产生IGF抑制因子、IGF受体减少及受体后缺陷。Hiesmayr等[18]在5例ICU病人中研究外源给予rhGH的药动力学，发现rhGH的清除与正常志愿者无差异，说明重度创伤病人早期对GH治疗的不应性并非由药动力学改变所致。由此可见，在营养不良和轻至中等度创伤应激时，GH有一致的节氮作用。GH改变了基础代谢的代谢途径，在外源性、内源性营养底物之间产生了新的平衡，这单靠肠外营养本身是达不到的，因此，GH对应激后病人是有利的。在应用过程中，均伴有IGF－1升高，同时也观察到胰岛素和血糖水平显著升高。但在严重应激早期对GH治疗反应减弱，除与创伤程度和剂量有关外，可能还存在IGF－1受体水平及受体后缺陷。 GH与脓毒症 与创伤相比，脓毒症病人应激程度更高，代谢紊乱更加明显。在这种感染不能控制的病人肌肉分解程度更加严重，白蛋白降低明显。有研究认为，感染后内毒素的吸收，刺激肝非实质细胞如肝巨噬细胞（Kupffer细胞），产生TNF、IL－1、IL－6等细胞因子，抑制白蛋白mRNA的表达，可能是产生低白蛋白血症的重要原因，而应用GH对低白蛋白血症有明显的防治作用[19]。 Bettand等[20]严格选择8例行PN的持续脓毒症状态的病人，接受两种低剂量（0.03或0.06mg/kg·d -1）rhGH治疗1周。治疗前后相比：GH、IGF－1显著升高，氮平衡改善，除GH浓度以高剂量组升高明显外，一般短期的持续几天的分解代谢病人，仅给予适当的营养支持即可顺利渡过临床恢复期；而较长时间持续数周的高分解代谢病人，即使已给予营养支持，仍需要寻找辅助治疗方法，以阻止或恢复丢失的瘦组织总体。作者采用比文献报道的常用剂量（0.06~0.15mg/kg·d -1）小的剂量用于重症病人，取得了同样的节氮效果，但使用前后脓毒症评分并无改变。可见GH用于脓毒症的病人，虽然有节氮效应，但并不能改变临床结局。 正常人GH的分泌是脉冲式的或称量子释放，一次脉冲分泌可急剧地刺激蛋白合成达数小时。每一次分泌很短暂，并且通常随后即出现一个数小时的不应期。了解创伤病人GH分泌的模式无疑对指导何时给予GH以达到其最佳效能有重要意义。重度创伤病人下丘脑－垂体生长激素轴受抑，Melarvie等[21]研究在严重创伤病人中GH的分泌特性，结果发现，创伤病人24h平均GH浓度较正常人低，脉冲式分泌特性依然存在，但次数减少，而且白天、夜间GH平均浓度及峰值相近，存在于正常人中的夜间分泌占优势的特征消失。结果提示急性损伤病人何时给予不影响GH发挥其最佳疗效，但在ICU病房中为了治疗的便利，多倾向于早晨给药。在文献报道中，单次给予GH的时间一般为早上，在GHD病人GH替代治疗以晚间给予疗效好，这是模拟正常人夜间分泌占优势的结果，所以有作者在重症病人也倾向于晚间给药。 GH短期内应用于分解代谢病人往往发现血糖升高，应激状态下病人本身已存在高血糖和胰岛素抵抗，而应用GH后这一代谢紊乱更加明显。Jeevanandam等[22]将20例多发伤病人随机分为两组。对照组（C组）给予TPN，1周后血糖、胰岛素无明显改变；治疗组（H组）用rhGH(0.15mg/kg·d　-1)后血糖、胰岛素均较C组明显升高。同位素标记糖动力学显示，行TPN前，两组糖出现率、清除率、再循环均无显著差异，行TPN7天后，C组糖清除率提高31%，而H组没有改变。两组在糖氧化及再循环、抑制肝糖异生、提高CO2排出量上均无差别，说明GH治疗后存在糖转运障碍。结果表明，TPN期间加用rhGH产生的高血糖并非由于肝糖异生加强或糖氧化缺陷，相反肝糖异生是受抑制的，非氧化处置缺陷和糖转运至组织细胞的能力受损可能是产生高血糖的原因。 综上所述，在严重应激的早期，考虑到对GH治疗的不应性与高血糖代谢，给予GH以求提高蛋白质合成或组织愈合并不恰当。Kupfer等[23]研究GH联合IGF－1应用于分解代谢的病人，发现二者对蛋白质合成代谢有相加作用，GH引起高血糖的效应可抵消IGF－1引起的低血糖不良反应，提示二者合用在分解代谢疾病中前景更好。 3 促进创伤愈合 创伤愈合是外科中古老而基本的问题之一，多种因素影响愈合过程。正常创伤愈合和组织修复过程是受到特殊刺激后释放出的一系列化学物质的控制。这些化学物质称之为生长因子，具有局部和全身性的作用，而且在细胞水平发挥作用。在实验研究的基础上，生长因子已用于临床加速组织修复的创面愈合。由于生长因子价格昂贵，目前临床应用的目标主要针对不易愈合的慢性伤口、大面积烧伤和愈合失败可能导致严重并发症的病人。 GH与烧伤 在大面积烧伤病人，暴露的创面带来高代谢状态，而且外界的病原菌容易进入体内，感染及死亡率显著升高。Herndon等的rhGH加速大面积烧伤病人供皮区愈合的系列研究，为临床在烧伤病人应用rhGH提供了依据。 1990年，作者[24]在平均烧伤面积达体表面积60%的儿童中，使用rhGH后供皮区的愈合时间缩短了25%。1995年，Herndon等[25]进一步研究了rhGH促进供皮区愈合的机制。作者选择10例烧伤面积＞40%的病人，6例病人用rhGH，4例作对照，结果GH组供皮区愈合时间比对照组缩短了2天，IGF－1升高3倍，表皮形成的新基底层更宽广，层粘蛋白、Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原及角质蛋白－14，均较对照组显著升高。推测GH可能直接作用于皮肤中的GH受体（多分布在真皮的成纤维细胞中），也可能通过刺激肝生成IGF－1释放入血和通过旁分泌、自分泌机制在创伤局部产生IGF－1，从而刺激角质形成细胞及成纤维细胞分裂，分泌表皮、真皮连接所需蛋白，加速了创面愈合。 大面积烧伤病人的主要矛盾是暴露的创面不能及时闭合，严重烧伤的现代治疗采用多种综合治疗措施，生长激素的应用是重要的进展之一，它除了对逆转烧伤后超高代谢，保存机体蛋白有利外，还能加速创面愈合，提高生存率。Knox等[26]对69例（1989~1993年）大面积烧伤病人回顾性分析，评价GH治疗的安全性和有效性，结果发现，应用GH者实际死亡率为41%，显著低于文献报道的70%，且无严重不良反应。 GH对肠吻合口的作用 大手术、创伤、严重疾病等带来的体重丢失和负氮平衡，使术后并发症增加。尽管一再提高手术技巧，但吻合口漏仍是目前术后一个主要并发症。完整肠壁和吻合口的强度主要取决于粘膜下层中丰富的胶原纤维，它形成肠壁的骨架。胶原的含量与吻合口强度呈正相关。术后2~3天吻合口强度依赖于缝线缝于原已存在的胶原纤维上，新形成的胶原用于修复吻合口，使之恢复原有的强度。由此可见，术后2~7天吻合口强度最弱，是吻合口漏发生的高峰期。 1990年，Christensen等[27]用2.0mg/kg rhGH证实可增加大鼠结肠吻合口的愈合强度。1992年，作者研究了不同剂量 rhGH(0.125、0.5、2.0、8.0mg/kg)对肠吻合口强度的影响[28]。治疗从术前4天到术后4天，结果GH组体重、吻合口抗张强度、胶原沉积、血IGF-1水平均比对照组(等渗盐水)升高、且呈剂量依赖性。但0.125mg组因为接近生理剂量，仅能维持正常的生长发育和IGF-1水平，对增加体重没有效果。 1994年，Christensen等[29]进一步研究rhGH促进结肠吻合口愈合的机制。GH治疗组从术前7天到术后4天、术时开始到术后4天和仅术前7天术后改为NS三种。结果表明，GH对吻合口愈合的作用是通过刺激吻合口的胶原合成率来达到的。从术前开始给予GH比从术时开始者有更高的抗张强度和胶原含量，但GH必须在伤口愈合的过程中也给予时才有作用。仅术前给予GH虽可提高整肠壁的胶原合成率，但吻合口缝线与肠壁结合力(suture-binding capacity)并没有提高。 1995年，作者[30]用扫描电镜观察了GH对吻合愈合的影响，结果术后4天时，正常愈合的吻合口充满疏松、杂乱的胶原原纤维，术后第6天时，经重新排列后形成胶原纤维。而GH组在术后4天时吻合口有致密的、更有序的胶原原纤维和尚不成熟的胶原纤维，术后第6天即可观察到丰富的新形成的胶原纤维。结果提示，GH似乎能刺激吻合口胶原原纤维结构使之有序化，以更早地形成胶原纤维。 4 抗炎症作用 外科严重感染是危重病人死亡的一个主要原因。尽管目前重症监护手段、抗生素、营养支持已有了很大的发展，但近20年来外科严重感染的死亡率并未见明显下降，促使人们进一步探索与感染有关的病理生理学改变。现在，已认识到严重感染的危害并非是病原微生物或其毒素的直接作用，而是感染诱发的一系列神经、内分泌反应及众多的炎性介质释放，造成机体炎性过度反应，继而引起多器官功能障碍综合征(MODS)。1991年提出的SIRS(systemic inflammatory response syndrome)的概念，不仅感染可以引起，任何严重的创伤、烧伤、胰腺炎等都可引起SIRS。可见SIRS可以反映这类事件的共同病理生理改变，因而在治疗上，打断这一过度炎性反应的任何一个环节都有可能避免SIRS持续过久后而走向MODS。近年来，GH应用于严重创伤、烧伤、脓毒症病人取得了较好的临床效果，除促进蛋白质合成、加速创伤组织修复外，可能在阻止这一共同的病理生理变化上亦有作用。 维护肠粘膜屏障 近十年来，肠道在严重损伤后的中心地位越来越受到重视。大量研究表明，严重应激反应后，由于肠粘膜缺血、缺氧及炎性介质的损伤，导致肠粘膜屏障破坏，肠道菌群失调及机体免疫功能下降，肠道内细菌、内毒素易位，继而激发体内单核巨噬细胞等产生更多的炎性介质，成为触发、延长或加重高代谢反应的基础。维护肠粘膜屏障显然是阻止肠源性高代谢反应的重要措施。近年来研究表明，GH对胃肠道有重要的营养作用，并可能主要通过肠细胞的增殖、修复来维持正常的肠粘膜屏障功能。 Unnberg等[31]在创伤动物模型中研究外源Gln与GH对胃肠道摄取Gln的作用，结果发现，单用Gln、GH均能增加胃肠道摄取Gln，且二者联用时作用相加。单用外源性Gln，选择性增加胃肠道摄取Gln而不影响其他器官，而GH虽减少全身释放Gln，但能通过减少肝摄取以更增加胃肠道摄取Gln，而且预先给予GH比术时开始给予促进胃肠道摄取Gln作用更强。 Chen等[32]在炎症性肠病动物模型上观察了外源性GH和肠外营养联合应用的治疗作用。结果表明，加用GH不仅改善氮平衡，保存胃肠道蛋白，而且肠粘膜DNA含量较单纯TPN为高，肠道渗透性降低，促进了溃疡的愈合。在GH组，肝及肠粘膜IGF-1mRNA表达显著增加，推测GH促进溃疡愈合的机制可能通过IGF-1中介来促进肠粘膜上皮细胞的生长、修复。 Hang等[33]在50%烧伤大鼠模型上对IGF-1减少肠道粘膜萎缩和细菌易位进行了研究，结果表明，IGF-1不仅刺激整个机体蛋白质合成，还可刺激肠道粘膜生长和保护肠粘膜屏障的作用(肠系膜淋巴结细菌易位发生率从89%降至30%)。IGF-1不仅刺激肠道粘膜生长繁殖，维护由肠道粘膜上皮层及附着于其表面的粘液层构成的肠道机械屏障功能，从而减少肠道细菌易位。 参与免疫调控 R. vara-Thorbeck等[34]在180例胆囊切除后的病人应用GH 5天后，血浆IgG、IgM、IgA水平保持不变中，皮肤迟发超敏反应试验中正常反应者升高，而对照组显著下降。对照组感染发生率为16例，而治疗组为3例。有研究表明，IGF受体在免疫组织细胞上的广泛表达，这时IGF调控其免疫功能的物质基础。GH可能主要通过刺激IGF以自分泌、旁分泌方式调节免疫细胞生长、分化，包括促进骨髓细胞成熟，刺激呑噬细胞移动，触发呑噬细胞产生过氧离子和细胞因子，增强调理素的活化，从而提高宿主免疫力[35]。 Peterson等[36]在行TPN的严重创伤病人，应用rhGH对肝急性相蛋白(APP，acutephase protein)产生的作用中发现，伤后免疫抑制表现之一是IgG、IgM、IgA水平下降，在单独应用TPN时可全部恢复正常，而rhGH组仅IgA恢复正常，结果仅部分恢复主防御能力。这一结论仍需进一步证实。 5 不良反应 rhGH应用于临床安全有效，作为替代治疗用于成人生长激素缺乏(GHD)的主要问题是产生糖尿病，是否会诱发肿瘤尚不确定。但因GH有明确的促有丝分裂的作用，临床一般不用于肿瘤病人。rhGH作为危重病人营养支持的辅助治疗是营养代谢领域的研究方向之一，目前的文献报道中不良反应发生率较少，主要有高血糖、体液潴留、周围性水肿等。 Knox等[37]回顾分析了100例ICU的重症病人，结果发现，危重病人长期接受rhGH治疗可能导致严重的高鈣血症，尤其是在肾功能有改变者，机制可能包括增加肠道吸收与减少肾排出。Nishizawa等[38]在正常兔模型上研究GH对肝能量代谢的影响，结果发现，动物血酮体比率(AKBR)随着剂量的增加(50、100、200mg/kg)逐渐下降，认为GH对肝可能有损害作用，实验中所用剂量很大，在临床使用中未见有损害肝功能的报道。 参考文献 [1]wojnar MM, Fan J, Frost RA et al. Alterations in the insulin-like growth factor system in trauma patients[J]. Am J Physiol. 