神经系统富亮氨酸重复超家族成员LRRN3C端结构域蛋白的原核表达和纯化

神经系统富亮氨酸重复超家族成员LRRN3C端结构域蛋白的原核 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达和纯化 生 命 科 学 研 究12 卷 第 3 期 No.3 第 Vol.12 年 月 Life Science Research 2008 9 Sep. 2008 第 3 期 神经系统富亮氨酸重复超家族成员LRRN3 C 端 结构域蛋白的原核表达和纯化 a, b*a, bbbaab , 蔡 艳, 黄 , 伍赶球, 杨 景, 罗学港 静芳杨河, 李 ( 中南大学 湘雅医学院 a.组织学与胚胎学系; b., 中国湖南 长沙 410013) 人体解剖学与神经生物系 摘 要: 神经系统富亮氨酸重复超家族成员 LRRN3 是一种重要的膜蛋白, 与神经系统发生发育和损伤后修复 密切相关. 运用多聚酶链式反应 ( PCR) 方法, 获得长 555 bp 的 DNA 序列, 扩增产物克隆至 pET21 , 质粒中 +, 在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白构建 Mal 和 His 融合表达质粒, 经 Ni-NTA agarose 亲和层析纯化获得融合 蛋白, 并以 Western blotting 鉴定, 为进一步研究 LRRN3 基因的结构和功能奠定了基础. 关键词: LRRN3; 融合蛋白; 蛋白纯化 中图分类号: Q786 文献标识码: A 文章编号: 1007-7847( 2008) 03-0227-05 Expr ession and Pur ification of C-Ter minal Domain in LRRN3, a Member of Neur on Leucine Rich Repeat Super family , , bab*baab, , , ,,CAI YanHUANG HeLI FangWU Gan-qiu YANG Jing ab, YANG JingLUO Xue-gang ( a. Department of Histology and Embryology; b. Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan, China) Abstr act : DNA sequence of C-terminal domain of LRRN3, a member of neuron leucine rich repeat superfamily, was obtained by PCR. A 555 bp sequence was cloned into expression vector pET21 to construct the Mal and His fusion protein. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 and the over expressed fusion protein of C-terminal domain was existed in inclusion bodies. The fusion protein + was purified with Ni - NTA agarose. Fusion protein was testified by Western blotting using anti-His monoclonal antibody. The foundation was based by this work to do further investigation on the structure and function of LRRN3. Key wor ds: LRRN3; fusion protein; protein purification ( , , ( ) : )Life Science Research2008123227,231 神 经 系 统 富 亮 氨 酸 重 复 ( Neuronal Leucine 构特点, 包含多个连续的 LRR 结构域以及 IgC2 [ 1] 样结构. LRR 蛋白从果蝇到哺乳动物高度保守, Rich Repeat, NLRR) 超家族是一类在神经系统特 异性表达的蛋白质超家族, 他们具有共同基因结 哺乳动物中已克隆了小鼠、大鼠、人、马等的同源 收稿日期: 2008-05-27; 修回日期: 2008-07-09 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30600224, 30700438) ; 中国博士后科学基金资助项目( 20060390886) ; 湖南省自然科学基金资 助项目( 06JJ30014) 作者简介: 杨静( 1977-) , 女, 湖南长沙人, 硕士, 中南大学湘雅医学院组织学与胚胎学系讲师, 博士研究生, E-mail: yangjing_197702@hotmail. com; 蔡艳( 1975-) , 女, 湖南津市人, 中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系讲师, 博士研究生, 并列第一作者, E-mail: caojicyan@yahoo. * com.cn ; 通讯作者: 黄河 ( 1975-) , 男, 湖南汉寿人 , 博士 , 中南大学副教授 , 主要从事神经系统发育的分子机理研究 , Tel : 0731- 2650436, E-mail: huanghe@xysm.net. 