导师制实验报告-肠道菌群检测-模板

导师制 实验报告 化学实验报告单总流体力学实验报告观察种子结构实验报告观察种子结构实验报告单观察种子的结构实验报告单 -肠道菌群检测-模板 三级学科 微生物学及检验 项目编号码_______________ —— 实验名称: 肠道菌群分离培养、鉴定及药敏 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 学生姓名: 曾正勇 年 级: 2013医检1班 专 业: 医学检验学 指导教师: 王健 教授 实验日期: 2015年11月4日 安徽理工大学医学院 二O一五 年 十一 月 一、实验概述 细菌:广义的细菌即为原核生物。是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区(nuclear region)(或拟核)的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌(eubacteria)和古生菌(archaea)两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。 肠道菌群是肠道菌群，人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，如B族维生素(维生素B1、B2、B6、B12)，维生素K，烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，如天冬门氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应.根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominant mieroflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。 ?主要(优势)菌群:指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10,10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。 ?次要菌群:数量在10,10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。乳杆菌在数量上归为次要菌群，在回肠中含量较高，但是其具有较为重要的功能，因此在功能上归属于优势菌群。 优势菌群与微生境的特征密切相关，以厌氧菌为主的优势菌群，一般生存在清除速率较低、营养丰富的微生境，如结肠，所以菌群密集度和多样性高;而兼性或需氧菌群一般生活在清除速率高的微生境，如小肠近端，其菌群密集度和菌群多样性较低，由于菌群密集度低，很难称得上是“优势菌群”;在酸性微生境中，耐酸、产酸的细菌成为优势菌群。微生境的改变，可使菌群中的优势菌群发生替换，如便秘时大便优势菌群主要是革兰阴性厌氧菌，慢性腹泻时常见革兰阳性杆菌为优势菌群，而在严重急性腹泻时大便中的优势菌群为致病性细菌或某些兼性/需氧细菌。在肠道中，尽管专性厌氧菌是主要菌群，占据优势，但这些菌群又依赖于需氧菌或兼性厌氧菌等次要菌群的存在，因为后者在增殖过程中消耗氧气，保证前者的生长条件。一个生理性组合的肠道菌群是有益的，而病理性组合的肠道菌群是有害的。 人体肠道内的微生物中，超过99%都是细菌，存活着数量大约有100兆个，有500,1000个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类:有益菌、有害菌和中性菌。 有益菌，也称之为益生菌，主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，是人体健康不可缺少的要素， 可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。 有害菌，数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能。 中性菌，即具有双重作用的细菌，如大肠杆菌、肠球菌等，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。 人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因此，人体在正常情况下，菌群结构相对稳定，对宿主表现为不致病。有研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到70%，普通人则是25%，便秘人群减少到15%，而癌症病人肠道内的益生菌的比例只有10%。 药敏试验是指体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验(AST)，是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法(包括琼脂和肉汤稀释法)，抗生素浓度梯度法(E-test法)，和自动化仪器等。 本实验以在校医学生粪便标本为样品，探讨肠道菌群的分离、培养、鉴定和药敏，了解在校医学生肠道菌群分布状况及对常用抗生素的敏感性，为预防肠道细菌感染和合理使用抗生素提供实验依据。 二、实验目的和意义 1、掌握培养基的配制方法 培养基的配置过程主要包括:调配、溶化、校正pH值、澄清过滤、分装、灭菌及检定和保存。调配:溶化:校正pH值:澄清过滤:分装:灭菌:鉴定:保存: 2、熟悉湿热灭菌的原理和应用 湿热灭菌一般采用高压蒸汽灭菌，在103.4KPa蒸汽压下，温度能达到121.3?