1995,268:R970~7. [2]Lang CH, Pollard V, Fan J et al. Acute alterations in growth hormone-insulin-like growth factor axis in humans injected with endotoxin[J]. Am J Physiol 1997,273:R371~8. [3]Thissen JP, Verniers J. Inhibition by interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha of the insulin-like growth factorl messenger ribonucleic acid response to growth hormone in rat hepatocyte primary culture[J]. Endocrinology, 1997,138:1078~1084. [4]Hermansson M, Wickelgren RB, Hammarqvist F et.al. Measurement of human growth hormone receptor messenger ribonucleic acid by a quantitative polymerase chain reaction-based assay:demonstration of reduced expression after elective surgery[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1997,82:421~428. [5]Petersen SR,Jeevanandarm M,Holaday NJ.Adjuvant recombinant human growth hormone stimulates insulin-like growth factor binding protein-3 secretion in critically ill trauma patients[J]. J Trauma, 1995,39:295~300. [6]Wolf Rf,Heslin MJ,Newman E.Growth hormone and insuline combine to improve whole-body and skeletal muscle protein kinetics[J]. Surgery, 1992,112:284~292. [7]Moller N, Jorgensen JO,Moller J et al. Metabolic effects of growth hormone in humans[J].Metabolism, 1995,44(suppl 4):33~36. [8]Byrne TA, Morrissey TB, Gatzen C et al. Anabolic therapy with growth hormone accelerates protein gain in surgical patients reqiring nutritional rehabilitation [J].Ann Surg, 1993,218:400~418. [9]Gatzen C, Scheltinga M, Tomas D et al, Growth hormone attenuates the abnormal distribution of body water in critically ill surgical patients[J]. Surgery, 1992,112:181~187. [10]McNurlan MA, Garlick PJ, Steigbigel BT et al.Responsiveness of muscle protein synthesis to growth hormone administration in HIV-infected individuals declines with severity of disease[J]. J Clin Invest, 1997,100:2125~2132. [11]Michie HR. Metabolism of sepsis and multiple organ failure[J]. World J Surg, 1996,20:460~464. [12]Huang TS, Wang YH, Lien IN. Suppression of the hypothalamus-pituitary somatotrope axis in men with spinal cord injuries[J]. Metabolism, 1995,44:1116~1120. [13]Vara Thorbeck R, Ruiz Requena E, Guerrero Fernandez JA. Effects of humangrowth hormone on the catabolic state after surgical trauma[J]. Horm,Res, 1996,45:55~60. [14]Mjaaland M, Unneberg K, Larsson J et al, Growth hormone after abdominal surgery attenuated forearm glutamine, 3-methylhistidine and total amino acid efflux in patients receiving total parenteral nutrition[J].Ann surg, 1993,217;413~422. [15]Petersen SR, Holaday NJ, Jeevanandam M. Enhancement of protein synthesis efficiency in parenteral fed trauma victims by adjuvant recombinant human growth hormone for postoperative respisatory failure[J]. Am J Surg, 1996,171:576~580. [16]Knox Jb, Wilmore DW, Demling Rh, et al, Use of growth hormone for postoperative respisatory failure[J]. Am J Surg, 1996,171:576~580. [17]Roth E, Valentini L, Semsroth M et al. Resistance of nitrogen metabolism to growth hormone treatment in the early phase after injuryof patients with multiple injuries with multiple injuries[J]. J Trauma, 1995,38:136~141. [18]Hiesmayr M, Holzenbein T, Valentini L et al, Human growth hormone kinetics in critically ill patients[J]. Wien Klin Wochenschr, 1996,108:352~357. [19]李维勤，黎介寿，顾军等. 腹腔感染后低白蛋白血症的分子机理和防治实验研究[J].中华外科杂志，1997,35：100. [20]Bettany GEA, C. Camacho-hubener, Obeid O.Metabolic effects ofadjuvant recombinant human growth hormone in patiens with continuing sepsis receiving parenteral nutrition[J]. JEPN, 1998 22:199~205. [21]Melarvie S, Jeevanandam M, Holaday NJ et al. Pulsatile nature of growth hormone levels in critically illtrauma victims [see comments][J]. Surgery, 1995,117:402~408.. [22]Jeevanandam M, Holaday NJ, Petersen SR. Adjuvant recombinant human growth hormone does not augment endogenous glucose production in total parenteral nutrition-fed multiple trauma patients[J]. Metabolism, 1996,45:450~456. [23]Kupfer SR, Underwood LE, Bazter RC. Enhancement of the anabolic effects of growth hormone hormone and insuline-like growth facto or 1 by use of both agents simultaneously[J].J Clin Invent, 1993,91:391~396. [24]Herndon DN, Barrow RE, Kunkel KR et al. Effect of recombinant human growth hormone on donor site healing in severly burned children[J]. Ann Surgery, 1990,211:424~431. [25]Herndon DN, Hawkins HK, Nguyen TT et al. Characterization of growth hormone enhanced donor site healing in ptients with large cutaneous burns[J]. Ann Surg,1995,221:649~656. [26]Knox J, Demling R, Wilmore D et al. Increased survival after major thermal injury:the effect of growth hormone therapy in adults[J]. J Trauma, 1995,39:56~530. [27]Christensen H, Oxlund H, Laurberg S. Growth hormone increases the bursting strengty of colonec anasto-moses:an experimental study in the rat[J]. Int J Colorectal Dis, 1990,5:130~134. [28]Christensen H, Flyvbijerg A. Dose-dependent stimulatory effect of human growth hormone on the strength and collagen depositio of colonic anastomoses in the rat[J]. Acta Endocrinoloica, 1992,126:438~443. [29]Christensen H, Oxlund. Growth hormone increases the collagendeposition rate and breaking strength of left colonic anastomoses in rats[J]. Surgery, 1994,116:550~556. [30]Christensen H, Chemnitz J, Christensen BC et al. Collagen structural organization of healing colonic anastomoses and the effect of growth homone treatment[J]. Dis Colon Rectum, 1995 38:1200~1205. [31]Unneberg K, Mjaaland M, Balteskard L et al.Both growth hormone and exognous glutamine increase