蛋白. 许多 LRR 蛋白如 slit , toll , tartan 和 flrt 等 根据预测的蛋白结构域 , 用 Primer Premier 与神经系统的发育、分化及 损伤后再生 密切相 5.0 软件设计重组体构建引物, 并在两端分别加[ 2~4] ;含有 IgC2 结构域的蛋白如神经细胞黏附 上 BamH 1 和 Xho I 酶 切 位 点 . 上 游 引 物 : 5′- 关 GCCGTCTCGGATCCGGGTCATTGAATATTAAAA 分子( NCAM) 与脊椎动物神经系统的发育同样有 [ 5] TAAGAG- 3 ′, 下 游 引 物 5 ′- GCCGTCTCCTCGAG 着 密 切 关 系 . 同 时 具 有 LRR 和 IgC2 结 构 的 GGACATACTTGTCGGCACACCT-3′, 由 Invitrogen NLRR 蛋白家族成员通过介导细胞间黏附, 参与Biotechnology Co., Ltd 公司合成. 根据 TRIzol 操 神经系统发育的一系列过程. 作指南, 从 SD 大鼠新鲜大脑组织提取总 RNA, 依 LRRN3( 又 名 NLRR3) 是 2001 年 Fukamachi 据 反 转 录 试 剂 盒 说 明 将 总 RNA 转 录 成 cDNA. 等克隆的 NLRR 超家族新成员, 编码 707 个氨基 以此 cDNA 为模板, 采用上述引物通过 PCR 扩增 酸, 基因表达主要通过 Ras-MAPK 信号传导通路 LRRN3 的 C 端基因片段. PCR 反应体系为: 95 ? 来调控. 通过 Northen 对 mLRRN3 基因表达谱进 变性 2 min; 94 ?变性 30 s, 55 ? 退火 30 s, 72 行初步检测, 发现该基因主要在大鼠中枢神经系 ? 延伸 1 min, 最后 72 ?延伸 6 min, 30 个循环. 统表达, 然而至今尚无人对其精细定位, 对 LRRN3 取 5 μL PCR 扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 [ 6, 7] 的生理功能和作用机制了解更少. 为深入研究 分析鉴定. LRRN3 在哺乳动物中的蛋白表达谱, 探讨 其在 神经系统发育、分化以及损伤后再生中的作用, 1.2.3 重组克隆载体的构建与鉴定 RT-PCR 产物经凝胶回收试剂盒回收后, 用 我们以 cDNA 文库为模板, 采用多聚酶链式反应 回收的目的 DNA 片段作为插入 DNA, 经 BamH I ( PCR) 扩增大鼠 LRRN3 的 C 端基因片段, 构建 和 Xho I 双酶切, 在 T连接酶作用下与用同种酶 4 融合蛋白重组表达载体并在大肠杆菌中表达. 切并线性化好的载体 pET21 连接. 载体与片段比 例 1?2, 反应温度 16 ?, 反应时间 16 h. 将重组 质粒导入感受态细菌 E.coli JM109 中, 具体方法 如下: 将 10 μL 连接产物加入 50 μl E.coli JM109 1 材料与方法 感受态细胞中, 冰上放置 1 h; 42 ? 热激 60 s; 1.1 材料 冰 浴 3 min; 加 入 400 μL 无 抗 性 LB 培 养 基 , RNA 抽提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、酶 +切产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒和 Ni -NTA agarose 购自 QIAGEN 公司.反转录试剂盒和 T连 4 接酶购自 PROMEGA 公司. 两种限制性内切酶购37 ?摇床培养 1 h; 离心,10 000 r / min, 1 min; 自纽英伦( NEB) 生物技术有限公司. 核酸相对分 100 mg / L 氨 弃上清, 将菌体重悬, 均匀涂在含 子 质 量 标 准 DNA Marker DL2000 为 TaKaRa 产 苄青霉素( Amp) 的 LB 琼脂平板培养基上, 37 ? 品. 蛋白质相对分子质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 购自上海生化所. 静置培养 14~20 h, 至长出大小适当、均一性较好 IPTG 为 Geneview 公司产品. HRP-抗 His 抗体购 的菌落. 挑选两个菌落 LRRN3-A 和 LRRN3-B, 将 自金思特科技有限公司. 其他化学试剂为进口或 挑选菌落在 5 mL LB 培养基培养过夜, 用质粒抽 国产分析纯产品. 表达载体 pET21-mal ( 末端用 提试剂盒抽提质粒, 并用内切酶 BamH I 和 Xho IHis 标记) 和感受态菌株 E.coli JM109 以及表达大 做酶切鉴定分析. 取鉴定正确的重组质粒样本送 . 为本室保存肠杆菌菌株 E.coli BL21 ( DE3) Invitrogen Biotechnology Co., Ltd 公司测序验证. SD 大鼠购自本校实验动物中心. 