猪轮状病毒分离与鉴定

猪轮状病毒分离与鉴定 畜牧与兽医2009年第41卷第10期 猪轮状病毒分离与鉴定 田小艳,孙华,邓雨修,李春梅,徐贵娟,宋延华 (广东省温氏集团研究院,广东新兴527400) 摘要:采用MA104细胞从广东省某猪场患有明显腹泻症状的仔猪粪便中分离了1株产生明 显细胞病变(CPE)的病毒.电镜观察显示,病毒粒 子呈现较为典型的轮状病毒的形态特征;对其VP6基因进行序列分析,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明该分离株与 A群猪轮状病毒代表株OSU和Gotffried的核苷酸同 源分别为86.3%和80.8%,氨基酸序列同源性分别为97.7%和93.2%.综合所见,所分离的毒株 为A群猪轮状病毒. 关键词:猪轮状病毒;分离;鉴定 中图分类号:$955.3文献标识码:B文章编号:0529-5130(2009)10.0085.03 轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科 (Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),是各种幼龄动 物非细菌性腹泻的主要病原之一_1J.猪轮状病毒感 染是猪轮状病毒(Porcinemtavirus,PRV)引起的主 要以仔猪厌食,呕吐,腹泻,脱水和酸碱平衡紊乱为 特征性症状的疾病J.轮状病毒在离体细胞上培养 比较困难,而猪轮状病毒在离体细胞上培养更为困 难J.1968年美国的Mebus等首次从犊牛粪便中分 离出轮状病毒J,1973年澳大利亚学者Bishop,在 胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中也发现轮状病毒, 该病毒是引起婴儿及多种幼龄动物非菌性腹泻的主要 有些地 病原.在我国猪轮状病毒感染非常普遍, 区仔猪断奶后阳性率高达72%[8J,给畜牧业造成严 重的经济损失.因此,本研究采集疑患病毒性腹泻猪 病料,并对其进行了分离和鉴定,初步建立了猪轮状 病毒的PCR诊断方法,为广东省猪轮状病毒感染的 流行病学研究及诊断和防治提供基础资料与科学 依据. 1材料和方法 1.1病料 采集广东省某猪场的疑患病毒性腹泻仔猪的 粪便. 1.2主要仪器 二氧化碳培养箱,组织培养倒置显微镜,PCR 仪,电泳仪,高速台式冷冻离心机等. 1.3主要试剂 DMEM培养基,胎牛血清,胰酶等购自Sigma公 司,Trizol试剂盒,胶回收(小量)试剂盒,反转录 酶,RNA酶抑制剂,TaqDNA聚合酶,dNTPs,DNA Marker(DL2000),EB,琼脂糖等购自大连宝生物工 程有限公司,细胞生长液(含10%胎牛血清, 100U/mL青霉素,100Ixg/mL链霉素),维持液(不 含胎牛血清,100U/mL青霉素,100p,g/mL链霉素, 终浓度10p.g/mL胰酶),其他试剂为国产分析纯. 1.4细胞,宿主菌与载体 MA104(恒河猴胎肾传代细胞系)细胞系和 JM109宿主菌,由本实验室保存.pMD18.T克隆载体 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司. 1.5引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与合成 根据GenBank中PRV核酸序列设计2对引物: R/F为检测引物,VP6F/VP6R为VP6片段扩增引 物.引物由上海生物工程有限公司合成.引物序列, 位置及扩增片段大小见表1. 表1PRVRT-PCR检测及VP6基因扩增引物 收稿日期:2009—01一l3 作者简介:田小艳(1982一),女,硕士. 通讯作者. 1.6病料处理 将仔猪腹泻粪便样品用pH7.4的PBS稀释成 10%的悬液,3000r/min4oC离心20min,取上清, ? 86?AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine2009Vo1.41No.10 加入青霉素(1000U/mL),链霉素(1000mL) 作用4—6h,一70oC保存备用. 1.7疑似病料RT-PCR检测 按Trizol试剂盒说明的方法,直接从病料处理物 中提取病毒基因组RNA,加入10进行反转录, RT—PCR反应参照试剂盒说明书进行,同时设立阴阳 性对照. 1.8猪轮状病毒的培养 将RT.PCR检测阳性的病料经过0.22m的滤器 除菌后,与30p,g/mL的胰酶按1:1混合,37?处 理1h,取生长良好的MA104单层细胞,弃去培养 液,用PBS清洗细胞单层2次,按照原培养液量的 1/10加入胰酶处理过的病毒液,37?吸附1h,其间 摇匀3次,加入维持液,37?5%的CO培养,逐 日观察,48,72h为1个传代周期.传代前培养物冻 融2次,与3Og/mL胰酶按1:1混合,同样方法进 行盲传,至第4代出现明显细胞病变(CPE),待 (CPE)达70%以上收毒.整个过程设阴性对照. 1.9电镜鉴定 将接种病毒培养48h的细胞培养物收获后,反 复冻融3次,12000r/min4oC离心30min,去除细 胞碎片,吸取少量滴加到用碳膜覆盖的铜网上,待网 上液滴将干时,再滴上pH6.1的磷钨酸溶液进行染 色,一定时间后用滤纸吸去多余染液在透射电镜下 观察. 1.10PCR及测序鉴定 收集病毒培养液,按Trizol试剂盒说明的方法提 取病毒RNA.RT—PCR反应参照试剂盒说明书进行, 同时设立阴阳性对照.所得扩增产物经纯化后克隆到 pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒, 经酶切和PCR鉴定为阳性样品后,送宝生物工程 (大连)有限公司测序.利用DNAStar软件对测序结 果进行分析. 2结果与分析 2.1病料中RT-PCR扩增 1.2%琼脂糖凝胶电泳结果见图1,可见约为 309bp的扩增产物,与预期结果一致.. M.DNA分子质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ;1,2.