[doc] 外源一氧化氮供体对盐胁迫下小麦幼苗叶片谷胱甘肽抗氧化酶系统的影响

[doc] 外源一氧化氮供体对盐胁迫下小麦幼苗叶片谷胱甘肽抗氧化酶系统的影响 外源一氧化氮供体对盐胁迫下小麦幼苗叶 片谷胱甘肽抗氧化酶系统的影响 第31卷第9期 2005年9月1144,1149页 作物 ACTAAGRONOMICASINICA V01.31.No.9 PP.1144—1149Sept.,2005 外源一氧化氮供体对盐胁迫下小麦幼苗叶片谷胱甘肽抗氧化酶系统的 影响 阮海华#沈文飚刘开力徐朗莱 (南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095) 摘要:研究了外源一氧化氮(NO)供体SNP对150mmol/LNaC1胁迫下小麦幼苗叶片谷胱甘肽抗氧化酶系统的影响.结 果表明,与单独盐胁迫相比,0.1mmol/L的SNP处理明显提高了小麦幼苗叶片还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,略微降低了 氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量,明显提高了GSH/GSSG,这可能与其诱导谷胱甘肽还原酶(GR)的活性有部分关系.同 时,SNP处理亦显着促进了谷胱甘肽一s-转移酶(GST)的活性,通过参 与降解因盐胁迫而过量产生的过氧化产物,实现细胞 解毒功能.此外,外源NO供体SNP还提高了盐胁迫下小麦幼苗叶片 抗坏血酸(ASC)的含量以及抗坏血酸过氧化物酶 (APX)的活性,协助清除活性氧. 关键词:一氧化氮;盐胁迫;小麦幼苗叶片;谷胱甘肽 中圈分类号:Q945,$512 EffectsofExogenousNoDonoronGlutathione—dependentAntioxidativeS ystemin WheatSeedlingLeafunderSaltStress RUANHai—Hua,SHENWen—Biao’,LIUKai—Li,XULang-Lai (CollegeofIgeSciences,NanjingAgriculturalUnltersity,Nanjing210095,Jiangsu,China) Abstract:AccumulationofsaltsinirrigatedsoilisoneoftheprimaryfactorslimitingyieldinwheatproductioninSoutheast Asia.Itiswellknownthatsalinitycouldaffectanyprocessintheplant’slifecycle,sothattolerancewiUinvolvea complexinterplayofcharacters.Forexample,overproductionofreactiveoxygenspecies(ROS),iftheyarenotrapidly removed.theyeasilycauseconsiderablestructuralandfunctionaloxidativedamageinplantcellsundersalinity. Meanwhile,alotofrecentresearchesfoundthatnitricoxide(NO)playsanimportantroleinmediatingsomebioticand abioticstress—inducedoxidativestressesinplantkingdom.However,itremainsunknownabouttheroleofNOin glutathione-dependentantioxidativesystemundersaltstress.Inthisreport,effectsofexogenousNOdonorSNPon metabolismofglutathioneinwheatseedlingleafunder150mmol/LNaCIsaltstresswereinvestigated.Resultsshowedthat 0.1mmol/LSNPtreatmentapparentlyincreasedthereducedglutathione(GSH)contents(Fig.1-A),slightlydecreasedthe