1.2.4 重组蛋白的原核表达与分析 将构建好的 表达载体转 化至原核 表 达 宿 主 1.2 方法 E.coli BL21( DE3) 感受态菌株中, 转化方法同上. 1.2.1 生物信息学分析 +将含重组表达载体的阳性转化菌株接种于 Amp 运用 DS gene 1.1 生物学软件对 Genbank 中 ( 100 mg / L) 的 LB 琼脂平板上, 37 ?过夜活化.大鼠 mLRRN3 基因序列( 登陆号: NM_030856) 进 取 100 mL 过夜培养物接种于 2 L 同种培养基中, 行结构和功能分析. 根据其跨膜结构域、亲水性 200~250 ×g, 37 ? 震荡培养 3.5 h, 至 A= 0.53600 和抗原性, 选择 C 端包含一个 FN ?样结构和小 时, 加入 至终浓度 , 诱导IPTG 1.0 mmol / L37 ?段胞浆内尾部序列的 185 个氨基酸( 555 bp) 的最 佳区域. 培养 5 h. 取 1.5 mL 菌液留样, 其它菌液转入大1.2.2 大鼠 LRRN3 分子 C 端序列的扩增 离心瓶, 4 000 ×g , 4 ?离心 20 min, 收集菌体, LRRN3 C 端结构域蛋白的原核表达和纯化 杨静等: 神经系统富亮氨酸重复超家族成员 第 3 期 229 用蛋白纯化试剂盒 buffer A PBS ( pH 7.5) 100 mL 切, 在 T连接酶的作用下与经相同酶切处理的载 4 体 pET21 连接后, 转化入 E.coli JM109 感受态细 弃 上洗 涤 细 胞 , 4 000 ×g, 20 min, 4 ?离 心 . 胞. 挑选两个阳性菌落抽提质粒并用 BamH I 和 清, - 80 ?冻存过夜. 样品菌液经 PBS ( pH 7.5) Xho I 酶切鉴定. 目的基因片段长约 0.5 kb, 线状 重悬, 室温放置 , 超声破碎, 离20 min10 000 ×g pET21 长约 5.4 kb, 重组质粒酶切产物分别在 550 心 10 min( 4 ?) , 分别收集上清和沉淀, 进行 常bp 和 5.4 kb 处出现条带( 图 2) , 与线性载体片段 规 SDS-PAGE 分析. 及目的片段大小相符, 表明重组质粒构建成功. 1.2.5 表达产物的纯化与鉴定 酶切鉴定正 确的重组质 粒样本经 Invitrogen 冻存细菌在冰上溶解 15 min, 按每克细菌 5 mL 体积加入 buffer B 裂解细菌, 室温下轻悬细胞 公司测序, 表明该插入序列与预期Biotechnology 15~60 min, 避免产生泡沫, 至溶液完全变透明.室 一致, 阅读框架完整, 并且无移码. 温下 10 000 ×g, 30 min 离心细菌裂解液, 收获上 +M 1 2 bp 清. 每 4 mL 裂解液上清加 1 mL 的 50% Ni-NTA +胶, 室温下轻摇 60 min. 将含有 Ni-NTA 胶的裂 解液上清灌入下端封闭的层析柱, 去掉层析柱下 端盖子, 让液体自由流出, 收集流穿液.用 buffer 2 000 1 000 + C 洗 Ni-NTA 胶, 共 两次,每次 4 mL, 用 buffer 750 500 E 洗脱重组蛋白, 共洗 4 次, 每次 0.5 mL, 收集 250 100 洗脱液并用 SDS-PAGE 分析. 1.2.6 Western blotting SDS-PAGE 电泳后的凝胶, 经电转仪将蛋白 用 HRP-抗 His 抗体 质转印到硝酸纤维素膜上, 图 2 重组质粒的双酶切鉴定 进行 Western blotting 分析. M: DNA Marker DL2000; 1: 重组体菌落 LRRN3-A 的酶切 产物; 2: 重组体菌落 LRRN3-B 的酶切产物. 2 结果 Fig.2 Identification of r ecombinant by r estr iction endonuclease digestion 2.1 C 端序列的 PCR 克隆及表达载体的鉴定 M: DNA Marker DL2000; Lane 1: LRRN3-A recombinant; 从 SD 大鼠大脑组织总 RNA 扩增出来的 RT- Lane 2: LRRN3-B recombinant. PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳, 产物基因片段长度 约 550 bp, 与预期扩增目的片段大小一致, 并且 2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 高度特异, 无其它特异性扩增条带存在( 图 1) . 将重组表达 载体 转 化 , 震E.coli BL 2137 ?回 收 的 PCR 产 物 经 BamH I 和 Xho I 双 酶 荡培养,加入 IPTG 至终浓度 1.0 mmol / L 诱导表 达 5 h. 样品菌液经超声破碎裂解后, 可溶与不 M 1 bp 可溶产物经 SDS-PAGE 分析表明表达产物主要存 在于不溶性包涵体中, 上清中几乎没有预期蛋白 带. 重组子不可溶性产物在相对分子质量约 61.8 kD 处有一较强的特异带, 与预期相对分子质量 2 000 相符, 为目的蛋白( 图 3) . 