维持15~20分钟，就能杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物，是一种彻底的灭菌方法。 3、掌握肠道标本的采集方法 标本的收集、存放与运送的得当与否，直接关系到检验结果的准确性。应采取新鲜粪便，盛于洁净、干燥无吸水性的有盖容器内，不得混有尿液、水或其他物质，以免破坏有形成分，使病原菌死亡和污染腐生性原虫、真菌孢子、植物种子、花粉易混淆检验结果。采集标本时应用干净竹签选取含有粘液、脓血等病变成分的粪便;外观无异常的粪便须从表面、深处及粪端多处取材，其量至少为大拇指末段大小(约5g)。标本采集后一般情况应于1h 内检查完毕，否则可因p H 及消化酶等影响导致有形成分破坏分解。 4、掌握肠道正常菌群、肠道致病菌和肠道条件致病菌 肠道正常菌群:指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，对人体有益无害并与人体保持平衡。肠道致病菌:除大肠正常菌群之外可导致疾病发生的菌种，主要是沙门氏菌、志贺氏菌变形杆菌、大肠埃希菌耶尔森菌;肠道条件致病菌:与人体共同生活，以兼性厌氧菌为主是肠道非优势菌群，如肠球菌，肠杆菌，在肠道微生态平衡时，对人体无害，但在特定条件下会具有一定的致病性。 5、掌握肠道菌群在肠道选择培养基上的生长特点 肠道菌群在选择性培养基上生长特点:肠道菌群需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑湿润，液体培养基混浊生长。 6、掌握肠道菌群的生化反应 肠道菌群生化反应活泼。乳糖发酵试验:肠道非致病菌+，肠道致病菌-(除外变形杆菌)。肠杆菌科定科试验主要项目是革兰阴性杆菌、触酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阳性。 7、掌握肠道菌群的鉴定要点 鉴定肠道菌群首先要保证粪便的新鲜且没有受到污染，掌握菌落的基本形态特征，要熟悉各种菌落的生化反应的特点。 8、掌握细菌的药敏试验 体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验(AST)，是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参考，并提高疗效 三、实验应具备的物质条件 1、试剂:革兰染液，触酶及氧化酶试剂，蒸馏水等。 培养基:ss培养基，麦康凯培养基，普通培养基，半固体培养基，克氏双糖铁培养基 系统生化管:J2026纤维二糖 杭州微生物试剂有限公司 批号 20071109 J2019木糖 杭州微生物试剂有限公司 批号 20080108 J2018阿拉伯糖 杭州微生物试剂有限公司 批号 20080527 J2044七叶苷 杭州微生物试剂有限公司 批号 20080102 J2016甘露醇生化管 杭州微生物试剂有限公司 批号20070914 β-半乳糖苷(OPNG) 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090422 麦芽糖 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090331 枸橼酸盐生化管 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090409 赖氨酸脱羧酶生化管 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090325 尿素生化管 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090317 精氨酸脱羧酶生化管 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090105 鸟氨酸脱羧酶生化管 杭州微生物试剂有限公司 批号 20090219 药敏纸片: 氯霉素 (30ug/片) 杭州微生物试剂有限公司 批号 20150305 庆大霉素(10ug/片) 杭州微生物试剂有限公司 批号 20150202 环丙沙星(30ug/片) 杭州微生物试剂有限公司 批号 20150210 红霉素 (15ug/片) 杭州微生物试剂有限公司 批号 20150106 青霉素 (10ug/片) 杭州微生物试剂有限公司 批号 20150209 2、仪器:恒温培养箱，干烤箱，高压灭菌锅，半自动生化分析仪，水平离心机，显微镜等 3、其他:接种环，酒精灯，火柴，试管架，记号笔，载玻片 四、注意事项 1天平的使用:称量前要注意天平的调平，应先把游码归零，放上称量纸后在调平天平，称量时务必做到“左物右码”称量后把天平放回原处。 2在配置半固体(动力)培养基和克氏双糖铁培养基时，按参加实验的人数配适量的培养液，并注意各种试剂之间和水的比例。 3在配置培养基时注意培养基的pH纸(一般肠道细菌的最适pH值为7.2~7.6，配置的培养基的pH值应为7.4~7.6)。 4用手提式压力蒸汽灭菌器灭菌，在灭菌前应核对排气阀是否处以开的状态，而安全阀应处于关闭的状态。 5制备克氏双糖铁斜面培养基时，从高压灭菌锅中取出趁热放置成高层斜面，放置过程中禁止试管滚动，待凝固后放入冰箱保存，作无菌试验备用。 6高压蒸汽灭绝菌锅的使用原则 严格按照高压蒸汽灭绝菌锅的使用原则使用，使用前务必检查高压蒸汽灭绝菌锅中的水是否符合加热的要求，通电前检查排气阀是否开启，安全阀是否关闭，待冷气排尽关上排气阀安全阀开始喷漆时开始计时，等指针回到原位时才能打开盖子，注意切断电源。 