contentsofoxidizedglutathione(GSSG)(Fig.1-B),thereforeresultinginelevatingtheratioofGSH/GSSGinwheat seedlingleavessubjectedtosaltstress(Fig.1-C).Furtherresultsindicatedthatthesemightbepartiallydue+tothe increasedactivitiesofglutathionereductase(GR)exertedbyexogenousNOdonor(Fig.2-A).Meanwhile,exogenousNO donorSNPalsopromotedtheactivitiesofGSH—dependentglutathione—S —transferase(GST)inwheatseedlingleaves(Fig.2一 B),participatingthedegradationofperoxidescausedbysaltstressandachievingitscelldetoxificationfunction.Also, employmentofexogenousSNPinducedtheAPXactivitiesandASCcontents(Fig.3),whichwerebothbenefitforthe scavengingofreactiveoxygenspecies(ROS)inwheatseedlingleavesundersalinity.Basedonthepresentresults,itis inferredthatNOcouldstronglyup—regulateglutathione—dependentantio xidativesystem,ultimatelyresultinginpromotingthe salttoleranceagainstsaltstress.InviewofthefactthatNOisthebyproductofmetabolisminhighplants.itwiUbemore availableifsomeappliedapproaches,whichcouldmodulatetheactivitiesofnitricoxidesynthase(NOS)or/andNRto enhanceappropriateendogenousNOlevel,wouldultimatelyalleviatetheoxidativedamagecausedbysaltstress. Keywords:Nitricoxide;Saltstress;Wheatseedlingleaf;GIutathione 基金项目:江苏省青年科技创新人才学术带头人项目(BK2004417)和 南京农业大学SRT项目(0309A04)资助. 作者简介:阮海华(1976一),女,内蒙古人,博士,从事植物生物化学研 究,现工作单位为天津大学药物科学与技术学院(邮编:300072),博 士后.同等贡献.通讯作者(Au~orforcorrespondence):沈文飚. Received(收稿日期):2004-08-09,Accepted(接受日期)2OO4.12.29. 第9期阮海华等:外源一氧化氮供体对盐胁迫下小麦幼苗叶片谷胱 甘肽抗氧化酶系统的影响 盐胁迫是目前制约农作物产量的主要逆境因素 之一L1.盐胁迫对植物造成的损伤主要包括渗透胁 迫和离子毒害,而这两种原初反应的结果,又产生大 量活性氧(ieactiveoxygenspecies,ROS),从而对盐胁 迫下的植物生长和发育造成次生氧化损伤. 一 氧化氮(nitricoxide,NO)是在植物体内新发现 的生物活性分子,参与了植物在生物及非生物胁迫 下适应性的提高”.前文已经发现,外源NO供 体硝普钠sodiumnitropmsside,SNP)通过提高盐胁迫 下小麦幼苗叶片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,缓 解了由于盐胁迫导致的小麦叶片ROS的累积,从而 具有保护作用.