gastrointesal glutamine uptake intrauma[J]. Ann Surg, 1997,225:97~102. [32]Chen K, Nezu R, Inoue M et al. Beneficial effects of growth hormone combined with parenteral nutrition in the management of inflammatory bowel disease:an experimental study[J]. Surgery, 1997,121:212~218. [33]Huang KF, Chung DH, Herndon DN. Insulin like growth facor 1(IGF-1) reduces gut artropht and bacterial translocation after severe burninjury[J]. Arch Surg, 1993,128:47~54. [34]Vara Thorbeck R, Ruiz Requena E, Guerrero Fernaudez JA. Effects of human growth hormone on the catabolic state after surgical trauma[J]. Horm Res, 1996,45:55~60. [35]Saito H. Inoue T, Fukatsu K et al. Growth hormone and the immune response to bacterial infection[J]. Horm Res, 1996,45:50~54. [36]Petersen SR, Jeevanandam M, Shahbazian Lm et al. Reprioritization of live protein synthesis resulting from recombinant human growth hormone supplementation in parenterally fed trauma petients: the effect of growth hormone on the acute-phase response[J]. J Trauma, 1997,42:987~995. [37]Knox JB, Demling RH, Wilmore DW et al. Hypercal-cemia assoiated with the use of human growth hormone in an adult surgical intensive care unit[J]. Arch Surg, 1995,130:442~445. [38]Nishizawa F,Takada Y,Yamaguchi T et al.Effect of growth hormone on hepatic energy metaolism in normal rabbit liver[J].Eur Surg Res,1995,27:93~99. B部分　谷氨酰胺对感染时机体营养代谢的作用 The effect of glutamine on nutritional metabolism in septic host 博 士 后 姓 名 张　平 流动站（一级学科）名称 吉林大学基础医学 专　业（二级学科）名称 病理学与病理生理学 研究工作起始日期1999年5月 研究工作完成日期2001年4月 吉 林 大 学（长 春） 2001年4月 B部分：谷氨酰胺对感染时机体营养代谢的作用 （中文摘要） 目的：为了探讨谷氨酰胺对感染机体营养代谢的调节作用，作者通过动物实验，探讨了谷氨酰胺对全胃肠外营养时肠粘膜保护，免疫力提高的作用机制。 方法：将48只雄性Wistar大鼠随机分成3组：饲料组（n=16）喂普通饲料；TPN组（n=16）接受传统肠外营养，TPN＋GLn组（n=16）接受　GLn强化的肠外营养。各组大鼠摸拟右颈内静脉插管。采用盲肠结扎加穿孔方法建立腹腔感染模型。观察8天后，通过实验室检测及光镜、电镜方法，对血、小肠组织进行相关的测定及形态学观察。 结果：TPN＋GLn组及TPN两组大鼠在第4天时，小肠绒毛高度，隐窝深度、粘膜厚度，全层厚度，粘膜上皮微绒毛高度基本相近，无显著性差异（P＞0.05），而免疫指标TPN＋GLn组明显高于TPN组，有显著差异，第8天时TPN＋GLn组的指标全部高于TPN组，差异显著(P<0.05)。 结论：GLn对感染时大鼠的肠粘膜有保护作用，可以提高机体的免疫力，长期全胃肠外营养应用GLn效果更为显著。 关键词：谷氨酰胺　外科营养　感染 The effect of glutamine on nutritional metabolism in septic host Objective:To study the effect of glutamine on nutritional metabolism in septic host and the mechanism of protecting intestinal mucosa and improving bodies＇immunity by glutamine when TPN was applied. Method:48 mole wistar rats were randomly allocated in 3 groups:16 rats in forage group were fed by common forage;16 rats in TPN group were given traditional parenteral nutoition;16 rats in TPN+Gln group were given parenteral nutrition plus Gln,All rats in each group were given,intubation in right internal jugular vein,Models with intraabdominal infection were established by ligating and perforating appendix,Light microscope,electronic microscope and laboratory examinations were applied to detect blood and small intestine after 8 days. Result:Small intestinal villous height (VH) intestinal erypt depth,mucosal thickness (MT),inteslinal wall thickness and microvillous height in both TPN+Gln group and TPN group were closely the same and no such difference existed (P>0.05).Immune factors in TPN+Gln group were significantly higher than those in TPN group and such difference,existed,All the parameters.TPN+Gln group were higher than those in TPN group after 8 days and significant difference existed (P<0.05). Conclusion:Gln protected intestinal mucosa of rats with infections and improved their immunity,The effect was much more significant when TPN was applied permanently. Key words:Glutamine Surgical nutrition Infection. B部分　　谷氨酰胺对感染时机体营养代谢的作用 前　　　言 随着营养药理学的研究进展，人们发现有些非必需氨基酸虽然能在体内合成，但在某些应激生理状态或疾病情况下，其需要量大大增加，合成速率降低，容量发生缺乏，导致蛋白质合成减少，影响机体正常功能。如果得不到及时的补充与纠正，最终会因机体自我消蚀而难于存活，所以人们把这些氨基酸称之为条件必需氨基酸。目前公认条件必需氨基酸有牛磺酸、精氨酸和谷氨酰胺（Glutamine,Gln）。近十余年来，谷氨酰胺的营养作用及药理学作用的研究尤其引人瞩目。 近年来大量的研究已证明，谷氨酰胺（Gln）具有保护肠粘膜屏障功能。在传统全胃肠外营养（TPN）支持过程中及其它分解代谢状态下常会造成谷氨酰胺的缺乏[1]，而由此导致的肠道屏障结构的损害已被Baskervill等人所证实[2]，经谷氨酰胺强化的肠外营养液对肠道屏障功能的改进具有极其重要的作用[3-6]，谷氨酰胺作为一种条件必需氨基酸[7]，其保护肠粘膜的作用机制主要是：1、谷氨酰胺是肠粘膜细胞和其它快速增殖细胞（如免疫细胞等）的燃料，谷氨酰胺通过为这些细胞提供能源及核酸生成所必需的氮源保证肠道屏障结构的完整性。2、氧自由基在组织损伤的成因中起重要作用。还原型谷胱甘肽（GSH）是保护组织免受氧自由基损伤的主要抗氧化剂。而谷氨酰胺参与还原型谷胱甘肽的合成，它通过保持组织中的还原型谷胱甘肽的储备，间接抵抗氧自由基对生物膜的损伤[8]。 谷氨酰胺具有着重要的生理作用。但本身缺点限制了它在临床上的应用。谷氨酰胺易水解，特别是在加热后，容易形成毒性物质焦谷氨酸和氨；谷氨酰胺在水中的溶解度差（20℃时，1升水中只能溶解35g谷氨酰胺）。很难达到有效血药浓度。经化学合成的谷氨酰胺二肽，由克服了谷氨酰胺的本身缺点，溶解度好（为谷氨酰胺的16倍）稳定性好，配成静脉营养液后加热消毒不会形成有毒物质；经静脉注射后在体内经二肽酶作用迅速分解放出谷氨酰胺，生物利用率高，没有积累作用。 谷氨酰胺二肽的合成，使谷氨酰胺的临床应用成为现实，对谷氨酰胺对机体代谢调节机制的研究也日显迫切。有关感染时的应用及免疫功能调节方面的报道国内尚未出现，本研究通过谷氨酰胺对感染时大鼠全胃肠外营养代谢的调节，探讨谷氨酰胺对胃肠外营养的肠粘膜的保护作用，对机体的免疫调节，以及长期胃肠外营养谷氨酰胺的应用时机做进一步的研究。 实验材料与实验方法 1　实验材料 1.1 主要仪器 静脉插管用硅橡胶管（上海） 铝制背扣（北京） 螺旋式不锈钢弹簧（北京） 套针式旋转器（美国） 代谢笼（长春） 静脉输液管（上海） 电子调速式微量输液泵（德国） TGL－16C台式离心机（上海） TN－100B托盘扭力天平（上海） Olympus光学显微镜（日本） DF－2型照相机（上海） 微量加样器（法国） 电热恒温水浴箱（武汉） RF－540型荧光光分光光度计（日本） 722型光栅分光光度计（上海） LKB－Ⅲ型超薄切片机（瑞典） JEM－1200EX型透射电镜（日本） Luzex－F型图像分析仪（日本） 1.2 主要试剂 力肽Alanyl－Glutamine（无锡华瑞制药有限公司SSPC） 50%Glucose（中国人民解放军9088工厂） 7%Vamin（无锡华瑞制药有限公司SSPC） 20%Intralipid（无锡华瑞制药有限公司SSPC） Soluvit（无锡华瑞制药有限公司SSPC） Vitalipid（无锡华瑞制药有限公司SSPC） 盐酸氯胺酮注射液（上海第一生化药业公司） 肝素钠注射液（山东莱阳生物化学制药厂） 亚硒酸钠（北京化工厂） HCLO4·HNO3（长春化学试剂厂） 二氨基萘（美国） 环己烷（上海第三化学试剂厂） HCL.NH3·H2O（长春化学试剂厂） 叠氮化钠磷酸缓冲液（北京化学试剂厂） 1.0mMGSH溶液（上海生物化学试剂厂） 1.25～1.50mMH2O2溶液（长春化学试剂厂） 偏磷酸沉淀液（长春化学试剂厂） 0.32MNa2HPO4溶液（长春化学试剂厂） 注：主要试剂均为分析纯试剂。 2　实验动物及动物模型制作 2.1 实验动物及分组 选择雄性Wistar大鼠48只，平均体重200±20克，由吉林大学新民校区实验动物中心提供，在实验室饲养5－7天适应环境后均获得满意生长曲线。然后随机分成三组：1、饲料组（n=16）：给予与TPN组同等热量和含氮量的标准饲料喂养。2、TPN组（n=16）：接受传统肠外营养液。3、TPN＋Gln(n=16)：接受经谷氨酰胺强化的肠外营养液（3g/100ml）。饲料组大鼠模拟右颈内静脉插管，另外两组经右颈内静脉行中心静脉插管。 2.2 动物模型制作 术前禁食一天，术前称体重，以氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉，生效后将大鼠仰卧位固定在手术台上。