宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶_LbBADH2_的克隆与序列分析

宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶_LbBADH2_的克隆与序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ( LbBADH2) 宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶 的克隆与序列分析 1 2 1*，，陈晓军曹有龙樊云芳 (1 , 国家枸杞工程技术研究中心，宁夏银川 750002; , 2宁夏农业生物技术重点实验室，宁夏银川 750002) ，，，。cDNA 1 527摘要 以宁夏枸杞为试验材料利用同源克隆技术 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 简并引物克隆得到一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因该基因全长 为 ，508 ，5'UT, ( 47 bp) 3'UT, ( 129 bp 。) ，个碱基编码 个氨基酸编码区两侧翼分别具有 和 在推导的氨基酸序列中含有醛脱氢酶所具有 ( VTlElGGKSP) ( C)。 ，，的高度保守的十肽以及与酶功能有关的半胱氨酸残基进化分析表明它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近与 。，。其他藜科植物亲缘关系较远该基因的获得有助于理解枸杞这一盐生植物耐盐机理为培育新的耐盐枸杞奠定理论基础 ; ; BADH2关键词 宁夏枸杞同源克隆 + AS 567, 1 9文献标识码 0517 ) 6611( 2014) 3)5 1279 8) 05中图分类号 文章编号 Cloning and SequenceA nalysis of LbBADH2 in Lycium barbarum 1 2 1* FAN Yun-fang，CHEN Xiao-jun，CAO You-long( 1, National Engineering ,esercah Center foWr olfberry，Yinchuan，Ningxia 750002; , 2 Key Lab oAfg ricultural Biotechnology of Ningxia，Yinchuan，Ningxia 750002) Abstract A new geneB eotaif ne Aldehyde Dehydrogenase ( BADH) ，named LbBADHo2b，tawinaeds by ,ACE technology in Lycium barba- rum, The full cDNA of LbBADis Hc onsist of1 527 basea pirs and encode 50, ，85 'UaTa, ( 47 bp) and '3UT, ( 129 bp ) lo cating both side of it, A high conservededc apeptide sequenceVTLELGGKSPand Cys，which arer elated to the tiavicty of enzyme，are i n fopunutatdiv e amino ‘’ acid amongll BaADH, Thee volutional analysis showed that LbBADiHs 2c loser with Solanum lycopresicum than othersl apnt in genetic relation- ship, The obtaining of LbBADHil2 l h ewlp understanding the mechanism of slat tolerance and lay theoretical foundation for developing new lst-a tolerance variety in Lycium barbarum, BADH2 Key words Lycium barbarumH; omo-cloning; ( Lycium barbarumL , ) ，1 、、、，枸杞属于茄科枸杞属落叶灌木也 取宁杞 号幼嫩枸杞根茎叶片花等植物材料低温冰盒 ) 70 ? ，，，，、、 冰箱中备用随后提取 保藏后带回实验室然后置于 是其中唯一一属盐生植物其根系发达具有抗旱耐盐碱 ,NA。