同时NO本身也具有抗氧化功能, 可以延缓由赤霉素(GA)诱导的糊粉层细胞程序性 死亡(programmedcelldeath,PCD)以及CAT和SOD 编码基因mRNA转录水平的降低.Uchida等亦证 实了一定浓度的SNP对盐胁迫水稻幼苗的生长具 有促进作用,且与其对ROS及其清除酶的调节有 关.已经知道,除了活性氧清除酶外,植物体内还 存在非酶抗氧化物质,例如谷胱甘肽(GSH)和抗坏 血酸(ASC)等;同时GSH和ASC也是ASC.GSH氧化 还原途径的重要组成成分,而ASC.GSH氧化还原途 径也是植物组织中直接清除ROS的酶促催化系 统.本文以扬麦158为材料,研究了外源NO供体 SNP对盐胁迫下小麦幼苗GSH及其相关抗氧化酶 系统的调节作用,为进一步了解NO提高植物耐盐 性的作用提供理论依据. 1材料与方法 1.1材料培养及处理方式 将扬麦158(TriticumaestivumL.)种子用0.1% HgCl消毒后,于25?培养箱中暗发芽(培养皿中各 铺两层滤纸),选择芽长一致的种子,用Hoagland营 养液置光照培养箱水培,温度(20?1)cI=,光周期12 h,光强300ttmol?ITI,?S,,湿度60%.当幼苗长至 两叶一心时进行处理,并于处理的第2,4,6和8天 进行测定,测定重复3次. 参照前文’,用150mmol/LNaC1作为盐胁迫 处理浓度,NO供体硝普钠(购自Sigma公司)随用随 配.0.15mmol/L的SNP大约可以产生小于0.2 ttmol/L的NO...谷胱甘肽.s.转移酶(glutathione.S. transferase,GST)活性测定的底物1.氯.2,4.二硝基氯 苯(1-cMom~,4-dinitrobenzene,CDNB)也购自Sigma 公司.所有处理试剂均于处理前加人Hoagland溶 液,为了保持处理溶液浓度一致,从处理开始,每天 更换处理液,并以单独采用Hoagland培养液的处理 作为对照. 1.2GSH和氧化型谷胱甘肽(oxidizedghtathione. GSSG)的含量测定 参照Hissin等”?的荧光比色法,并以干重计算 含量. 1.3谷胱甘肽还原酶(ghtathionereductase,GR)活 性测定 取0.5g新鲜叶片,加50mmol/LTris.HC1缓冲 液(pH7.0,含20%甘油,2%PVP,1mmol/LASC,1 mmol/LDTI”,1mmol/LEDTA,1mmol/LGSH和5 mmol/LMscl2),冰浴研磨,4oc下15000×g离心20 min,上清液冰浴待用.活性测定按照Knomer等? 的方法,3mL反应液为50mmol/LTris.HC1缓冲液 (pH7.5),含5mmol/LMgC12,0.5mmol/LGSSG和 0.2mmol/LNADPH,于340nm下测定光吸收的下 降. 1.4GST的活性测定 参照Komives等的方法.取0.5g新鲜叶片 按1/5(/V)比例加人200mmol/LTris.HC1提取液 (pH7.8,含3%PVP和0.1mmd/LEDTA),冰浴研 磨,10000×g冷冻离心30min,取上清为粗酶液. 反应液为pH7.4的50mmol/L磷酸缓冲液,内含1 mmd/L的CDNB,测定340am下光吸收的上升. 1.5ASC含量和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase.APX)活性测定 取0.5g叶片用1%草酸研磨匀浆,按照 Kampfenkel等的2,6.二氯酚靛酚滴定法测定 ASC;APX活性测定参照Clark等?的方法. 1.6蛋白质含量测定 根据Bradford的方法进行,用牛血清白蛋白 (BSA)作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线. 2结果与分析 2.1SNP对盐胁迫下小麦幼苗叶片GSH和GSSG 含量以及GSHIGSSG的影响 GSH在植物体内起着清除ROS,调节ASC含量 及APX活性的作用.图1表明,与对照相比,在 正常生长条件下,0.1mmol/LSNP单独处理显着提 高小麦幼苗叶片GSH的含量(P<0.01);150mmol/L NaC1胁迫处理则不同程度地降低GSH的含量,同时 作物第31卷 极显着增加GSSG的水平(P<0.O1).