7取粪便细菌标本:要取新鲜的粪便(不能超过2小时)份量在1克左右，严禁粪尿混合，正常标本取表面，异常标本取粘液或脓血部分。 8可疑菌落的鉴别:在SS培养基上如果出现可疑菌落如黑色菌落，应要鉴定其种属。 9生化反应的判断和分析:在做生化鉴定时应注意生化管前后对照，以便判断实验结果。 10药敏试验分析:在做药敏实验时，采用密集画线发，要尽量画的密，画的均匀，使之呈均匀分布，放药敏纸片要注意各个纸片之间的距离和培养皿壁的距离。测量结果是要多次测量取其平均值。 五、实验设计原理 1、采用分离划线法分离培养肠道细菌 平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细菌用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细菌，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。用于目的微生物的分离，便于得到目的性状的单克隆。 2、采用初步生化反应和系统生化反应鉴定肠道致病菌和肠道条件致病菌 初步生化反应和系统生化反应鉴定肠道菌群是借助各种肠道细菌具有的各自酶系统对底物的分解能力及其代谢产物的不同来进行的。而这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。初步生化反应时，根据革兰染色阴性或者阳性结果进行触酶或者氧化酶反应，然后由初步生化结果再在各种生化反应培养基中加入单个菌落，培养24或者48小时读取结果，根据各主要菌属(钟)之间的一些主要生化特性鉴别菌落。 3、以K-B法检测细菌药物敏感性 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈俞大，MIC俞小。 六、实验方法、步骤 1、培养基的制备 (1)半固体(动力)培养基的制备 把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2~0.7%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。 1.配料 配方换算?在容器中加入少量水〔蒸馏水，自然水〕?按照配方称取各种药品〔依次加入〕?加足所需水量《一药一勺，取药后立即盖上瓶盖》。 2.溶解 淀粉溶解:少量冷水调成糊状;加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95,97? ，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。 3.调PH 用1N的盐酸或的1N NaOH把培养基调节到所要求的值。 4.过滤 滤纸或棉花进行过滤。 5.分装 一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。 (1)三角瓶 若作静置培养，则100 ml培养基/250 ml的三角瓶，最多不能超过150 ml培养基 /250 ml的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌;若作摇瓶培养，则15,20 ml培养基/250ml的三角瓶，保证通气良好。 (2)试管分装 液体培养基一般装4,5 ml，约试管的1/4高度;固体斜面培养基一般装3,4 ml，约试管的1/5高度。 6.包扎 分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。 7.灭菌 按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。 8.摆斜面 灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。 9.贮存 培养基在30?下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8?冰箱中备用 (2)克氏双糖铁培养基的制备 成分:蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g乳糖 10g葡萄糖 1g氯化钠 5g柠檬酸铁铵 0.5g硫代硫酸钠 0.5g琼脂 12g酚红 0.025g蒸馏水 1000mLpH7.4 将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121?高压灭菌15min。放置高层斜面备用。 (3)SS培养基的制备 SS琼脂为强选择性培养基。其成分除了有必要的胨、牛肉膏等氮、碳源外，其他则为选择性抑制剂和缓冲剂。可用于志贺菌和沙门菌的分离。一类是基础培养基，还有一类是完全培养基。 基础培养基: 配方 g/L 牛肉5 膏 脙胨 5 三号3.5 胆盐 琼脂 17 溶于1000mL蒸馏水中混合均匀。121?高压灭菌15min，保存备用。 完全培养基 配方 g/L 牛肉膏 5 脙胨 5 三号胆盐 3.5 琼脂 17 乳糖 10 柠檬酸钠 8.5 硫代硫酸钠 8.5 10%柠檬酸铁10mL 溶液 1%中性红溶液 2.5mL 0.1%煌绿溶液 0.33mL 加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀，校正至pH7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。 注:?制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用。 ?煌绿溶液配好后应在10d以内使用。 ?可以购用SS琼脂的干燥培养基。 (4)MacConkey培养基的制备 原料成分:蛋白胨 17g脙胨 3g猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g氯化钠 5g琼脂 17g蒸馏水 1000ml乳糖 10g 0.01%结晶紫水溶液 10mL 0.5%中性红水溶液 5mL 1 将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL 加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121?高压灭菌15min备用。 2 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50,55?时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后 倾注平板。 注:结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。 2、少许新鲜粪便标本(1g?)分离培养 将新鲜粪便接种于SS或麦康凯平板35?孵育24h。 3、以灭菌接种环沾取粪便部分少许，分别以3区划线法接种于SS、MacConkey平板，37?温箱孵育18~24h ? ? ? ?先在火焰上给接种环灭菌，室温冷却。 ?小心挑取新鲜粪便少许，分别划线SS、MacConkey平板。 ?用灭菌的接种环从1区划线分离接种，于1区线交叉3次左右，为2区。 ?同样方法进行第3区分离划线。使粪便标本细菌在肠道选择平板上呈梯度递减分布态势，以获取典型的单个菌落。 ?盖好皿盖，倒置(防止水分蒸发)平皿，置35~37?恒温培养箱18~24小时。 ?取平皿观察记录培养结果，置4?冰箱备存，用于后续实验。 4、分别取正常菌落和可疑菌落行Gram’s stain染色、镜检，观察记录细菌形态和染色特征 ?在培养基中用接种环分别挑取正常菌落和可疑菌落涂在载玻片上。 ?固定:细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰中通过3次。 ?进行革兰染色:a初染，将结晶紫染液加于制好的涂片上，染色1min，用细水冲洗，甩去积水。b媒染，加卢戈碘液作用1min，用细水冲洗，甩去积水。c脱色，滴加95%酒精数滴，摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止，用细流水冲洗，甩去积水。d复染，加稀释石炭酸复红染0.5min，用细流水冲洗，甩去积水。 ?在显微镜下(油镜)观察肠道细菌的形态，并记录其结果。 5、分别取正常菌落和可疑菌落行KIA、MIU初步生化反 由于KIA培养基含乳糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵和酚红指示剂，用针穿刺，取单个菌落，穿刺至底部3-5mm处，然后在斜面上往复划线。放35度培养18-24小时。动力、吲哚及脲酶(MIU)复合试验将大肠埃希菌和普通变形杆菌穿刺线接种于MIU培养基，35摄氏度，18-24h，观察动力和脲搜索酶反应后，再滴加吲哚试剂。 6、分别取正常菌落和可疑菌落行系统生化反应 用接种针分别取单个正常菌落和可疑菌落接种两套的各个系统生化管，35摄氏度培养18-24小时观察系统生化管结果。 7、分别取正常菌落和可疑菌落行单纯药敏试验, ?在培养基中用接种针分别挑取正常菌落和可疑菌落分别用密集画线法接种于MH药敏培养基，使待检细菌在MH培养基上近似均匀分布。 青 丁 红 氯 ‘ ‘ 庆 密集画线 药敏纸片均匀贴在培养基上 青 红 丁 氯 ‘ ‘ 庆 药敏实验结果 ?在含菌的MH培养皿中均匀贴上不同药敏纸片(氯霉素药敏纸片、庆大霉素药敏纸片、青霉素药敏纸片、红霉素药敏纸片、丁胺卡那药敏纸片)，使药敏纸片呈梅花状分布。 ?将MH培养皿放于37?恒温培养箱18~24小时，并观察抑菌环大小，测量、记录抑菌环直径。 8、取可疑菌落做迁徙实验 ?用灭菌过的接种环取可疑菌落，点状接种在普通培养基上。 ?将普通培养基放于37?恒温培养箱18~24小时，并观察记录有无迁徙生长现象。 七、实验路线及方法变更 粪便标本,1g?, , SS、MacConkey平板 ,18~24h 可疑菌落、正常菌落 , , , Gram’s stain染色 初步生化 纯培养,SS或MacConkey平板, , , , 镜检 系统生化 大肠杆菌质粒DNA抽提 , ? ? , 验证染色镜检在肠道 血清学检查 药敏试验 OD260/OD280比值测定 G-杆菌鉴别诊断价值 , , 单纯药敏试验 确定DNA纯度 , 联合药敏试验 八、实验内容与预期目标 1、实验内容 ?培养基的制备 ?粪便细菌标本的分离培养 ?可疑菌落的染色镜检 ?可疑菌落的生化反应 ?细菌的药敏试验 ?迁徙实验 2、预期目标 ?掌握各种培养基的配置方法和鉴定 ?学会湿热灭菌和高压蒸汽灭绝菌锅的使用方法 ?掌握肠道细菌分离培养方法和步骤 ?掌握肠道细菌的鉴定方法、鉴定要点和步骤 ?掌握K-B法细菌药敏试验 九、结果 1、肠道细菌在肠道选择培养基上的生长特点 肠道菌群在MacConkey平板呈粉红色的菌群，呈条状分布，且分布不规则均匀;在SS上呈乳白色点状生长，从一区到四区递减分布。具体情况见图13~图17。 2、可疑菌落的涂片、革兰氏染色、镜检 可疑菌落在显微镜下(油镜)看到为红色菌落，是革兰氏阴性菌，菌体两端钝圆，有明显的多形性，呈球型或丝状，分布不均匀，成团或成簇分布。具体情况见图25~图28 3、肠道细菌的初步生化反应 正常菌落的初步生化反应结果:产酸产气，动力实验为阳性;可疑菌落在KIA培养基中呈黑色分布，产硫化氢，培养基底部有小个空泡，在斜面上呈点状菌落分布，在MIU培养基中，细菌沿穿刺线放射生长，动力试验呈阳性。