、，，总 耐寒耐瘠薄的特点主要种植于轻度盐渍化地区是盐渍化 1, 1, 2 。。,NA SV Total ,NA Iso-土地改良的先锋植物在当前西部生态建设和中药材基地 载体与试剂提取试剂盒为 ,1 )2 , ，、。建设中枸杞具有很高的生态经济和社会价值 lation SystemPr(o mega ; ) ,NA mProm-II ,e-反转录试剂盒为 ( ) ，甘氨酸甜菜碱简称甜菜碱是甘氨酸的衍生物被认为 verseTr anscriptase (Promega 、)DNA 离心柱型琼脂糖凝胶 回 。，是最好的渗透调节剂在植物体内甜菜碱由胆碱经两步氧 Wizard SV Gel and PCC,lea n-up System ( Pro- 收试剂 盒 为 ，2 ( betaine alde- 化生成催化第 步反应的是甜菜碱醛脱氢酶mega)T ; pGEM-T easIIy Vector ( Pro- 连 接 载 体 试 剂 盒 为 ,3,hyde dehydrogenase，BADH) 。BAHD 目 前 已 经 从 盐 节 木 mega，5) '-,ACE 3'-,ACE Takara ， 和 试 剂 盒 均 为 公 司 产 品,4,caspi- strobilaceum ) 、( Halostachys( Halocnemum 盐 穗 木 Taq DNA DNA marker Tiangen ; 聚合酶与 分子量 为 公司产品,,5,6 ) 7,ca) 、( Suaedlia ao tungensis) 、( Haloxylon am-碱 蓬 梭 梭 ; 。引物由北京奥科公司合成其余试剂均为分析纯 ,,8,9,modendron) 、( Sipnacia oleracea) 、( Atriplex cen- 菠菜 滨 藜 1, 2 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,1,0,1,1tralasiatica) 、( Atriplex hortensis) 、( Beta vul- 山菠菜甜菜1, 2, 1 ,NA 。Promega SV Total ,NA Iso- 总 的提取按 公司 ,1,2,13, garis) 、( Kalidium foliatum) ，盐 爪 爪 等 藜 科 植 物小 麦 lation System 。试剂盒操作指南进行 ,1,4( Triticum aestivum) 、( Oryza sativa) 、( Hor- 水稻短芒大麦草1, 2, 2 cDNA 。Promega mProm-II ,e-总 的反转录按 公司 deumr ebvisubulatum) ( Brassica na- 等 禾 本科植物以及油菜 verseTr anscriptas e。2 g ,NA，试剂盒进行取 μ枸杞叶片总 ,1,5pus) 。等其他植物中分离克隆在盐生植物宁夏枸杞中虽 以 Oligo dT 为引物，进 行 总 cDNA反 转 录。反 应 体 系 为 20 ,16,BADH1，然已经克隆了 但在枸杞复杂的耐盐生理过程中 l，MMlV ,Tbuff er 4 l，,NA 2 l，dNTP 2 l，μμ总 μμ反转录酶 MMlV 1 l，Oligo ( dT1) 6 1 l，,NA ,Naseins 0, 5 μμ酶抑制剂 BAHD1 。是否存在除 外的甜菜碱醛脱氢酶尚未见报道笔者 l，DEPC HO 20 l。42 ? 60 μ加 处理的 至 μ反转录反应为 2 ，以宁夏枸杞叶片为试验材料利用同源克隆技术分离克隆到 min，95 ? 5 min，3 ? 3 min。) 20 ? 。反转录产物置于 备用 BADH2，。从进化角度分析其在耐盐生理过程中的保守性 1 材料与方法 1, 2, 3 BADH PC, GenBank 。基因核心序列的 扩增 根据 上 1, 1 材料 BADH ( GenBank 已 发 表 的 基 因 序 列 登 录 号 分 别 1, 1, 1 。2013 5 ，，植物材料年 月在宁夏枸杞种质资源圃中 为 FJ22848、2BT01358、8FJ514799、DQ49723、3DQ92361)7 863 ( 2013AA102606 )04 ) ; 设计一 基金项目 国家 计 划 国 家 自 然 科 学 基 金 项 。( 31260351) 目 ，cDNA 。