右颈及肩胛区剃毛，消毒局部皮肤，选择颈外侧向锁骨方向垂直切口长约1.5-2cm，切开皮肤后稍加分离皮下及筋膜即显露右颈内静脉，于静脉下方穿过二根00丝线，以备远端颈内静脉结扎，近端颈内静脉插管后固定。将右颈内静脉剪一小口，将直径0.9mm（内径0.5mm）的硅胶管顺向心方向插入上腔静脉约1.5cm，避免插入右心房，硅胶管的另一端连接充满10U/ml肝素生理盐水的1 ml注射器。结扎静脉远端，近端结扎固定导管两次。做同侧颈背部皮下隧道，于两肩胛骨间皮肤将导管引至颈背部，回血通畅后借助导管铝制背扣将导管固定在背部皮肤，导管再经套针性旋转器（可向任意方向旋转）连接静脉输液系统。控制输液速度为1 ml/100g·hour，使之恒速并保持连续性。静脉插管完毕后制作感染模型，采用盲肠结扎加穿孔方法，完成后将大鼠放入特制的代谢笼内，大鼠在持续输液状态下可在代谢笼内自由活动。注：插管固定过程中要间断使用10U/ml肝素生理盐水冲洗导管，防止导管内凝血，同时严格限制注入量和防止插管时发生气栓，以免导致肺水肿、出血倾向和动物死亡[9-11]。 2.3 TPN液的配制 在无菌层流洁净台上配制，详见A部分表1。 TPN＋Gln组每100ml含3g谷氨酰胺（力肽）。 2.4 标本的采集： 于术后第4、8天进行。将三组大鼠各8只称体重后以氯胺酮100mg/kg行腹腔注射麻醉，仰卧位固定在手术台上，剖腹后先在距Treitz韧带20cm处切取长约3cm小肠组织块，然后用经肝素化的注射器于左颈内静脉采静脉血1ml，标本采集后迅速做预处理：每只大鼠的血样存入两只抗凝瓶中（各0.5ml），分别用于测免疫球蛋白、T细胞亚群，小肠组织块沿肠系膜对侧缘纵向剖开，在冰盐水中漂洗，切取1cm和0.5cm小肠分别置入10%甲醛溶液和4℃4%戊二醛溶液中，分别用于光镜及电镜观察。 2.5 实验室指标的测定 2.5.1 lgG lgA lgE lgM采用速率散射比浊法测定。 2.5.2 采用CD系列单克隆抗体间接荧光法测定T淋巴细胞及其亚群，其中CD3＋与全部成熟T细胞（TT）反应，CD4＋和CD8＋分别识别辅助T细胞（Th）抑制性T细胞（Ts）亚群。 2.6 形态学的观察 2.6.1 光镜： 标本经10%中性福尔马林固定24小时，乙醇系列脱水，常规石腊包埋后切片，经HE染色后进行光镜形态学的观察、照相，并用Luzex－F型半自动图像分析仪（日本NIRECO公司）随机全肓测定小肠绒毛高度、隐窝深度、小肠全层及粘膜厚度。 2.6.2 电镜： 标本经4%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水,Epon812包埋，LKB－Ⅲ型超薄切片机（瑞典）切片，醋酸铀－柠檬酸铅双重染色，JEM－1200EX型透射电镜（日本电子公司）观察小肠粘膜上皮细胞微绒毛及核上区线粒体的变化及照相，并用Luzex－F型半自动图像分析仪（日本NIRECO公司）随机全盲测定小肠粘膜上皮细胞微绒毛高度。 数据处理 采用统计学方法。所有数据均以X±S表示，在计算机上利用SAS6.22软件进行方差分析和Q检验，以P＜0.05为差异显著。 3　结果 3.1体重 所有动物均存活到实验结束，各组大鼠体重都有增加（平均20g左右）经统计学分析，各组间无显著性差异。 3.2实验指标检测结果 3.2.1免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgE的变化，详见表1 各组免疫球蛋白的变化情况 表1 分组　　　　lgG(g/l) lgA(g/l) lgM(g/l) lgE(U/ml) N组　　　　 1 7.75±1.94 1.54±0.22 1.09±0.12 245±56 　4 8.28±1.56 1.61±0.13 0.97±0.14 236±49 　8 9.85±1.88 1.71±0.19 1.29±0.32 290±35 TPN＋Gln组 　1 7.25±1.81 1.52±0.21 1.07±0.11 240±51 　4 8.21±1.511) 1.60±0.121) 0.90±0.101) 232±471) 　8 9.87±1.871) 1.69±0.171) 1.27±0.211) 289±321) TPN组 　1 7.35±1.82 1.51±0.20 1.09±0.10 242±52 　4 6.56±1.56 1.53±0.18 0.72±0.12 220±41 　8 7.91±1.76 1.51±0.12 0.91±0.11 230±25 结果显示：TPN＋Gln组大鼠免疫功能较TPN组恢复快，第4天免疫球蛋白指标高于Gln组，1)P<0.05VS TPN组详见表1 3.2.2T细胞功能（CD3 CD4 CD8及CD4/CD8）的变化，详见表2 　　　　 各组T细胞亚群的变化情况　　 表2 分组　　　 CD3（%） CD4（%）　　CD8（%）　　CD4/CD8 N组　　　　 1 44.42±7.55 19.78±7.52 16.76±5.78 1.23±0.35 　4 53.35±8.32 29.78±7.52 19.48±4.35 1.52±0.35 　8 56.48±6.80 32±6.53 21.33±7.12 1.70±0.21 TPN＋Gln组 　1 42.28±7.46 19.21±7.21 17.26±5.12 1.21±0.32 　4 54.21±8.22 29.71±7.21 19.48±3.35 1.48±0.41 　8 55.47±6.79 33±6.24 21.28±7.10 1.71±0.22 TPN组 　 1 43.28±7.21 19.51±7.41 17.25±5.10 1.22±0.41 　4 46.32±7.92 20.61±6.29 12.42±2.89 1.21±0.28 　8 50.41±6.71 22±6.18 16.97±6.91 1.39±0.40 结果显示：CD3 CD4 CD8及CD4/CD8从第1天至第8天数值逐渐上升，但TPN组恢复较慢，在第4天时TPN＋Gln组同TPN组相比有显著差异(P<0.05)，详见表2 3.3小肠组织形态学观察及测定结果 3.3.1光镜： 三组大鼠小肠粘膜上皮均结构完整，无充血水肿及淋巴细胞浸润。结果显示：在1～4天时相互差别不大，没有统计学意义(P>0.05)，而在第4～8天逐渐出现差别，第8天TPN＋Gln同TPN组差别有显著性(P<0.05)，同饲料组无差别，详见表3　图B1～4 各组小肠粘膜的测量结果 表3（μm） 组别　　　绒毛高度　　粘窝深度　 粘膜厚度　　 全层厚度 N组　　　　 　 4 382±12.3 182±8.7 566±9.0 708±13.8 　 8 418±13.1 700.3±9.7 590±10.3 725±14.9 TPN＋Gln组 　 4 389±11. 183±8.6 568±9.4 700±13.2 　 8 421±12.1 203.2±9.8 601±11.2 730±15.1 TPN组 　 4 381±11.7 180±8.3 560±8.9 710±13.4 　 8 390±12.3 189±8.5 570±9.1 700±12.1 3.3.2电镜观察及测值： TPN＋Gln组与TPN组相比较第4天时差别不显著P＞0.05，到第8天时，前者小肠粘膜上皮细胞微绒毛长而密集、排列整齐，线粒体数量多、结构完整、排列规律。测定微绒毛高度显示：TPN＋Gln组微绒毛高度显著大于TPN组(P<0.05)。但TPN＋Gln组与饲料组相比，二组微绒毛及线粒体各指标无显著差异(P>0.05)。详见表4　图B5～12 三组大鼠小肠粘膜上皮细胞微绒毛高度测值　表4（μm）　 组 别　　　　　　第4天　　　　　　第8天 N 1.071±0.058 1.224±0.067 TPN＋Gln 1.021±0.041 1.231±0.071 TPN 1.055±0.047 1.058±0.048 4　讨论 已有研究表明，创伤、应急等因素机体发生严重的代谢紊乱，其表现为大量分解、激素及众多炎症介质的释放所致的高代谢，此时，蛋白质的净分解大于净合成，由于胰岛素的阻抗现象，葡萄糖利用障碍，机体能量消耗有赖于内源性组织蛋白质的大量分解，以满足异常增高的能量需要。同时蛋白质迅速分解，提供每天需要的某些氨，以作为大量急性相蛋白质合成基质，使白蛋白短期急剧下降，肌蛋白大量丢失、尿氮排出增多及负氮平衡，最后导致器官功能障碍。因此，寻找某种药物来改变机体对营养支持的反应，降低蛋白质分解，促进蛋白质合成，这对感染病人显得更为重要。 Gln是血和肌肉等组织含有丰富的氨基酸，它对各器官和组织细胞具有重要而独特的功能[12]：①Gln是高效能的能量物质，1g分子Gln完全氧化能产生30g分子ATP，是肠粘膜及各种快速生长细胞的主要呼吸燃料；②Gln是组织间氮前体的转运物质，是蛋白质合成代谢的重要调节因子，可促进细胞内蛋白质等生物大分子合成，减少骨骼肌中蛋白质的分解；③Gln是嘌呤、嘧啶、氨基酸、蛋白质、核酸等生物分子合成的重要前题，对改善机体免疫功能也有重要作用；④Gln作为氨的裁体直接参与尿氨的生成和碳酸氢根的生成和吸收，以维持酸碱平衡；⑤Gln作为谷氨酸的前体，参与保持谷胱甘肽的储备，从而保护细胞免受氧自由基造成损伤。 本研究结果显示：TPN＋Gln组在小肠绒毛高度、隐窝深度、小肠全层及粘膜厚度的测量值逐渐高于TPN组，在第8天时两组之间有统计学意义。在透射电镜观察下TPN＋Gln组小肠上皮细胞微绒毛高度及上皮细胞　微结构均优于TPN组，而TPN＋Gln组与饲料组相比，各项指标均无显著差异，其结果充分证明了Gln水平与小肠粘膜结构完整性呈正相关，Gln确能防止小肠粘膜萎缩，防止小肠上皮细胞微绒毛的萎缩以及细胞内线粒体的变性和减少。 本实验我们还注意到，TPN＋Gln组和TPN组的小肠粘膜结构的改变是逐渐变化的，第4天两组差别不大，第8天时差别显著。有动物实验已证明，短期TPN状态下肌肉和肺脏能释放大量Gln经血流到达小肠，被其优先利用，此时小肠能够维持接近正常水平的Gln浓度，肠道维持完整性所需的能源并未明显缺乏。故对于接受短期TPN的病人，给予外源性Gln不仅效果不确切，也造成了不必要的浪费，特别是肝、肾功能不全和某些中枢神经功能不全（如肝性脑病等）的病人通常对氨基酸耐受性差，这些脏器的功能不全可能损害病人有效利用Gln的能力并潜伏着导致血液和组织中Gln终末产物（如氨等）浓度增高的危险，此类病人给予富含Gln的营养液可能出现氮质血症，并导致体氨基酸的失衡[13]。 广义的肠道屏障的概念除应包括构成肠道的主要结构外，还应包括肠道及其相关组织表现出的肠道屏障功能，这主要是指局部淋巴结及其发挥的免疫功能，即免疫屏障。而大量的Gln与免疫的研究表明，Gln可选择性地调节各种功能淋巴结亚群的产生，增加淋巴结细胞的反应性[14]。已知免疫功能的稳定有赖于辅助性T细胞(Th)和抑制性T细胞(Ts)两亚群间的平衡，Th/Ts二者之间的平衡是通过CD4+/CD8+比值来反映的。本组资料显示，感染后CD3+　 CD4+均有明显下降，CD4+/CD8+比值也明显下降。在第4天TPN＋Gln免疫功能恢复，同TPN组有显著差异，而同饲料组接近无差异，提示Gln对T细胞亚群功能和数量的改善有着积极的作用。在一定范围内，对体液免疫的非特异性免疫均有不同程度的促进作用，从而激活免疫反应，并增强免疫监视系统的功能。 随着TPN时间的延长，肌肉和肺脏Gln的释放量的减少，终将出现病人小肠组织中Gln水平的显著低下，故此时Gln可能仍需外源性补充。我们认为Gln能提高感染时的免疫水平，对长期TPN过程肠粘膜的保护效果更佳，但长期TPN时Gln应用的具体时机还需进一步探讨。 5　结论 GLn对感染时大鼠的肠粘膜有保护作用，可以提高机体的免疫力，长期全胃肠外营养应用GLn效果更为显著。 参考文献 [1]Jiang ZM,Zhang FS,Zhu Y,et al.Evaluation of paenteral nutrition in postoperative patient.Surg Gyn Obst,1988,166:115. [2]Baskerville A,Hambleton P,Bengough JE.Pathologic feature of glutamine toxicity.Br J Exp Pathol,1980,61:132. [3]Jiang ZM,Wang LJ,Qi Y,et al.Comparison of parenteral nutrition Supplement with L-glutamine or glutamine dipeptides.JPEN,1992,17:134. [4]Hwang TL,et al.Preservation of small bowel mucosa with glutamine-enriched parenteral nutrition.Surg Forum,1986,37:56. [5]Jawbs DO,et al.Combined effects of glutamine and epidermal growth factor on the rat intestine.Surgery,1988,104(2):358. [6]O＇Dweyer ST,et al.Maintenance of small bowel mucosa with glutamine-enriched parenteral nutrition.J Parenter Enteral Nutr,1989,13(6):579. [7]Lacey JM,Wilmore DW.Is glutamine a conditionally essent amino acid?Nutr Rev,1990,48(8):297. [8]张忠涛.