具体情况见图19~图21。 4、肠道细菌的系统生化反应 可疑菌落的系统生化反应结果是:甘露醇黄色呈阳性，，麦芽糖黄色呈阳性，七叶棕色呈阴性，枸橼酸盐绿色呈阴性，赖氨酸紫红色呈阳性，精氨酸浅棕色呈阳性，鸟氨酸淡黄色呈阳性，尿素黄色呈阴性，硫化氢黑色呈阳性，蛋白胨水红色呈阳性，纤维二糖蓝色呈阴性，VNPG黄色呈阳性。具体情况见图22~图24 5、肠道细菌的K-B法药敏试验 根据抑菌圈的大小(不同抗生素其抑菌圈大小的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 不一致)，判断为敏感(S)，耐药(R)或中介度(I)。用刻度尺量的抑菌圈如下，具体情况见图29~图32 氯霉素 (2.5cm) 庆大霉素 (R) 环丙沙星 (2.8cm) 红霉素 (R) 青霉素 (R) 6、可疑菌落的迁徙实验 可疑菌落在普通琼脂平板上可蔓延波纹状薄膜布满整个培养基表面，迁徙生长实验呈阳性。具体情况见图18。 肠道细菌分离培养与鉴定 图1:学生在普通实验室进行实验 图2:教师在实验室指导学生进行实验 图3:主要实验试剂 图4:主要实验试剂,KIA～自制, 图5:主要实验仪器-恒温培养箱、干烤箱 图6:主要实验仪器-高压灭菌锅 图7:主要实验仪器-半自动细菌生化分析仪 图8:主要实验仪器-定量PCR仪 实验结果 图9:主要实验仪器-5415D型速离心机 图10:主要实验仪器-Microfuge 18型高速离心机 图11:主要实验仪器-斜角式离心机 图12:主要实验仪器-水平式离心机 肠道菌群分离培养与鉴定 图13:肠道菌群在SS、Mac培养基生长情况 图14:肠道菌群在SS、Mac培养基生长情况 图15:肠道菌群在SS、Mac培养基生长情况 图16:肠道菌群在SS、Mac培养基生长情况 图17:大肠杆菌在分离培养基生长情况 图18:变形杆菌迁徙生长现象 图19:大肠杆菌接种KIA、MIU培养基,培养前, 图20:大肠杆菌接种KIA、MIU培养基生长情况 肠道菌群分离培养与鉴定 图21:大肠杆菌在KIA、MIU培养基生长情况 图22:大肠杆菌在KIA、MIU培养基生长情况 图23:大肠杆菌系统生化反应结果,反应前, 图24:大肠、变形杆菌在KIA、MIU培养基生长情况 图25:大肠杆菌 Grame’s stain ×1000 图26:大肠杆菌 Grame’s stain ×1000 肠道菌群分离培养与鉴定 图27:大肠杆菌 Grame’s stain ×1000 图28:大肠杆菌 Grame’s stain ×1000 图29:MH细菌药敏培养基 图30:K-B法药敏实验 图31:K-B法药敏实验结果-3 图32:K-B法药敏实验结果-4 十、讨论 肠道菌群是指一大类存在于人类和动物肠道内的形态、生物学特性十分相似的G-杆菌，大多数细菌对人体有益，广泛分布在自然界中，包括植物、土壤、水、以及人和动物的肠道。多数是人肠道正常叫菌群的重要成员在机体的其他部位较少。如大肠杆菌能合成人体所需的VitB12、VitK、叶酸等，它们彼此相互联系、相互依存，共同维持肠道内微环境的稳定。少数细菌可引起人类腹泻或肠外感染，其中具有肯定致病作用的细菌有志贺氏菌属、沙门氏菌属、耶尔森氏菌属等;具有条件致病作用的细菌有枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、粘质沙雷氏菌属、变形菌属等。当宿主抵抗力下降、寄居部位改变或肠道菌群失调，则可引起肠内或肠外感染。 1、肠道细菌在肠内的分布特点和功能 健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物称为肠道菌群。在人类胃肠道内的细菌可构成一个巨大而复杂的生态系统，一个人结肠内就有400个以上的菌种。从口腔进入胃的细菌绝大多数被胃酸杀灭，剩下的主要是革兰氏阳性需氧菌。胃内细菌浓度<10 3 CFU/ML(CFU即colony forming unit 菌落形成单位)小肠菌群的构成介于胃和结肠之间。近端小肠的菌丛与胃内相近，但常能分离出大肠杆菌和厌氧菌。在远段回肠，厌氧之间。近端小肠的菌丛与胃内相近，但常能分离出大肠杆菌和厌氧菌。远段回肠，厌氧菌的数量开始超过需氧菌，其中大肠杆菌恒定存在，厌氧菌如类杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属，都有相当数量。在回盲瓣的远侧，细菌浓度急剧上升，结肠细菌浓度高达10.11 ,10.12 CFU/ml，细菌总量几乎占粪便干重的1/3。其中厌氧菌达需氧菌的10.3 ,10.4 倍。主要菌种为粪杆菌属、双岐杆菌属和真杆菌属。 正常菌群的功能:1、吸收水分，粪便较软，较易排泄。在胃部分解消化的食物，经由小肠吸收营养后，成为粘稠状物体送至大肠。然后再经过18小时将水分及矿物质吸收，就变成容易排泄的粪便。肠道内环境良好时，粪便的软硬适中，排便会较为顺利。 2、缓和的蠕动，能顺利将粪便排出藉由肠的蠕动，将粪便缓慢的推送至肛门。如果蠕动过快或太慢，都将影响粪便的构成，导致便秘或者腹泻。而如果肠内干净，则蠕动的速度就相当的有规律，粪便可顺利排出。 3、有助维他命的合成。比菲德氏菌等好菌能维护肌肤的健康，并具有合成有助热量产生的维他命B1、B2及B6等，以及与止血、骨骼形成有关的维他命K等之功用。健康的肠道，好菌会不断繁殖，维他命的合成也可顺利进行。 4、迅速排出有害物质。健康的肠道并非完全没有坏菌的存在，有害物质多少会产生。当然还包括，吃进体内的食品化学添加物或是无法成为营养成分的物质。只要肠内环境良好，这些物质在开始危害身体前就被排出体外。 