对简并引物从枸杞叶片 扩增该基因的核心片段上 ( 1981) ，) ，，，，作者简介 樊云芳女甘肃天水 人助 理 研 究 员硕 士从 事 P1( CGNAC,YVTTTCATYGAYGG) ，P2游引物为 下游引物为 。* ，，，枸杞细胞与分子 生 物 学 研 究通 讯 作 者研 究 员博 士 ，。硕士生导师从事枸杞研究 ( TTCYCCDAGYTCDCGBCCAAA, CNTCC,CG) ，预期扩增片 2014-10-31收稿日期 1 392 bp。PC, 25 l，10 ×b uffer段大小为 反应体系为 μ包含 12799 42 36 卷 期 ( LbBADH2) 樊云芳等 宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶的克隆与序列分析 2, 5 l，dNTP ( 2, 5 mmol / l ) 1 , 5 l，、( 10μμμ上下 游 引 物 mol / l) 1 l，Taq ( 5 U / l ) 1 l，cDNA ( 1 μμ各 μ聚 合 酶 μμ总 g / l) 1 l，ddHO ? 5 25 l。94 μμμ加 至 μ反应程序为 预变性 2 min，94 ? 30 s、50 ? 40 s、72 ? 50 s，30 变性 退火 延伸 个循 ，72 ? 10 min。环后延伸 1, 2, 4 BADH 3'-,ACE 。基因 扩增根据其他已发表物种的 BADH2 cDNA BADH2 -,ACE 3' 基因 序列设计 基因的 的引 P3 ( CTGAAGAGG AA GCCATTGAG ) P4 (TT CTCAGT- 物 和 CAGGGTGTGT) ，CTakara3 '-Full ,ACECore SetV er, 2,按照 0 说明书进行 3'- ,ACE 扩增，预期扩增片段大小为 362 bp。 1, 2, 5 BADH 5'-,ACE 。基 因 扩 增根据其他已发表物种 1 LbBADH2 图 保守区域扩增 BADH2 cDNA 5'-,ACE P5 ( TCAG- 的 基 因 序 列 设 计 引 物 GATGTGAAACCAAAGGAGAACC) AG ( GAGGTAAT-P6 和 AGATGCCATTTCAGACGGC)T ，Takara5 '-Full ,ACE 按 照 Kit 5'- ,ACE ，说 明 书 进 行 扩 增预期扩增片段大小为 628 bp。 1, 3 克隆与测序 1, 3, 1 BADH2 。基因完整序列的测序与拼接所有基因片段 。、3' -,ACE 送北京天根生物公司测序将核心序列测序结果 5' -,ACE ，BADH2 cD- 与 测序结果进行拼接所得即为 基因 NA 。的完整序列 1, 3, 2 BADH2 cDNA O,F PC, 。基因 完整 的 扩增根据测 ，BADH2 O,F P7序结 果设 计 基 因 完 整 序 列 的 上 游 引 物 3',ACE 2LbBADH2 图 片段扩增 ( GAAAAACTCATATCAGTAGCATTT) AGC P8和 下 游 引 物 ( GCTCTTAAAGATGAAATAAACAGAAGAGG) ，以 枸 杞 叶 片 ，PC, ，，反转录产物为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 进行 扩增测序确认预 期 扩 增 片 1 527 bp。段大小为 1, 4 BADH2 www, ncbi, nlm, nih, gov 基因的进化分析 采用 BlAST 、DNAMAN7, 0，BADH2 中的 软件对 编 码 蛋 白 基 因 序 ; MEGA 5, 05 ， 列进行生物信息学分析采用 软件绘制进化树 Neighbor-joining ，Bootstrap 计 算 方 法 采 用 方 法设 置 为 ,9, 1 000。 2 结果与分析 3LbBADH2 5',ACE 图 片段扩增 2, 1 LbBADH2 cDNA cDNA 序列的获得 以枸杞叶片 为 ，LbBADH2 ，模板设计简并引物扩增 保 守 核 心 序 列扩 增 片 1 392 bp( 1)， ，LbBA- 段大小为 图 与预期大小一致测序获得 DH2 ; 3' ,ACE 362 bp ( 保守核心 序 列扩增片段大小为 图 2)， ，LbBADH 23' ; 5' ,ACE 与设计一致测序后获 得 序 列结 628 bp( 4) ，，果扩增片段大小为 图 与设计一致测序后获得 LbBADH 25'; LbBADH2 、3' 、5' 序列将 保 守 核 心 片 段片 段片 DNAMAN ( V7, 0 ) ，段序用 生物软件进行拼接重 新 设 计 引 ，，1 527 bp( 4) ，物扩增该基因全长序列扩增大小为 图 与预 ，LbBADH2 cDNA 。