王宇.谷氨酰胺抗感染及氧化损伤作用机理研究进展.中国临床营养杂志,1994,2(3):127. [9]Steiger E,et al.A techniqe for Long-term intravenous feeding in unrestrained rats.Surg,1982,104(3):330. [10]花天放,等.大鼠长期静脉喂养的输液技术.上海医学,1984,7(2):116. [11]张泽斌,等.大鼠完全胃肠外营养的动物模型.中华实验外科杂志,1996,7(2):92. [12]于彬.神奇的谷氨酰胺[J].药物与人.1994,10(1～2):42. [13]蒋朱明,等.肠道营养支持.临床营养培训教材,1999. B部分综述 谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺二肽的代谢 及在肠外营养液中应用的进展 谷氨酰胺（Glutamine,Gln）是机体内最丰富的非必需氨基酸。因测定Gln技术较复杂，研究不易深入，直至50年代Eangle等发现Gln是培养细胞分化增殖所必需的营养物质，才提出Gln可能具有重要而独特的代谢特性的概念[1.2]。近几年来，在Gln的代谢、在肠外营养中的应用、对免疫功能的调节作用等方面都有了深入的研究。 1　Gln的代谢 1．1 Gln的生理作用[2.3] Gln的相对分子质量为147.1，除牛磺酸外，是血液游离氨基酸池中含量最高的氨基酸，约占体内游离氨基酸池的60%，正常血浆浓度为0.5~0.9mmol/L；在骨骼肌内游离氨基酸池中含量也最为丰富（约占60%以上），比血液中高30倍。Gln的作用主要在以下几方面：①载体功能，Gln化学结构上有2个氨基α氨基和酰氨基，是各器官间氮流动的重要载体。②是蛋白质、氨基酸、嘌呤、嘧啶、核酸等生物分子合成的重要前体，是体内许多生化代谢途径的中间体，是肾产氨的最重要前体，对酸碱平衡的调节起着十分重要的作用。③Gln是快速生长和分化细胞如血管内皮细胞、淋巴细胞、肠粘膜上皮细胞、肿瘤细胞等主要能源物质。1mol/L Gln直接三羧酸循环可产生30mol/L的ATP。④Gln是一种生糖氨基酸，是肝糖原异生的重要底物；是肝捕捉氨的主要载体和终末产物，对于Gln诸多的功能，有人对将Gln归于非必需氨基酸的分类提出质疑，认为它是一种条件必需氨基酸[2]，尤其是在严重创伤及大手术后。 1.2 Gln在肠道的代谢　小肠是肠道Gln代谢的主要部位，肠道粘膜上皮细胞代谢Gln不仅为肠粘膜上皮细胞提供能源，而且为肝的糖原异生、尿素合成提供底物，Gln在肠粘膜上皮细胞内的代谢主要是靠线粒体膜上的磷依赖性Gln酶的分解作用。此酶位于线粒体内膜，受饮食、糖皮质激素和胰高血糖素调节[4]。进入肠上皮细胞的Gln在线粒体内经三羧酸循环转化为酮戊二酸，氧化生成ATP，肠上皮细胞从肠腔食糜中摄入大量葡萄糖而很少被代谢，于是葡萄糖释放入血维持血糖浓度，供其他组织（如脑等）利用。肠道Gln代谢产物氨和丙氨酸可直接进入体循环之前即被肝细胞清除。 1.3病理状态下Gln的代谢 Gln在恶性肿瘤的代谢　Gln是肿瘤生长所必需的氨基酸，是其重要氮源和能源物质，并优先为肿瘤细胞所摄取。肿瘤细胞内Gln酶与核酸代谢有关的酶异常活跃，肿瘤细胞消耗大量Gln。现已发现肿瘤生长与血Gln浓度呈负相关[5]。肿瘤细胞具有很高的Gln酶解率，即Gln的不完全氧化，产物有谷氨酸、乳酸、脯氨酸、氨等，为肿瘤合成大分子物质提供氮、碳和能量。 Gln在创伤和应急状态下的代谢　手术和创伤后，骨骼肌蛋白分解加速，释放大量氨基酸，其中60%为Gln和丙氨酸，但血循环中Gln浓度仍很低，表明内脏细胞摄取Gln增强。最新研究表明，对损伤的代谢反应特征性的是负氮平衡和典型的细胞外、细胞内自由氨基酸交换模式的改变[6]。进一步排空细胞内的Gln是典型的代谢过程衰竭状态表现。Gln排空可导致严重的合并症，像感染、切口愈合差、免疫降低、肠的通透性增加，最终导致多脏器功能衰竭。提高氮潴留和保持细胞内的Gln浓度和肌蛋白的合成是同时发生的[7.8]。 2　Gln对肠道免疫功能的影响 2.1 肠道的免疫功能　肠粘膜屏障具有独特的立体防御功能[9]，包括①肠腔内S-IgA能选择性包被细菌。细菌粘附肠壁是细菌移位的前提，粘附的细菌能抵抗粘液流和肠蠕动的清除作用，并有可能同时穿透受损的粘膜屏障，经淋巴或门静脉系统进入肠系膜淋巴结、脏器和血液循环，S-IgA能选择性包被革兰阴性菌，形成抗原抗体复合物，刺激肠道粘液分泌，并加速粘液层流动，有效地防止细菌粘附，从而构成肠粘膜免疫屏障[10]；②浆细胞分泌的S-IgA固有层（LP）即已包绕入侵细菌，并向上皮基底层移动和分泌成分（SC）段结合，行壁内细菌清除并转移至肠腔，从而构成立体防御系统[11]，肠壁固有层T淋巴细胞、上皮内淋巴细胞（IEL）以及合成与分泌的IL－2、IL－4、IL－5、IL－6，TNF－β，γ-干扰素等构成固有层中IgA阳性及细胞微环境，在终末分化和分泌中起着重要调节作用[12]，而且IEL启动持续的细胞溶解活性，发挥清除损伤上皮、促进上皮再生、保持粘膜结构完整的功能。 2.2　Gln对T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的影响　Gln对于多种快速分裂细胞的增生是必需的，包括单核细胞。一个完整的T细胞反应在防御细菌入侵宿主中扮演了一个重要角色。T细胞的DNA合成，在体内对菌血症的抵抗有相关的联系[13]。在体外试验，Gln是T细胞生长和功能依赖的最佳物质[14]，对Gln的依赖还出现在严重外伤病人。在这些病人中，Gln的缺乏被看成是T细胞免疫抑制的原因[15]。使用TPN的病人，尤其是在有应激反应的病人，可能有Gln的严重缺乏。单核细胞产生的亲炎性细胞因子、IL－6和TNF可增高临床病人对严重感染的易感性[16]。虽然Gln也是单核细胞代谢的一个底物[17]，但Gln对单核细胞产生TNF和IL－6的影响还不清楚。巨噬细胞是终末型分化细胞，几乎无再分化和增殖能力。然而大量研究证实，巨噬细胞可利用和消耗大量Gln，换句话说，巨噬细胞所摄取和利用的Gln不是为合成生物大分子提供氮、碳前体，而是用来提供氧化燃料[18]。 3　Gln在肠外营养支持中的应用 3.1 Gln对肠道细菌移位的作用　很早就发现，长期应用全肠外营养（TPN）会引起肠粘膜萎缩。动物实验发现，采用补充Gln的TPN可增加空肠粘膜重量，增加DNA含量，减少小肠粘膜绒毛萎缩[19]。标准TPN溶液可以影响肠道免疫功能，增加肠道细菌移位，进入循环系统和引起肠源性感染，尤其在免疫抑制病人。含Gln的肠外营养液有保护小肠免疫组织的能力，并为生产S－IgA的浆细胞提供能源和前质。同给予标准TPN的病人相比较，在补充Gln的TPN支持的术后病人，减少了肌组织分解代谢且使氮平衡改善，并减少了肠粘膜萎缩和肠道免疫功能障碍。 3.2　Gln在创伤及大手术后的应用　在创伤及腹部大手术后的病人，Gln在血浆和自由氨基酸池的含量下降和这些病人的免疫抑制有关[20.21]。补充Gln已显示出多种有益的效果，如阻止肠粘膜的萎缩、保护肠道的屏障功能。Gln在淋巴细胞代谢中充当重要角色[22.23]。在这些情况下提供Gln可以增强免疫系统的免疫功能[24]。 4　丙氨酰－谷氨酰胺二肽的应用 早在1914年，Thierfelder和Sherwin发现人体内存在谷氨酰胺（glutamine,Gln），并具有代谢功能。近年来的研究表明[25-27]，Gln是一种条件必需氨基酸，它具有维持体内酸碱平衡、保持小肠粘膜正常的结构和功能、维持组织中抗氧化剂的贮备、增强免疫反应等作用。因而Gln在营养支持中的应用受到人们的普遍重视。但由于Gln水溶解度低，在水溶液中不稳定，在加热灭菌的条件下会生成有毒的焦谷氯酸和氨[28]，所以商品复方氨基酸溶液中都不含Gln，使Gln在肠外营养的应用中受到很大限制。目前，肠外营养中应用Gln有三种方法：①现配现用，把Gln晶体加到氨基酸溶液中，然后过滤除菌，在8h内输完。这一过程必须严格无菌操作；而且工作繁琐费力，适用范围有限。②Gln前体的应用，如鸟氨酸α-酮戊二酸(OKG)，在体内代谢生成G ln。Luc Cynober综述了OKG在肠外营养中的作用，确信OKG可能成为一种有效的临床营养剂，但OKG分子对代谢各种介导作用依赖于服用方式和机体状态[29]。③应用含Gln的二肽，目前，含Gln二肽有两种：丙氨酰谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine,Ala-Gln）和甘氨酰谷氨酰胺（Gly-Gln）。1919年，Their-felder和Von Cramm曾推测并证明二肽比Gln单体稳定。Stehle等[30]在水相中用N-酸酐（NCA）法合成了高产量的丙氨酰谷氨酰胺。该二肽水溶解度高（568g/L）,是游离Gln(3g/L)的20倍，不同的pH值下加热灭菌（120C，0.5h），则无焦谷氨酸和氨产生[30.31]。 5　Ala-Gln的体内代谢 大量的实验证明[32]，Ala-Gln进入机体后，被许多器官组织中的二肽酶分解为其强盛氨基酸－丙氨酸（Ala）和Gln半衰期很短，约为3.8min，仅有微量的二肽（摄入量的1%~2%）从尿中排出，说明Ala-Gln可被有效地利用，避免了因　Ala-Gln累积可能产生的损害[33.34]。 5.1参与Ala-Gln清除的器官　肝、血浆、肾、肠、骨骼肌等均有分解Ala-Gln的二肽酶[35-39]。应用器官物质代谢平衡方法分析[33.40.41]，发现给予Ala-Gln后，肝、肾、肠和骨骼肌的二肽都处于正平衡状态，说明它们都参与了Ala-Gln的清除。值得一提的是，大脑不参与Ala-Gln的清除，给予Ala-Gln后，脑脊液中检测不到Ala-Gln二肽[42]，而脑主要以糖为能源。Hubl等[43]研究人肝、肾对Gln二肽利用的重要性时发现，肝功能衰竭病人，不影响血中二肽的清除，而肾功能衰竭病人则明显减慢二肽的清除，从而推断出肾是清除血内二肽最重要的器官，大部分二肽被肾分解为Ala和Gln，再不断释放入血，被其他器官利用，而尿中仅能检测到极微量的二肽（摄入量1%~2%）和Gln[40.41]。 5.2 血中Ala-Gln清除的机制 5.2.1　在血液循环中水解　尽管血液中存在着水解二肽的酶，然而它的作用并非主要的[36]。 5.2.2被血管内皮细胞结合酶水解　Lochs等[35]在肝血窦内皮细上发现了水解二肽的酶，骨骼肌的血管内皮细胞上也发现了同样的二肽酶[39]。 5.2.3进入细胞后被水解　Daniel等[37]发现肾小管上皮细胞刷状缘上存在着二肽转运系统，可将二肽以完整形式转运到细胞内，并鉴定出两类不同的转运系统：一类是高亲和力、低饱和性；另一类低亲和力、高饱和性。它们对跨膜pH梯度和膜电位的反应不同：高亲和系统受膜电位的影响在没有pH梯度时不能工作；而低亲和系统则不受这两种因素的制约。Minami等[38]在人小肠粘膜刷状缘上也发现了依赖pH值的二肽转运系统，但它们并不参与血中的二肽转运，而对小肠吸收肠内二肽发挥重要作用。肝和骨骼肌内没有该二肽转运系统。 5.3 Ala-Gln肠内清除　Ala-Gln肠内应用，小肠粘膜吸收Gln二肽有两种途径：①Ala-Gln在细胞外水解释出Gln、肠粘膜再吸收；②Ala-Gln二肽被转运到肠上皮细胞内，经胞质内二肽酶水解而释放出Gln。实验证明，肠道内H+浓度梯度促进二肽的转运[44]；而游离Gln的转运则依靠Na+浓度梯度[45]。有实验发现，如果没有H+浓度梯度，以二肽形式转运入肠上皮细胞胞质内是不可能的。此时，二肽在细胞外被二肽酶水解并释放出Gln，Na+浓度梯度介导游离Gln吸收入肠上皮细胞内。Gln细胞外水解是由膜二肽酶催化的。Minami等研究人类小肠如何从Gln二肽获得Gln时发现，Gln的吸收不被Na+浓度降低需而抑制，反而被H+浓度降低所抑制，从而得出人小肠粘膜吸收Gln主要是以二肽形式而不是游离Gln形式的结论。