5、避免病原菌的侵害比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身体的免疫机能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特质，所以像是含有好菌的乳酸饮料或健康食品等，都可抑制病原菌在肠内繁殖。 肠道有菌群除了以上功能之外，对人体还有营养作用，如糖尿病、高血压、高血脂等。B族维生素 和非必需氨基酸对人类的毛发具有重要的作用，当缺少这些营养元素，会导致头发脱落或毛发发黄、发叉，容易折断等现象。 致病菌群的功能:当机体处于有害菌侵袭时，往往会肠内黏膜粗糙，血液不流通而呈暗红色。主要表现为1、排泄不顺畅，肠内囤积粪便为帮助排便，粪便的软硬程度要适中，但不健康的肠则因膳食纤维的不足，导致粪便囤积大肠，无法顺利排泄;又或者是因坏菌的繁殖引起细菌感染，而产生腹泻的发生。 2、蠕动过快或太慢肠不健康，可能会影响肠的蠕动速度过快或太慢，妨碍粪便顺利排出。粪便更会因此变太硬或太稀，最终导致便秘，肠道中过路菌群更因此加速繁殖，如此恶性循环下去。 3、产生有害物质。不健康的肠道是坏菌繁殖的绝佳场所，大量的坏菌会导致阿摩尼亚，硫化水素 及粪臭素等有害物质的产生。这些物质不但是恶臭屁的来源，更会加速肠壁的老化，产生导致癌症 的物质，成为大肠癌的发病根源。 4、再次地吸收对身体有害的物质。有害物质不会乖乖地待在肠内，它会随着肠的吸收而跟着血液循环全身，引起疲倦、肌肤干燥、头痛、呕吐等身体不适，会发生恶臭的物质更会经由血液，透过嘴巴或身体而散发出来。 5、病原体容易侵入不健康的肠内，乳酸菌等好菌的量会变少，肠内呈碱性。另外，因坏菌所产生的有害物质使肠壁所具有的免疫功能下降，导致肠内杀菌作用变弱，细菌或病原菌更容易侵入。 2、标本采集，分析采集标本的影响因素: 在临床上采集粪便标本时应用干净竹签选取含有粘液、脓血等病变成分的粪便;外观无异常的粪便须从表面、深处及粪端多处取材，其量至少为大拇指末段大小，采取新鲜粪便，应盛于洁净、干燥无吸水性的有盖容器内，不得混有尿液、水或其他物质，以免破坏有形成分。采集标本的影响因素:在采集粪便时，粪便和尿液混合，你尿液中的尿酸会破坏粪便的正常环境，影响正常粪检。采集的标本如果放在不合适的容器内，也会影响检验结果。 3、在肠道选择培养基上菌落特征 在培养基培养时无需添加生长因子，向培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。 4、肠道选择培养基上菌落Gram’s stain特点 选择培养基菌落革兰染色后，菌落被染色成紫红色，菌落散在或者聚集成簇存在。 5. 细菌典型生化反应及其概率 细菌生化反应:各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 6. 细菌的鉴定要点 ,1,细菌的形态学检查:细菌的形态学检查包括不染色标本检查法和染色标本检查法，显微镜是观察细菌形态所必备的基本工具。镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对某些细菌，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等，通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。 ,2,细菌的生化反应:由于细菌产生的酶系不同，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来鉴定细菌，这种生化反应测定方法也称生化试验。细菌的生化试验是将已分离纯化的待检细菌，接种到一系列含有特殊物质和指示剂的鉴别培养基中，观察该菌在这些培养基内的pH变化，或是否产生某种特殊的代谢产物，现代细菌学已普遍采用微量、快速、自动化等鉴定系统，已有很多相应的配套试剂供种属鉴定使用。 7、药敏结果分析，分析抑菌圈产生的机制，分析抑菌圈大小的意义，影响抑菌圈大小的因素，如何指导临床合理使用抗生素 综上所述，肠道细菌的形态学鉴定是简便、价廉、有效的方法，分离培养是肠道细菌鉴定的金标准，生化反应鉴定更能准确的鉴定细菌的种属(单一的生化反应不能准确鉴别应用联合的生化反应鉴定细菌的种属)。由于肠道细菌为一大群G-中等大小杆菌，形态学难以鉴别，少量初步生化反应不易鉴别，通常采用系统生化反应和血清学鉴定。肠道细菌对常用抗生素已具有一定耐药性，临床上一旦出现由此菌导致的感染，应选用敏感的抗生素。粪便标本中除常见的大肠杆菌外，还分离出普通变形杆菌，该菌 为条件致病菌，其对丁胺卡那、氯霉素、庆大霉素敏感，对青霉素、红霉素明显耐药。 十一、结论 1、肠道菌群是一类形态、生物学特性相似的G-杆菌，主要有大肠杆菌、克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、变形杆菌等 2、肠道细菌的形态学鉴定是简便、价廉、有效的方法，分离培养是肠道细菌鉴定的金标准 3、初步生化和系统生化反应在肠道菌群各属种的鉴定中有重要意义 4、药敏试验可准确筛选出耐药菌株，为合理应用抗生素提供可靠实验依据 参考文献 ? Scidmore MA, Fischer ER, Hackstadt T. T. Sphingolipids and glycoproteins are differentially trafficked to the chlamydia trachomatis inclusion[J]. J Cell Biol. 1996;134(2):363-374 ? 王健, 钱中清, 朱玉霞, 杨庆贵. 淮南工业学院学生肠道菌群初步调查[J]. 