而结合0.1 mmol/LSNP处理,则显着缓解盐胁迫诱导的小麦幼 苗叶片GSH含量的下降(P<0.05),例如在第8天 时,0.1mmol/LSNP处理使150mmol/LNaC1胁迫下 的小麦幼苗叶片GSH含量提高27.9%(图1一A).此 外,与单独盐胁迫相比,SNP处理还略微降低了处理 前6d的GSSG含量,并在第8天使小麦幼苗叶片 GSSH的含量降低15.0%(P<0.05,图1一B).外源 NO供体可通过分别提高或降低GSH和GSSG的含 量来增强盐胁迫下小麦幼苗叶片的抗氧化能力,保 A T工 /. 7? ]卜—}—{// 02468 Treatmenttimefd1 — ?一CK +l5Omm01几NaCl +l5Ommol几NaCl+olrl~lOl/LSNP — 0lrl~lOl/LSNP 护还原态巯基. 进一步分析发现,与盐胁迫单独处理相比,外源 NO供体SNP处理显着提高了盐胁迫下小麦幼苗叶 片GSH/GSSG比率(P<0.05,图1.C),例如在处理的 第8天,0.1mmol/LSNP将150mmol/L盐胁迫下小 麦幼苗叶片GStt/GSSG的比率提高了48.9%.说明 外源NO供体处理能保持小麦幼苗组织内部较高水 平的GSIt/GSSG,从而维持盐胁迫下小麦幼苗合适的 氧化还原环境,有利于提高耐盐性. 02468 Treattnenttime(d1 — ?一CK +l5Ommol几NaCl — 卜l5Ommol几NaCl+olmmol/LSNP — 0lmmol几SNP 们 皇 召 鼍 Treatmenttime(d) — ?一CK +l5Ommol几NaCl — ?r—l5Ommol几NaCl+olrl~lOI/LSNP — _I0.1rl~lOI/LSNP 圈1sNP对盐胁迫下小麦幼苗叶片GSIt(A)和GssG含?(B】以及GSlI,GssG(c)的影响 Fig.1E由rects0fexo璺e?0璐NOdonorSNP佃thecont蛐ts0fGSHlAJ. GssG(BJand删惦0fGSH,GssG(C)inwheat?edlil堆lundersalts打螂 各组数据以3次重复试验的平均值?标准差表示,采用单因素方差分析做统计学分析, 为与单独采用盐胁迫处理相比较后达到了O.O5显着水平. Bar8representthemelt_?SEoftIIreeindependentexperiments.0newayAN 0VAwasusedforcom~tl’ilN)n8betweenthemeans.Thedammarkedwith aresignific~mdydifIrentfromthatofsaltstre8stl~atnlentaloneatP<0.05. 2.2SNP对盐胁迫下小麦幼苗叶片GR和GST活 性的影响 GR是植物细胞内将GSSG还原为GSH的关键 酶,也是清除植物细胞内部O的酶催化系统的组 分之一.图2.A表明,盐胁迫下小麦幼苗叶片GR 的活性随0.1mmol/LSNP处理天数的增加而明显提 高.在处理的第6天和第8天,分别提高了26.8% 和31.6%(P<0.O5),并与其提高GSH含量的结果 相一致(P<0.05,图1一A).值得注意的是,NaC1胁 迫和单独SNP处理亦不同程度地提高了小麦幼苗 叶片GR的活性.上述结果暗示,外源NO供体可能 通过提高盐胁迫下小麦叶片GR的活性进而调节 GSH和GSSG的水平以及GSH/GSSG的比率. GST是细胞内依赖于GSH的重要解毒酶.150 mmol/LNaC1处理的第2天就明显提高了GST的活 性,而第4天又恢复到与对照相同的水平(图2.B). 0.1mmol/L的SNP处理则极显着地提高了盐胁迫下 小麦幼苗叶片的GST活性(P<0.01).此外,SNP 单独处理亦一定程度地提高了正常生长条件下小麦 幼苗叶片的GST活性. 2.3SNP对盐胁迫下小麦幼苗叶片ASC含量和 APX活性的影响 进一步研究了外源NO供体SNP对盐胁迫下小 麦幼苗叶片ASC含量的影响.如图3.A所示,在 150mmol/LNaC1胁迫条件下,小麦幼苗叶片ASC的 含量随处理时间的延长而迅速降低;与盐胁迫处理 相比,盐与SNP同时处理的第2天就诱导了me(d) 口CK 囵I50mmol几NaCI 口I50mmol几NaCI+0Immol几SNP 口0.Immol几SNP 常生长条件下小麦叶片ASC的含量无显着影响(图 3.A). 