计大小一致测序验证获得 全长 序列 2, 3 LbBADH2 cDNA LbBADH2 cDNA 序列分析 全长 序 ( GenBank : KM03650)1 ，( 5) ， 4LbBADH2 cDNA 列登录号推导氨基酸序列图 图 全长 扩增 A 。508 BADH可见 LbBADH2的编码区为 1 527 bp，编码区两侧翼分别具有 合成信号推测该开放阅读框编码 个氨基酸的 ，56 147, 5，5, 30。蛋白分子量为 理论等电点为 编码蛋白质 5'UT, ( 47 b和p) 3'UT, ( 129 bp用软件 ) ; polyadq 预测到在 lys Arg，11, 2% ; 中碱性氨基酸为 和 占氨基酸总数的 酸性氨 poly( A) 尾前 46 位出现终止信号 AATAAA，代表多聚核苷酸 12800 安徽农业科学 2014 年 sp、Glu、Asn Gln，18, 5% ; ( VTlElGGKSP) A基酸为 和 占氨基酸总数的 疏水氨 以及与酶功能有关的 所具有的高度保守的十肽 半胱氨酸残基( C) 图( 5 阴影部分) 。这些残基可能包含 NAD 基酸为 Ala、Ile、leu、Phe、Trp、Val、Tyr 和 Pro，占氨基酸总数的 ,17,+ 结合位点和酶催化位点。在 5'端含有不典型的信号肽 45, 87% ; Gly、Asn、Cys、Gln、Ser、Thr Tyr，极性氨基酸为 和 占氨 ,1,835, 3% 。，基酸总数的 在推导的氨基酸序列中含有醛脱氢酶 QlFIDGE，表明该酶可能定位于叶绿体中。 ; VTlElGGKSP'; AATAAA ploy ‘: 3'UT, ;5'UT, ; ATG ;TAA加粗阴影部分为保守的十肽基序和半胱氨酸残基为 终止密码 起始密码 注 A 。合成信号 5 LbBADH2 图 阅读框和推测氨基酸 DH2 LbBADH1( : ACQ9919)5 2, 3 LbBADH DNAMAN7, 0 LbBA-基因与登录 基因登录号基因氨 进化分析 用 分析克隆 12801 42 36 卷 期 ( LbBADH2) 樊云芳等 宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶的克隆与序列分析 LbBADH2 LbBADH1 BADH，6。。85 基酸序列 与 序 列 上 存 在 个 氨 基 酸 结果见图 个不同拷贝的 残基的差异，一致性仅为 83, 07% ，说明在宁夏枸杞中存在 2 6 LlbBADH1 lbBADH2 图 与 序列比对 ; ( Triticum aestivum) 、( Oryza sativa) 、一个进化分枝小麦水稻 MEGA5, 05 BADH 对其他物种 基因编码的氨基酸序 用 ，，( Hordeurmev isubbulatum) 列进行分子进化分析同一科植物聚类到一起说明此蛋白 短芒大 麦 草 聚类到禾本科进化分 ，7。( Halocnemum strobilaceum) 、 ; ( Brassica napus) 、( Gssoypium hirsutum) 、较为 保 守结 果 见 图 盐 节 木 枝油菜 陆地棉 麻疯 ( Halostachys caspica) 、( Suaedlia ao tungensis) 、( Jatrophac urcas) 、( Populus euphratica) ; 盐穗木碱 蓬 梭 树胡杨亲缘关系较远( Haloxylon ammodend、ron) ( Sipnacia oleracea) 、( lycium barbarum) ( Solanum lycopresicum) 梭菠 菜 滨 藜 宁夏枸杞与番茄聚 ( Atriplex centralasiatica) 、( Atriplex hortensis) 、( Be- ，，LbBADH1 山菠菜甜菜类到茄科进化分枝同时所克隆的基因与 为不同 ，ta vulgaris) 、( Kalidium foliatum) BADH 。的基因它与番茄的 盐爪爪等藜科植物被聚类到 亲缘关系更近 : BADH GenBank 。注括号内为 蛋白 登录号 7 BADH 图 分子进化树 BADH ，基因的研究中发现在单倍体基因组中至少有 在甜菜 3 讨论 ,1,9在植物中 BADH基因是以小 的多基因家族的形式存在。 2 个相 关 序 列。在 水 稻中也发现有大量乙醛酸脱氢酶