有人证明，肠粘膜上皮细胞胞质和胞膜上均有二肽酶，但胞质中活性高于胞膜上[47]。 6　Ala-Gln在肠外营养中的应用 6.1　Ala-Gln与蛋白合成、氮平衡　Ala和Gln在组织间整个氨基酸流动中起关键作用。游离氨基酸从肌肉和肠道释放而被肝吸收，Ala和Gln由肌肉释放约占整个α-氨基酸的50%以上。创伤、疾病、择期手术、感染等应激状态下细胞内Gln下降，且不能被目前的营养支持所扭转。这是因为应激时，糖皮质激素分泌增加，促进了游离氨基酸的释放。有人证实，在地塞米松能使犬后腿肌肉内Ala和Gln释放增加近4倍[48]，许多实验证明，使用糖皮质激素，谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）mRNA的表达和酶活性的增加与肌肉萎缩程度呈正相关[49]。Gln被认为是身体底物贮蓄池的重要成分，其浓度变化调节着蛋白质合成[50]。补充足够Gln能减少肌肉中Gln的损耗，减少氮的丢失[34]。Hickson等研究证实，添加Ala-Gln的全胄肠外营养能有效地防止糖皮质激素引起的大鼠肌萎缩，并使被糖皮质激素上调的GS活性得到了下调，但并不能增加肌肉内Gln浓度[51]。 Ala-Gln二肽能否改善应激状态下的机体氮平衡，尚无定论。Spaeth等人缎带大鼠行TPN7天，一组TPN液含有Ala-Gln，另一组以Ala代替Ala-Gln，两组等氮等热量，发现两组氮平衡相似[52]。Tamada等[53]将大鼠行大部分（85%）肠管切除，作等氮等热量TPN，添加Ala-Gln（2g/100ml）的TPN组与传统TPN组相比，氮平衡无显著差异。Okuma等研究了23只败血症大鼠，发现添加Ala-Gln的TPN组与传统TPN组大鼠氮平衡无显著差异[54]。但戚勇等人作雄性Wister大鼠TPN时发现，添加Ala-Gln的TPN组累积氮平衡明显优于传统TPN组[55]。曲军等人测定了腹部外科病人氮平衡，添加Ala-Gln的TPN组术后第4天转为正氮平衡，对照组则仍处于负氮平衡。说明Ala-Gln的应用能改善腹部外科手术病人的负氮平衡状态[56]。Naka等证实，添加Ala-Gln的TPN组，身体蛋白质更新率和器官部分蛋白合成率均明显高于支链氨基酸组[57]。 6.2 Ala-Gln与肠道完整性　正常胃肠道粘膜有一定的屏障功能，能有效地阻挡肠道中500多种浓度高达10/g肠道寄生菌及其内部颗粒、内毒素样大分子物质等移位。正常水化道对细菌的屏障作用依赖于特殊因子（IgA抗体）和非特殊因子（胃酸性环境、胃肠道上皮细胞间紧密连接、粘膜层分泌的粘液、消化酶和正常细菌群）。 长期TPN对肠道的不良影响包括：①肠粘膜萎缩：通过活检观察发现粘膜绒毛高度、粘膜厚度、陷窝深度等退变；还可通过粘膜内蛋白、DNA、RNA、麦芽糖酶、蔗糖酶、二胺氧化酶的活性等来检测。②肠粘膜渗透性增加：长期TPN后从肠道近端到远端，可见小肠上皮细胞间连接降低，连接复合体允许细菌或毒素进入。肠道渗透性可借惰性物质渗透肠道粘膜的情况来评估，如乳果糖、FITC-右旋糖酐7000、Cr-EDTA、乙二醇、甘露醇等。③肠道免疫功能障碍：肠粘膜免疫系统具有独特的立体防御功能[58]，一方面肠腔内分泌性IgA包被细菌，有效地阻止细菌粘附[59]；另一方面肠固有层（LP）聚合IgA,LP淋巴细胞和上皮内淋巴细胞在肠立体防御和免疫调节中起重要作用[58.60]。可通过肠腔细菌IgA包被率、肠固有层T淋巴细胞和浆细胞分布、肠上皮内T淋巴细胞分布等来评估。④肠道细菌移位：指肠道内细菌通过肠粘膜侵入到肠道以外的部位：指肠道内细菌通过肠粘膜侵入到肠道以外的部位，如肠系膜淋巴结、肝、脾、血以至全身的过程。广义地讲，除细菌外还有其内部颗粒和内毒素样大分子物质的移位。可通过取肠系膜淋巴结和肠外其他器官组织作细菌培养、内毒素测定等来检测。TPN的不利影响在于缺乏肠道食物刺激和肠道条件氨基酸Gln[62]。Gln是肠道粘膜细胞增生和分化的重要能源物质，许多实验证明，TPN添加Gln能逆转肠粘膜萎缩、增强肠道免疫功能、防止肠道细菌移位[63]。 作为Gln的稳定形式的Ala-Gln二肽用于TPN液中能否获得同样效果？Spaeth等人曾报道，大鼠接受TPN时，使用Ala-Gln既不能提高肠道屏障功能，也不能改善粘膜的免疫功能。他们发现Ala-Gln组大鼠和等氮等热量的Ala组之间，盲肠内细菌生长、肠粘膜萎缩程度、粘膜蛋白含量、小肠粘膜IgA含量，并无显著差异[52]。这可能是由于在应激状态下肠上皮细胞不能有交往地从血液中吸取、利用Gln的缘故[64]。但多数实验证明，TPN添加Ala-Gln能达到营养肠道、防止肠粘膜萎缩、增强肠道免疫功能、防止肠道细菌移位的作用。Tamada等人[53]将大鼠行大部分肠管（近端或远端的85%）切除作等氮等热量TPN，添加Ala-Gln（2g/100ml）的TPN组与常规TPN组相比，残存小肠粘膜湿重和蛋白、RNA、DNA、麦芽糖酶、蔗糖酶含量以及二胺氧化酶活性、绒毛高度明显改善，而且得出一个有趣的结论：近端小肠的Gln消耗利用比远端多，这归因于利用Gln的谷氨酰胺酶活性近端小肠比远端强。Okuma等人[54]对23只败血症大鼠作TPN，二肽组（含2%Ala-Gln）和对照组相比，小肠粘膜重量、绒毛高度明显改善，但血浆中内毒素浓度、肠系膜淋巴结细菌移位并无显著差异。因为细菌移位不仅与肠道结构破坏有关，还与宿主的免疫有关[65]。Tremel等人[66]对12例重症病人作等氮（0.26g/kg）等热量（155kJ/kg）TPN9天后发现，Ala-Gln组（包含Ala-Gln300mg/kg·d）与常规TPN组相比，能较好地防止肠粘膜萎缩和小肠渗透性增加。白满喜等人对20只5-FU作用的大鼠作TPN7天，添加3%Ala-Gln的TPN组与传统TPN组相比，5-FU作用后72h 小肠对乳果糖、甘露醇的渗透性、肠系膜淋巴结细菌培养、血浆的Gln浓度、空肠粘膜结构上，前者均优于后者[67]。白满喜等人还对20只大鼠60%小肠切除后TPN，添加3%Ala-Gln的TPN组与传统TPN组相比，肠系膜淋巴结细菌培养、空肠粘膜厚度、绒毛高度上明显优于传统组[68]。谢建新等人在研究Gln二肽肠外营养对大鼠移植小肠的作用时发现，二肽组大鼠移植小肠的粘膜厚度、陷窝深度、绒毛高度和表面积均明显大于常规组，超微结构观察、组织化学显示，二肽组明显优于常规组[69]。王涛等人利用大鼠作低血容量性休克模型，分为肠内营养（TEN）组、传统TPN组和添加Ala-Gln的TPN组三组，各组肠固有层CD3+ CD4+ CD8+ T淋巴细胞和分泌IgA的浆细胞明显减少，肠腔细菌sIgA包被率下降，肠道微生态发生紊乱，细菌粘附率和移位率上升，血浆LPS水平升高，TEN组最轻，Ala-Gln组与TEN组接近，传统TPN组最重，说明传统TPN能削弱粘膜免疫功能，加重粘膜屏障损伤，而补充适量Ala-Gln能减轻这种损伤，有利于肠粘膜屏障功能的恢复[70]。 Ala-Gln维持肠道功能完整性的机制，①Ala-Gln提供了小肠吸收利用的Gln，提供了氧化利用的燃料和氮源。氮源用于合成嘧啶、嘌呤等，有助于小肠上皮细胞分裂复制。②Gln能促进某些激素的释放，如蛙皮素、神经降压素、胰高血糖素[71.72]。高血糖素能提高小肠谷氨酰胺酶的活性，从而促进Gln的消耗利用[73]。Gln还能刺激胰腺和胆汁分泌，并在小肠上皮细胞生长中起着重要作用[74]。③肠道的淋巴细胞、巨噬细胞含有丰富的谷氨酰胺酶，它们利用Gln维持其增生和发挥功能的能量来源。 6.3　Ala-Gln与机体免疫　Gln是免疫细胞增生的重要来源。Calder等人[75]发现Gln水平与机体产生的白细胞介素(IL)-2呈正相关，Gln通过刺激T细胞产生IL-2 促进T细胞增生。Ziegler[76]发现骨骼移植病人接受含Gln的TPN3~4周后，病人的总淋巴细胞数、T淋巴细胞数、CD4+和CD8+细胞数都明显增加，这表明补充Gln使免疫细胞恢复更快，而且这可能减少骨骼移植病人在院内发生感染的原因。Gln在免疫细胞代谢和功能上起到重要作用，能减轻术后病人的免疫抑制。Jacobi等人[77]对食管或胃手术病人34例术前、术后1、2、4、7天检测淋巴细胞上CD3+ CD4+ CD8+的表达以及单核细胞HLA-DR和CD14的表达，术后血浆IL-6、IL-10分析，发现Ala-Gln的使用并未明显减轻病人术后系统炎症反应，也未明显减轻免疫抑制。但国内外针对Ala-Gln的使用能否提高机体免疫功能的研究很少，有待于进一步证实。 6.4　Ala-Gln与保肝作用　Azuma等人[78]作猪肝移植时，添加Ala-Gln的TPN组与等氮等热量的传统TPN组相比，血中AST和内毒素明显降低，证明Ala-Gln有保护肝的作用。其机制可能是：①Ala具有保护肝的功能。Maezono等人[79]对D-半乳糖胺诱导的急性肝功能衰竭大鼠进行TPN后发现，大剂量Ala组有降低AST、缩短凝血酶原时间和保护肝的作用，而等剂量的Ala-Gln组因其中的Ala相对较少，保护肝的功能较弱。②Gln是肝合成谷胱甘肽的原料，于健春等人[80]已证实Gln与谷胱甘肽（GSH）具有内在相关性。增加Gln，不仅能增加细胞膜稳定性，防止细胞内、外水肿发生，更重要的是能增加肝还原型谷胱甘肽（GSH）的贮存量，减少和对抗氧自由斟对肝的损害，提高化疗后生存率。 参考文献 [1]Ardawi MS.Skeletal muscle glutamine production in thermally injured rats[J].Clin Sci,1988,74(2):165-172. [2]Lacey J,Wilmore DW,Is glutamine a conditionally essential anmino acid?Nutr Rev,1990,48:297~309. [3]Mouterde O,Claeyssens S,Chedevine A,et al,Glutamine is a good substrate for glycogen synthesis in isolated hepatocytes from 72 h-starved rats,but not from 24 h-or 48h-starved rtas[J].Biochem J,1992,15:288. [4]Souba WW,Herskowitzk,Austgen TR.Salloum therapeutic impact[J].JPEN,1990,14(5 suppl)237s. [5]吴国豪，吴肇汉.全肠外营养支持的新概念[J].中国肠内与肠外营养杂志，1997,5(4)：157-162. [6]Kinney JM,Elwyn DH.Protein metabolism and injury[J].Ann Rev Nutr,1983,3:433~466. [7]Furst P.Intracellular muscle free amino acids:their measure-ment and function[J].Proc Nutr Soc,1983,42:451~462. [8]Furst P,Stehle P.Glutamine and glutamine-containing dipeptides.In Cynober L.ed,Amino Acid Metabolism in Health and Nutritional Disease[M].Boca Raton:CRC Press,1995,373~383. [9]Ziegler TR,Smith RJ,Byrne TA,et al,Potential role of glutamine supplementation in nutrition support[J].Clin Nutr,1993,12:s82-s90/ [10]Kaztzel GS,Robinson JK,Chintalacharucvu,et al.The polymeric immunogloblin receptor(SC) mediates transport of immune complexes across epithelial cells;a local defense function for IgA[J].Proc Nati Acad Sci USA,1992,23:1. [11]Abraham SN,Beacrey CH.Host defences against adhesion of bacteria to mucosal surfaces[J].Adr Host Det Mech,1985,4:63. [12]王　涛,黎沾良. 创伤后营养与肠免疫功能[J].