4oo 350 300 250 2oo 15O 100 50 O 02468 Treatmenttime(d) 口CK 囵150mmol几NaCI 口150mmol/LNaCI+01mmol/LSNP 口01mmol几SNP 圈2外源NO供体SNIP对盐胁迫下小麦幼苗叶片GR(A)和GST(B)活性变化的影响 FIg.2EffectsofexogenonsNOdonorSNPOiltheactivitiesofGR(A)andGST (B)inwheatseedlin~leavesundersaltstress 各组数据以3次重复试验的平均值?标准差表示,采用单因素方差分析做统计学分析, 和一为与单独采用盐胁迫处理相比较后达到了0.05和0.O1的显着水平. BarsrepresentthemeaIl?SEofthreeindependentexperiments.0RewayAN0 VAW88usedforCOrrll~ison8betweenthemeaIlB. Thedatamarkedwithandaresignificandydifferentfromthatofsaltstl’e88仃eatnlentaloneatP<0. 05andP<0.O1. ; 9 邑 U ? 《 c宕 甚 尝 8 : ; . ? 一 _ - 一 l 02468 Treatmenttime(d) --- 0--CK —一 15Ommol几NaCI — ?r_.150mmol几NaCI+0Immol/LSNP —一 01mmol几SNP 02468 Treatmenttime(d) 口CK 口150mmol几NaCI 口150mmol/LNaCI+01mmoFLSNP 口0Immo[几SNP 圈3SNIP对盐胁迫下小麦幼苗叶片ASC含量(A)和APX活性(B】的影响 FIg.3Effoets0fexogenousNOdonorSNIPOilthecontentsofASC(A)andact ivitiesofAPX(B】inwheatseedlin~leavesundersaltstress 各组数据以3次重复试验的平均值?标准差表示,采用单因素方差分析做统计学分析, 为与单独采用盐胁迫处理相比较后达到了0.05显着水平. Barsrepresentthemean?SEofthreeindependentexperiments.OnewayAN OVAWigsusedforCOrfllmmol/LNaCI胁迫明显提高小麦幼苗叶片 APX的活性,而外源NO供体SNP处理则可以进一 步提高其活性(P<0.05),如处理第6天提高 15.4%,而第8天提高43.5%.表明外源NO供体通 过调节盐胁迫下小麦幼苗叶片的APX活性,提高了 组织内部的抗氧化能力,从而起到保护作用. 3讨论 ROS的过量产生是环境胁迫导致植物次生氧化 损伤的主要诱因之一.ROS的清除系统包括酶系统 和非酶物质两类,其中非酶物质主要包括GSH和 ASC等还原性物质.GSH(7-Glu.Cys.Gly)是存在于 植物组织中的一种低分子量巯基复合物,为植物生 长储备大量的非蛋白还原性巯基,同时也是植物体 内重要的抗氧化物质及信号分子?.前文已经 报道,0.1和1mmol/L的NO供体SNP分别对150和 300mmol/LNaCI胁迫下的小麦叶片氧化损伤有明显 的缓解效应,这与其能显着诱导盐胁迫下小麦叶片 SOD和CAT活性上升,延缓O和H2O:的积累有 关.本文的结果进一步证实0.1mmol/LSNP处理还 能显着诱导150mmol/LNaCI胁迫下小麦幼苗叶片 GSH水平的上升(P<0.05,图1-A),略微降低GSSG 的含量(图1.B),明显提高GSH/GSSG(P<0.05,图 1.C);此外还诱导了ASC含量以及APX活性的增加 (图3).这些也可能是SNP处理下的小麦幼苗叶片 对盐胁迫下过量积累ROS的应激反应,从而最终增 强盐胁迫下小麦幼苗叶片的抗氧化能力,缓解其氧 化损伤.至于NO处理对叶片GSH水平起显着诱 导作用(图1.A),可能与其对GSH合成代谢途径限 速酶编码基因的上调有关.例如,以老鼠星形胶质 细胞(astrocyte)为材料的研究表明,NO供体处理24 h可以提高GSH水平大约1倍,且与7.