样品;3.阳性对照;4.阴性对照 图1病料PCR产物的电泳 2.2猪轮状病毒的分离培养 病料接种MA104细胞,盲传4代开始出现CPE, CPE表现为细胞边界开始模糊不清,细胞变圆,融 合缩小,细胞界限不清晰,有大片脱落区,没有脱落 的细胞出现拉网现象,细胞变细,胞浆相连(图 2B).当CPE达70%以上时,开始收毒. A正常MA104细胞B出现90%细胞病变的MA104细胞 图2猪轮状病毒在MA104细胞的分离培养(100x) 2.3病毒的形态特征 对细胞培养物进行电镜观察,均可见到双层衣 壳,球形似车轮状的病毒颗粒,直径约75nm,见图 3箭头所指. 叩咖咖姗珊瑚,’l 畜牧与兽医2009年第41卷第10期?87? 图3细胞培养物中猪轮状病毒颗粒(xlO万) 2.4VP6核苷酸及氨基酸同源性比较 由图4可知将重组质粒pMD—VP6经Hindm和 nI双酶切,释放出长度约1400bp和2700bp的 片段,同时PCR也扩增出1400bp的目的片段与预 期结果相符,证明重组质粒pMD.VP6构建成功.利 用DNAStar对轮状病毒的群抗原基因VP6基因核苷 酸和氨基酸序列进行同源性比较,发现上述RV分离 株VP6基因(GenBank中登陆号为FJ617209)的核 苷酸与GenBank中登陆的A群猪轮状病毒代表株 OSU和Gotffried的核苷酸同源分别为86.3%和 80.8%,氨基酸序列同源性分别为97.7%和93.2%, 结果表明本试验分离株与OSU株在基因型上更为 接近 接种的病料及病毒悬液用浓度为20t~g/mL的胰酶, 按1:1比例混合后在37?作用1h后接种MA104, 盲传几代,从第4代开始出现CPE,并随传代次数的 增加,病变出现的时间也提前,细胞病变表现为细胞 肿大,变圆,脱落,有时出现融合及拉网现象.这表 明所分离毒株对细胞适应性较强. 通过电子显微镜对病毒形态进行观察,从多个视 野中可见双层衣壳,边缘粗糙,球形似车轮状的病毒 颗粒,直径约75nm,这初步验证了分离的病毒为轮 状病毒.但有关该病毒的理化特性,生物学特性及抗 原特性,还需要进一步研究. 为了更准确地反映所分离的毒株与其他分离株间 基因的变异程度,选取了轮状病毒的群抗原基因 (VP6基因),对分离株VP6基因进行克隆测序分析 (GenBank中登陆号为FJ617209),比较其与其他毒 株间核苷酸和氨基酸序列的同源性,结果显示与A 群猪轮状病毒代表株OSU和Gotffried的核苷酸同源 分别为86.3%和80.8%,氨基酸序列同源性分别为 97.7%和93.2%,与OSU株的同源性最高,这进一 步证明了分离的病毒与代表株OSU株同属A群猪轮 状病毒.分离毒株的毒力还有待进一步验证. 参考文献: [1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版 社,1997:456-466. bp[2] 2000[3] 1000 750[4] 500 250[5] 100 M.DNA分子质量标准;1.H/ndm和nI酶切鉴定; 2,3.重组质粒PCR鉴定 图4pMD-VP6重组质粒鉴定 3讨论 轮状病毒很难适应细胞培养,有资料报道轮状病 毒VP4基因能够抑制病毒在MA104细胞上生长,但 是VP4基因对胰酶敏感,通过胰酶可使VP4基因特 异性裂解为VP5和VP8,从而使病毒具有感染性, 容易在细胞上生长_9.一般认为除个别几株轮状病 毒外,感染细胞往往不产生或仅产生轻微CPE,并容 易在传代过程中丢失.本试验分离猪轮状病毒时,将 [6] [7] [8] [9] [10] [11] KapilianAZ,ChanockRM.Rotaviruses.In:FieldVirology [M].3rded,NewYork:Raven.Press,1996:1657—1660. 宣长和,孙福先,朱战波,等.猪病学[M].2版.北京: 中国农业科学技术出版社,2003:29-32. WoodeGN,BohlEH.PomiaeRotaviruslafection.In:LeinanA D.Diseaseofswine[M].1981:310-322. FukushoA,SilimizueY,hoY,IsolationofCytopathieRotavirusin CellRollerCultureinthePresenceofTypsin[J].ArchivesofUml— ogy,1981,(69):49—60. MebusMS.CurtanWL,MeferranJB.Calfdiarrhea:reproduced withavirus—likefromfieldoutbreak[J].UnivNebraskaBuh, 1969,233:1—16. BarnesGL,BishopRF.Rotavirusinfectionandprevention[J]. CurrOpinPediatic,1997,9(1):19-23. 李国平,伊顺仁,李发晟,等.仔猪轮状病毒的感染情况调查 [J].福建畜牧兽医,1999,21(2):44—45. BumsJW,GreenbergHB,ShawRD,eta1.Functionalandtopo— graphicalanalysesofepitopesonthehemagglutinin(VP4)ofthe simianrotavirusSA11[J].JViral,1988,62(6):2164-2172. BabiukLA,MohammedK,SpeneeL,eta1.Rotavirusisolation andcultivationinthepresenceoftypsin[J].JClinMicrobiol, 1977,6:610—617. EstesMK,CohenJ.Rotavimsgenestructureandfunction[J]. MicrobiolRev,1989,53(4):410—449.