国外医学(外科学分册)，1994,21:266. [13]Moss NM,Gough DB,Jordan AL,et al,Temporal correlation of impaired immune response after theromal injury with susceptibility to infection in a murine model[J].Surgery,1988,104:882-887. [14]Ardawl MSM..Glutamine and glucose metabolism in human peripheral lymphocytes[J].Metabolism,1988,37:99-103. [15]Parry-Billings M,Evans J,Calder PC,et al,Does glutamine contribute to immunosuppression after major burns[J]?Lancet,1990,1:523-525. [16]O Riordain MG,Collins KH,Pilz M,et al.Modulation of macrophage hyperactivity improves survival in burn sepsis model[J].Arch Surg.1992,127:152-158. [17]Newsholme P,Newsholme EA,Rates of utilization of glucose,glutamine and oleate and formation of end products by mouse pentoneal macrophages in culture[J].Biochem J, 1989,261:211-218. [18]屠伟峰,黎介寿.谷氨酰胺的研究现状[J],肠外与肠内营养,1997,4(1)：41-50. [19]Klimberg Vs,Nwokedi E,Hutchins LF,Glutamine[J].JPEN,1992,16(bsuppl):83s-87s. [20]Fleck A.Munro HN.The detemination of organic nitrogen in biological material[J].Clin Chem Acta,1965,11:2-12. [21]Parry-Billings M,Baigrie RJ,Lamont PM,et al.Effect of major and minor surgery on plasma glutamine and cytokine levels[J].Arch Surg,1992,127:1237-1240. [22]Ardawl MSM.Glutamine and glucose metabolism in human peripheral lymphocytes[J].Metabolism,1988,37:99-103. [23]Brank,Feklw Von Hintzenstern J,et al. Metabolism of glutamine in lymphocytes[J].Metabolism 1989,38(suppl):29-33. [24]Parry-Billing M,Leighton B,Dimitriadis GD,et al,The effect of tumour bearing of skeletal muscle glutamine metabolism[J].Int J Biochem,1991,23:933-937. [25]Wilmore DW,Smith RJ,O＇Dwyer ST,et al.The gut:a central organ after surgical stress[J].Surgery,1988,104:197-203. [26]Bruke D,Alverdy JC,Aoys E,et al,Glutamine supplemented total parenteral nutrition improves gut immune function[J].Arch Surg,1989,124:1396-1399. [27]Hong RW,Rongds JD,Helton WS,et al,Glutamine preserves liver glutatione after lethal hepatic injury[J].Ann Surg,1992,215:114-119. [28]Tritsch GL,More GE,Spontaneous decomposition of glutamine in cellculture media[J].Exp Cell Res,1986,28:196. [29]Luc Cynober.鸟氨酸 α-酮戊二酸盐的基础与临床研究[J].中国临床营养杂志,1998,6(1),1-6 [30]Stehle P,Khhon B,Kubin W,et al,Synthesis and characterication of tyrosin and glutamine containing peptide[J].J Appl Biochem,1982,4:280. [31]Stehle P,Pfaender P,Furst P.Isotachophoretic analysis of asynthetic dipeptide L-alanyl-L-glutamine evidence for stability during heat sterilization[J].J Chromatogr,194,294:507. [32]Adibi SA.Experimentable basic for use of peptide as substrates for parenteral nutrition:A review[J].Metabolism,1987,36:1001. [33]Adibi SA.Intravenous use of glutamine in peptide form clinical application of old and new observations[J].Metabolism,1989,38(suppl 1),89-92. [34]Furst P,Albers S,Stehle P,et al.Availability of glutamine supplied intravenously as alanylglutamine[J].Metabolism,1989,38(supple 1),67-72. [35]Lochs H,Morse EL,Adibi SA.Mechanism of heptic assimilation of dipeptides:Transport versus hydrolysis[J].J Biol Chem,1986,261:14976. [36]Abumrad NN,Morse EL,Lochs H, et al.Possible source of glutamine for parenteral nutrition impact on glutamine metabolism[J].Am J Physio,1989,257:E228. [37]Daniel H,Morse EL,Adibi SA.The high and low affinity transport systems for dipeptide in kidney brush border memebrance respond differently to alteration in PH gradient and membrance potential[J].J Biol Chem,1991,261:19917. [38]Minami H,Morse EI,Adibi SA,Charateristics and mechanism of glutamines-dipeptide absorption in human intestine[J].Gastroenterology,1992,103:3. [39]Raghunath M,Morse EL,Adibi SA.Mechanism of clearance of dipeptides of perfused hindquarters:sarcolemmal hydrolysis of peptides[J].Am J Physiol,1990,259:E463. [40]Lochs H,Roth S.Splanchnic,renaland muscle clearance of alanylglutamine in man and organ fluxes of alanine and glutamine when infused in free and peptide form[J].Metabolism,1990,39:833. [41]Adibi SA,Lochs H,Abcimrad NN,et al.Removal of glycylglutamine from plasma by individual tissues;Mechanism and impact on amine acid fluxes in postabsorption and starvation[J].J Nutr,1993,123:325. [42]Vazquez JA,Raghnath M,Adibi SA.Uptake and hydrolysis of glycylglutamine at the blood-brain barrier[J].Metabolism,1992,41:121. [43]Hubl W,Druml W,Roth E,et al.Importance of liver and kidney for the utilization of glutamine-containing dipeptides in man[J].Metabolism,1994,43(9):1104-1107. [44]Ganapathy V,Leibach FH.Role of PH gradient and membrance potental in dipeptide transport in intestinal and renalbrush border membrance vesicles from rabbit:studies with Lcarnosin and glycyl-L-proline[J].J Biol Chem,1983,258:14189-14192. [45]Rennie MJ,Hundal HS,Babji P,et al.Characteristics of glutamine carrier in skeletal muscle have important consequences for nitrogen loss in jury,infection and chronic disease[J].Lancet,1986,2:1008-1012. [46]Minami H,Emile L,Morse EL,et al.Characteristics and mechanism of glutamine-dipeptide absorption in human intestine[J].Gastroenterology,1992,103:3-11. [47]Adibi SA,Kim YS.Peptide absorption and hydrolysis[J].Raven,1981,1073-1095. [48]Muhlbbacher F,Kapadea R,Colpoys M,et al.Effects of glucocorticoides on glutamine metabolism in skeletal muscle[J].Am J Physiol,1984,247:E75. [49]Falduto MT,Young AP,Hickson RC.Exercise inhibits glucocorticoid-induced glutamine synthetase expression in redskeletal muscles[J].Am J Physiol,1997,262(cell physiol 31):214-220. [50]Jepson MM,Bates PC,Broadbent P,et al.Relationship between glutamine concentration and protein synthesis in rat skeletal muscle[J].Am J Physiol,1988,255(Endocrinnol Metab 18):E166-172. [51]Hickson RC,Wegrzyn LE,Osborne DF,Karl-IE Alanyl-glutamine prevents muscle atrophy and glutamine synthetase induction by glucocorticoids[J].Am J Phsiol,1996,271(5ptz):R1165-72. [52]Spaeth G,Gottwald T,Haas W,et al.Glutamine peptide does not improve gut function and mucosal immunity in total parenteral nutrition[J].JPEN,1993,17:317-323. [53]Tamada H,Nezu R,Matsuo Y,et al.Alanylglutamine-en-riched total parenteral nutrition restores intestinal adaption after either proximal or distal massive resection in rats[J].JPEN,1992,16(2):110-116. [54]Dkuma T,Kaneko H,Kaichem,et al.Total parenteral nutrition supplemented with L-alanyl-L-glutamine and gut structure and protein metabolism in septic rats[J].Nutrition,1999,10(3):241-245. [55]戚 勇,朱明.