谷氨酰半胱 氨酸合成酶(7-glutamyleysteinesynthetase,也称为7. glutamate.cysteineligase,GCL)的转录本和酶活性的提 高呈正相关?. 与上述结果相对应,外源NO供体SNP处理还 持续提高了盐胁迫下小麦幼苗叶片GR的活性(图 2-A),这与Uchida等发现外源SNP提高盐胁迫2d 时水稻幼苗GR活性的结果相一致.暗示外源NO 还可能作为信号分子上调GR活性,还原GSSG为 GSH,从而维持盐胁迫下小麦幼苗叶片高水平的 GSH和合适的GSH/GSSG比例,并在保持细胞的氧 化还原势方面发挥重要的作用.已有证据表明, GSH/GSSG比(非GSH的绝对含量)可以作为细胞内 的信号分子,从而对相关基因表达, 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 速率,蛋白 质巯基化以及酶活性调节进行直接调控.同时, 超量表达GR的转基因植物耐盐性亦显着提高. 笔者已经发现,0.1mmol/L的SNP处理提高小麦幼 苗的耐盐性可能与NO对小麦幼苗根部质膜H. ATPase和焦磷酸酶活性的诱导,以及显着提高K 水平和K/Na比有关.结合本试验的结果,也 不排除外源NO处理可能通过上调GR活性,改变 GSH/GSSG,并通过其信号作用来完成对盐胁迫下小 麦幼苗耐盐性调节的可能性. 除GR外,0.1mmol/L的SNP处理还极显着地 提高了盐胁迫下小麦幼苗叶片的GST活性(P< 0.01,图2.B).已经知道,GST通过催化植物细胞内 GSH与包括膜质过氧化物以及DNA氧化降解产物 在内的有害代谢物的结合,从而实现细胞解毒功 能.加.因此,耐盐性的提高也可能与GST的解毒功 能有关.DeHedonne等已经证实了NO作为信号 分子参与调节植物超敏反应中GST的表达,而H2O: 对大豆细胞GST的表达同样也具有一定的诱导效 应,且外源NO诱导大豆细胞GST的基因表达也 依赖于H:O:的参与.实际上,GST基因表达的提高 已经成为胁迫条件下植物适应性反应的标志之一. 此外,GST对生长素表现出极大的亲和性,而生长素 调节的GST活性同时为水杨酸(SA)所诱导]. 有证据表明,NO可以诱导植物体内SA的合成], 而NO与SA的功能亦表现出极大的相似性].据 此推测,NO诱导盐胁迫下小麦幼苗叶片GST活性 还可能与盐胁迫下NO与SA和生长素之间的互作 有关. 此外,外源NO供体SNP还缓解了盐胁迫下小 麦幼苗叶片ASC含量的下降(图3.A),这可能与 SNP处理改变盐胁迫下植物胞内的氧化还原状态有 关.GSH是催化ASC合成的关键酶双脱氢抗坏血 酸还原酶(DHAR)的底物,而外源NO处理提高了 盐胁迫下小麦叶片GSH的含量(图1.A),可能部分 促进了ASC含量的上升(图3.A);同时,ASC也是 H:O:清除酶APX的底物,与离体材料的结果n 所不同的是,ASC含量的上升有利于连体小麦叶片 APX活性的上调(图3B),当然也不排除NO作为信 号分子诱导APX基因表达的可能性’. 最近,Chandok等首次发现受病原菌诱导的 第9期阮海华等:外源一氧化氮供体对盐胁迫下小麦幼苗叶片谷胱甘肽抗氧化酶系统的影响1149 烟草诱导性一氧化氮合酶(iNOS)是一种甘氨酸脱羧 酶复合体(glycinedecarboxylasecomplex,GDC)P蛋白 的变体形式,可以催化植物内源性NO的产生. 2004年Bethke等 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ,在酸性条件下,大麦根部 组织的亚硝酸盐能通过非酶促还原途径直接产生内 源NO.结合本研究结果,今后应该开发环境友好型 的生长调节剂,通过化控手段或者相应基因的遗传 操作来直接或间接调节农作物内源NO的合成,从 而有效提高在各种胁迫条件下农作物的耐(抗)逆 性. ltefer_ences l1JZIluJK.Plantsalttolerance.ntis眦Sc,2001.6:66—71 [2]ForysrCH,Deseourvi~rnsP,KunertKJ.Protectionagainstoxygen radicals:animportantdefensemechanismstudiedintransgenicplants. 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