中国学校卫生, 2002;23(1):28-29. ? 刘恭植. 微生物学和微生物学检验[M].北京: 人民卫生出版社 1987.143-15 十二、导师意见 围绕实验目的、方法、技术路线、结果、分析讨论逐层分析，并注意文字表达是否流畅。 导师签名:_____________ 2013 年 10 月 31 日 十三、教研室意见 同意授课教师意见。 2015 年 11 月 4 日 十四、医学院意见 ? 优 ?良 ?中 ?差 2015 年 11 月 5 日 《测量学》模拟试卷 一、单项选择题(每小题1 分，共20 分) 得分 评卷人 复查人 在下列每小题的四个备选答案中选出一个正确的答 案，并将其字母标号填入题干的括号内。 1(经纬仪测量水平角时，正倒镜瞄准同一方向所读的水平方向值理论上应相差(A )。 A 180? B 0? C 90? D 270? 2. 1:5000地形图的比例尺精度是( D )。 A 5 m B 0.1 mm C 5 cm D 50 cm 3. 以下不属于基本测量工作范畴的一项是( C)。 A 高差测量 B 距离测量 C 导线测量 D 角度测量 4. 已知某直线的坐标方位角为220?，则其象限角为(D )。 A 220? B 40? C 南西50? D 南西40? 5. 由一条线段的边长、方位角和一点坐标计算另一点坐标的计算称为(A )。 A 坐标正算 B 坐标反算 C 导线计算 D 水准计算 6. 闭合导线在X轴上的坐标增量闭合差( A )。 A为一不等于0的常数 B 与导线形状有关 C总为0 D 由路线中两点确定 7. 在地形图中，表示测量控制点的符号属于(D )。 A 比例符号 B 半依比例符号 C 地貌符号 D 非比例符号 8. 在未知点上设站对三个已知点进行测角交会的方法称为(A )。 A 后方交会 B 前方交会 C 侧方交会 D 无法确定 9. 两井定向中不需要进行的一项工作是(C )。 A 投点 B 地面连接 C 测量井筒中钢丝长度 D 井下连接 10. 绝对高程是地面点到( C )的铅垂距离。 A 坐标原点 B任意水准面 C 大地水准面 D 赤道面 11(下列关于等高线的叙述是错误的是:(A ) A( 高程相等的点在同一等高线上 B( 等高线必定是闭合曲线，即使本幅图没闭合，则在相邻的图幅闭合 C( 等高线不能分叉、相交或合并 测量学试卷 第 24 页(共 7 页) D( 等高线经过山脊与山脊线正交 12(下面关于非比例符号中定位点位置的叙述错误的是(B ) A(几何图形符号，定位点在符号图形中心 B(符号图形中有一个点，则该点即为定位点 C(宽底符号，符号定位点在符号底部中心 D(底部为直角形符号，其符号定位点位于最右边顶点处 13(下面关于控制网的叙述错误的是(D ) A( 国家控制网从高级到低级布设 B( 国家控制网按精度可分为A、B、C、D、E五等 C( 国家控制网分为平面控制网和高程控制网 D( 直接为测图目的建立的控制网，称为图根控制网 14(下图为某地形图的一部分，各等高线高程如图所视，A点位于线段MN上，点A到点 M和点N的图上水平距离为MA=3mm，NA=2mm，则A点高程为(A ) A( 36.4m M B( 36.6m A C( 37.4m 37 N D( 37.6m 35 36 ,15(如图所示支导线，AB边的坐标方位角为，转折角如图，则CD边,,12530'30''AB A D 的坐标方位角,为( B ) CD100?100? 30 30 130?C B 30 ,,,,7530'30''1530'30''4530'30''2529'30''A( B( C( D( 16(三角高程测量要求对向观测垂直角，计算往返高差，主要目的是(D ) A( 有效地抵偿或消除球差和气差的影响 B( 有效地抵偿或消除仪器高和觇标高测量误差的影响 C( 有效地抵偿或消除垂直角读数误差的影响 D(有效地抵偿或消除读盘分划误差的影响 17(下面测量读数的做法正确的是( C ) A( 用经纬仪测水平角，用横丝照准目标读数 测量学试卷 第 25 页(共 7 页) B( 用水准仪测高差，用竖丝切准水准尺读数 C( 水准测量时，每次读数前都要使水准管气泡居中 D( 经纬仪测竖直角时，尽量照准目标的底部 18(水准测量时对一端水准尺进行测量的正确操作步骤是( D )。 A 对中----整平-----瞄准----读数 A 整平----瞄准----读数----精平 C 粗平----精平----瞄准----读数 D粗平----瞄准----精平----读数 19(矿井平面联系测量的主要任务是( D ) A 实现井上下平面坐标系统的统一 B 实现井上下高程的统一 C 作为井下基本平面控制 D 提高井下导线测量的精度 20( 井口水准基点一般位于( A )。 A 地面工业广场井筒附近 B 井下井筒附近 C 地面任意位置的水准点 D 井下任意位置的水准点 得分 评卷人 复查人 二、填空题(每空2分，共20分) 21水准测量中，为了进行测站检核，在一个测站要测量两个高差值进行比较，通常采用的测量检核方法是双面尺法和 。 22直线定向常用的标准方向有真子午线方向、_____磁北方向____________和坐标纵线方向。 23地形图符号一般分为比例符号、_半依比例符号_________________和不依比例符号。 24 井下巷道掘进过程中，为了保证巷道的方向和坡度，通常要进行中线和____________的标定工作。 25 测量误差按其对测量结果的影响性质，可分为系统误差和_偶然误差______________。 26 地物注记的形式有文字注记、 ______ 和符号注记三种。 27 象限角的取值范围是: 0-90 。 28 经纬仪安置通常包括整平和 对中 。 