氨酰胺及谷氨酰胺双肽强化的胃肠外营养液对肠粘膜形态的影响[J].中华外科杂志,1992,3(6):370-374. [56]曲 军,祝学光，顾 晋,等.腹部外科手术病人应用丙氨酰谷氨酰胺双肽的临床意义[J].中华普通外科杂志,1999,14(30):213-215. [57]Shiji Naka MD,Hideaki Saito MD,Yojiro Hashiguchi MD,et al.Alanylglutamine-enriched total parenteral nutrition improves protein metabolism more than branced chain amino acid-enriched total parenteral nutrition in protracted peritonitis[J].J Trauma,1997,42(2):183-190. [58]Kaztzel CS,Robinson JK,Chin T,et al.The polymeric immunoglobm receptor(SC) mediates transport transport of immune complexes across epithelial cell:a local defense function for IgA[J].J Pro Nait Acad Sci USA,1992,23:1. [59]Abraham SN,Beacrey CH,Host defenses against adhesion of bacteria to mucosal surfaces[J].Adv Host Det Mech,1985,4:63. [60]Barret TA,Gajewski TF,Danielpour D,et al.Difference function of intestine intraepithelial lymphocyte subsets[J].Immunol,1992,149:1124. [61]Berg RD,Garlington AW.Translocation of certain endogenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric Iymph nodes and other organs in a gnotobiotic mouse model[J].Infect Immun,1979,23:403. [62]Inoue Y,Grant JP,Snyder PJ,et al.Effect of glutamine supplemented total parenteral nutrition on recovery of small intestine after starvation atrophy[J].JPEN,1992,16:162-165. [63]Souba WW.Glutamine:a key substrate for the splanhnic bed[J].Annu Res Nutr,1991,11:283-308. [64]Didricr PS,Salloum RM,Copeland EM,et al.The early reponse of the juejumal brush border glutamine transporter to endotoxemia[J].J Surg Res,1992,52:372-377. [65]Deitch EA,Specian RD,Berg RD.Induction of early-phase tolerance to endotoxin-induced mucosal injury,xanthineoxidase activation,and bacterial translocation by pretreatment with endotoxin[J].Circ Shock,1992,36:208. [66]Tremel H,Kienle B,Sacha L,et al.Glutamine dipeptide-supplemented parenteral nutrition maintains intestinal function in the critically 3[J].Gastroenterology,1994,107:1595-1601. [67]Bai MX,Jiang ZM,Liu YW,et al.Effects of alanyl-glutamine on gut barrier function[J].Nutrition,1996,12(11~12):793-796. [68]白满喜,蒋朱明,马永贤,等.谷氨酰胺双肽对大鼠肠切除后细菌移位的影响[J].中华医学杂志，1996,76(2):116-119. [69]谢建新,左焕琛,陈丽琏,等.谷氨酰胺二肽肠外营养对大鼠移植小肠的营养作用－小肠粘膜的形态学观察[J].解剖学杂志,1997,20(2):141-146. [70]王　涛,黎沾良,王亚平,等.丙氨酰谷氨酰胺对机体创伤后肠疲乏屏障功能的保护作用[J].普外临床,1996,11(4):220-222. [71]O＇Dwyer ST,Smith RJ,Hwang TL,et al.Maintenance of small bowel mucosa with glutamine-enreched parenteral nutrition[J].JEPN,1989,13:579-585. [72]Thompson JC,Humoral control of gut function[J].Am J Surg.1991,161:6-18. [73]Geer RJ,Williams PE,Lairmore T,et al.Glucagon:an important stimulator of gut and hepatic metabolism[J].Surg Forum,1987,38:27-28. [74]Altmann GG.Influence of the bile and pancreatic secretions on the size of thje intestinal villi in the rat[J].Am J Anat,1971,132:167-178. [75]Calder PC,Newsholme EA,Glutamine promotes interleukin2 production by concanavalin astomulated lymphocytes[J].Proc Nutr Soc,1992,51:105A. [76]Zeigler TR,Bye RL,Persinger RL,et al.Glutamine-enriched parenteral nutrition increase circulating lymphocytes after bone marrow transplantation(BMT)[J].JPEN,1994,18(suppl 1):175(abstract). [77]Jacobi CA,Ordemann J,Zuckermann H,et al.The influence of alanyl-glutamine on immunologic functions and morbility in postoperative total parenteral nutrition[J].Zentralbl Chir,1999,124(3):199-205. [78]Azuma T,Gu A,Mizoe A,et al.Nutritional effects of alanylglutamine after liver transplantation in pigs[J].Transplantation aproceeding,1998,30:3705-3706. [79]Maezono K,Mawatari K,Kajiwara K,et al.Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats[J].Hepatology,1996,11:1211-1216. [80]于健春,蒋朱明,李德敏,等.谷氨酰胺双肽在肠外营养时调节谷胱甘肽代谢,保护肝脏的机制[J].中国医学科学院学报,1998,20(2):103-107. 致　　　　谢 本论文是在我尊敬的导师赵雪俭、谭毓铨教授的悉心指导下完成的，两年的学习和工作，时刻浸透着两位教授的关怀和教诲。在我博士后工作即将完成之际，谨此向我的导师表示衷心的感谢和深深的致意，你的渊博的学识、严谨的治学态度、精湛的医术、高尚的医德、忘我的敬业精神以及超然的人格魅力无不令人敬佩，也将永远激励我前进。 感谢吉林大学博士后流动站领导、老师两年来在工作、学习、生活上的关怀和帮助。 感谢基础病理生理教研室全体老师的帮助 感谢基础电镜室崔力主任及全体老师的帮助 感谢吉大一院中心实验室谭岩主任的大力帮助 感谢吉大一院普外科王有德主任、王广义主任及所剑、陈光、刘铜军副主任的工作支持，感谢王磊博士、孟伟博士、杜晓红硕士、王旭硕士、刘珍硕士、赵红亮硕士的帮助。 感谢吉大一院普外科研究室李楠老师、赵军硕士的帮助。 　　 个　人　简　历 1982.7～1988.7　　原白求恩医科大学日语医学班 1988.8～1991.9　　原白求恩医科大学第一临床学院普外科 1991.9～1994.7　　原白求恩医科大学　读硕士学位研究生 1994.8～1995.9　　原白求恩医科大学第一临床学院普外科 1995.9～1996.10 原白求恩医科大学 读博士学位研究生 1996.10～1997.10 日本爱知医科大学 研修、做博士课题 1997.10～1998.7 原白求恩医科大学 读博士学位研究生 1998.7～1999.5 原白求恩医科大学第一临床学院 1999.5～2001.5 吉林大学基础医学博士后流动站 病理生理教研室做博士后研究 博士后期间发表论文 1《胃癌急性穿孔34例分析》吉林医学.1999;3:79～80 2《术前化疗诱导乳腺癌生理凋亡的实验研究》中华实验外科.1999;3:216～217 3《关于乳腺癌的生理凋亡与预后关系的实验研究》白求恩医科大学 学报.1999;4:404～406 4《P53 P16融合表达载体的构建》白求恩医科大学学报.1999;4:369～370 5《腹膜后十二指肠损伤11例诊治体会》吉林医学.2000;4:220～221 6《N－ras、Cmyc反义寡核甘酸与P53、P16联合抑制肝癌细胞生长的实验研究》中华实验外科.2000;5:232～233 7《感染时机体代谢调节机制的研究》中国肠内与肠外营养.2000;4:155～157 8《P53基因诱导乳腺癌生理凋亡机制的研究》1999年6月全国第四届实验外科会议发表 9《人参二醇组皂甙及人重组生长激素对感染时机体代谢调节机制的对比研究》2001年4月第11届国际营养讨论会发表 10《人参二醇组皂甙对感染时营养代谢的作用》2001年中华中西医结合杂志　待发表 11《硒对短期全胃肠外营养大鼠肠粘膜的保护作用》2001年中华实验外科　待发表 PAGE