29 为了便于计算和分析，对大地水准面采用一个规则的数学曲面进行表示，这个数学曲面称为 参考托球面 。 测量学试卷 第 26 页(共 7 页) 。 30 光电测距仪按照测量时间的方式可以分为相位式测距仪和 差分 三、名词解释(每小题5分，共20分) 得分 评卷人 复查人 31(竖盘指标差 竖盘分划误差 32(水准测量 利用水准仪测定两点间的高差 33(系统误差 由客观原因造成的具有统计规律性的误差 34(视准轴 仪器望远镜物镜和目镜中心的连线 四、简答题(每小题5分，共20分) 得分 评卷人 复查人 35(简述测回法测量水平角时一个测站上的工作步骤和角度计算方法。 对中，整平，定向，测角。观测角度值减去定向角度值 测量学试卷 第 27 页(共 7 页) 36(什么叫比例尺精度,它在实际测量工作中有何意义, 图上0.1毫米在实地的距离。可以影响地物取舍 37(简述用极坐标法在实地测设图纸上某点平面位置的要素计算和测设过程。 38(高斯投影具有哪些基本规律。 测量学试卷 第 28 页(共 7 页) 得分 评卷人 复查人 五、计算题(每小题10分，共20分) 39(在1:2000图幅坐标方格网上，量测出ab = 2.0cm, ac = 1.6cm, ad = 3.9cm, ae = 及其坐标方位角α。 5.2cm。试计算AB长度DABAB 1800 A d b B a 1600 c e 1200 1400 40(从图上量得点M的坐标X=14.22m, Y=86.71m;点A的坐标为X=42.34m, MMAY=85.00m。试计算M、A两点的水平距离和坐标方位角。 A 测量学试卷 第 29 页(共 7 页) 测量学 标准答案与评分 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 一、 一、 单项选择题(每题1分) 1 A; 2 D; 3 C; 4 D; 5 A; 6 C; 7 D; 8 A; 9 C; 10 C; 11 A;12 D;13 B;14 A; 15 B;16 A;17 C;18 D; 19 A;20 A 二、 二、 填空题 (每空2分，共20分) 21 变更仪器高法 22 磁北方向 23 半依比例符号(或线状符号) 24(腰线 25(偶然误差 26(数字注记 27 大于等于0度且小于等于90度(或[0?, 90?]) 28 对中 29 旋转椭球体面 30 脉冲式测距仪 三、 三、 名词解释(每题5分，共20分) 31竖盘指标差:在垂直角测量中，当竖盘指标水准管气泡居中时，指标并不恰好指向其正 确位置90度或270度，而是与正确位置相差一个小角度x, x即为竖盘指标差。 32 水准测量:利用一条水平视线并借助于水准尺，测量地面两点间的高差，进而由已知点 的高程推算出未知点的高程的测量工作。 33 系统误差:在相同的观测条件下，对某量进行了n次观测，如果误差出现的大小和符号 均相同或按一定的规律变化，这种误差称为系统误差。 34视准轴:望远镜物镜光心与十字丝中心(或交叉点)的连线。 四、 四、 简答题(每题5分，共20分) 35 (1)在测站点O上安置经纬仪，对中，整平 (1分) (2)盘左瞄准A点，读数L，顺时针旋转照准部到B点，读数L，计算上半测回AB角度O=L-L; 1BA (2分) (3)旋转望远镜和照准部，变为盘右方向，瞄准B点读数R，逆时针旋转到A点，B读数R，计算下半测回角度O=R-R; A2BA (3分) (4)比较O和O的差，若超过限差则不符合要求，需要重新测量，若小于限差，则12 取平均值为最终测量结果 O = (O+O)/2 12 (5分) 36 图上0.1mm对应的实地距离叫做比例尺精度。 (3分) 测量学试卷 第 30 页(共 7 页) 其作用主要在于:一是根据地形图比例尺确定实地量测精度;二是根据地形图上需要表示地物地貌的详细程度，确定所选用地形图的比例尺。 (5分) 37 要素计算:从图纸上量算待测设点的坐标，然后结合已有控制点计算该点与控制点连线之间的方位角，进而确定与已知方向之间所夹的水平角，计算待测设点到设站控制点之间的水平距离。 (3分) 测设过程:在设站控制点安置经纬仪，后视另一控制点，置度盘为0度，根据待定方向与该方向夹角确定方向线，根据距离确定点的位置。 (5分) 38 高斯投影的基本规律是: 中央子午线的投影为一直线，且投影之后的长度无变形;其余子午线的投(1) (1) 影均为凹向中央子午线的曲线，且以中央子午线为对称轴，离对称轴越远，其长度变形也就越大; (2) (2) 赤道的投影为直线，其余纬线的投影为凸向赤道的曲线，并以赤道为对称轴; (3) (3) 经纬线投影后仍保持相互正交的关系，即投影后无角度变形; (4) (4) 中央子午线和赤道的投影相互垂直。 评分说明:答对一条得2分，答对三条即可得满分。 五、 五、 计算题(每题10分，共20分) 39 bd = ad – ab = 1.9cm， 因此?X = -38m; ce = ae – ac = 3.6cm, 因此?Y = -72m; (3分) (或由图根据比例尺和距离计算A、B两点的坐标) 因此距离为:81.413m (6分) AB的方位角为:242?10′33″ (10分) (方位角计算应说明具体过程，过程对结果错扣2分) 40 ?X = X – X = 28.12m, ?Y = Y – Y = -1.71m (2分) AMAM221/2 距离d = (?X + ?Y)= 28.17m (5分) 方位角为:356 ?31′12″ (应说明计算过程与主要公式) (10分) 可通过不同方法计算，如先计算象限角，再计算方位角。 说明:在距离与方位角计算中，算法公式对但结果错各1分 测量学试卷 第 31 页(共 7 页)