1 000 750 表 达 产 物 纯 化 后和2.3 SDS-PAGE Wester n 500 blotting 分析 250 +表达产物在变性状态下经 Ni-NTA agarose 层 100 析纯化后, SDS-PAGE 分析表明在相对分子质量 61.8 kD 处特异蛋白条带明显, 并且纯化效果良 图 1 PCR 扩增结果 好( 图 4) . Western blotting 分析显示新生的蛋白条 M: DNA Marker DL2000; 1: LRRN3 的 C 端扩增序列. 带可与抗 His 抗体结合, 分子质量大小约为 61.8 Fig.1 Result of PCR kD, 表明该蛋白条带即为 His 融合蛋白( 图 5) . M: DNA Marker DL2000; Lane 1: C-terminal domain sequence of LRRN3. 1 2 M kD 3 讨论 NLRR 蛋白超家族是一类重要的膜蛋白, 可 9466.2 通过多种作用介导细胞黏附, 与细胞运动及信号 45 传导密切相关. NLRR 蛋白在神经系统发生和发 35 育中有着重要作用. NLRR1、NLRR2 均与神经系 统的发育关系密切. 最近文献报道, 家族成员中 24 XlNLRR-6 也可能是参与后期晶状体、视网膜和 [ 8] 20 角 膜 发 育 的 的 关 键 调 控 分 子. 原 位 杂 交 显 示 LRRN3 主要在不同发育阶段的胚胎神经系统中 14.4 表达. 第 10.5 d 小鼠胚胎中可见 LRRN3 在三叉 神经节中高表达; 在背根神经节、神经管、后脑和 图 3 融合蛋白表达产物的 SDS-PAGE 电泳分析 视杯中亦有表达. 这些结果均提示其可能与胶质 M: 蛋白质分子质量标准; 1: 重 组 体 转 化 菌 株 37 ? 诱 导[ 9] 细胞和运动神经元的发生发育相关. Fukamache 5 h 的包涵体总蛋白; 2: 重组体转化菌株 37 ? 诱导 5 h 的上清总蛋白 .等发现LRRN3 可能与 EGF 受体信号传导的调控 Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expr ession pr oduct of 有关, 而这种作用可能正是通过其胞浆尾部序列 the r ecombinant 上 的 网 格 蛋 白 连 接 内 吞 模 体 ( clathrin binding M: Standard protein marker; Lane 1: Inclusion bodies of the [ 7] endocytosis motif) 实现 . 此外, 小鼠大脑皮质损 lysates of E.coli BL21 transformed with pET21 / LRRN3 with ITPG-induced at 37 ? for 5 h; Lane 2: Supernatant of the lysates of E.coli BL21 transformed with pET21 / LRRN3 with ITPG-induced at 37 ? for 5 h. LRRN3 mRNA 的表达上调, 这提示发现 伤后,1 M kD []10LRRN3 与神经系统的损伤修复可能也有密切关系. 9466.2 LRRN3 蛋白包含 1 个信号肽、12 个 LRR 结 45 构域、1 个 IgC2 样结构、1 个 FN ?样结构、1 个跨 35 膜结构以及 C 端的小段胞浆内尾部序列. 这种结 24 构 使 得 LRRN3 具 有 一 段 稳 定 的 较 长 的 胞 外 结 构, 其 N 端的 LRR 重复序列主要与黏附分子的 20 14.4 [ ] 11 相互作用有关,为其它分子提供结合位点. 靠图 4 重组蛋白纯化后 SDS-PAGE 凝胶电泳分析 M: 蛋白质分子质量标准; 1: 纯化的融合蛋白. 近 C 端 的 纤 维 连 接 蛋 白 3 型 结 构 域( fibronectin Fig.4 SDS-PAGE analysis of the pur ified pr otein , ) 是血浆蛋白纤维连接蛋白type 3 domainFN-?M: Standard protein marker; Lane 1: Purified protein. ( FN) 结构内部的 3 种重复结构序列之一, 大约 2%的动物蛋白分子结构中含有 Fn-?重复序列结 M 1 2 kD 构, 是许多跨膜因子受体、黏附分子的组成成分. 17 0 其胞内的短肽具有网格蛋白连接内 吞模体样结130 95 构, 能与网格蛋白形成构架, 把其它分子吸引到 72 膜上被自身覆盖的凹陷中来, 通过细胞膜再收缩 55 形成囊泡并通过形成细胞内独立 小泡介导内 吞 43 [ 12] 作用的发生. 网格蛋白连接内吞模体样结构可 34 能与多种神经生长因子的转运有关. 针对 LRRN3 26 的细胞内定位实验也表明 该蛋白能 定位于内质 网, 并可转运 至胞膜, 具有 介导蛋白-蛋 白作用 17 膜蛋白的共同特性. 11 随着人类基因组计划的完成, 新基因和蛋白 的结构与功能研究已成为当前研究热点. 蛋白质 图 5 Wester n blotting 检测融合蛋白的表达 : 蛋白质分子质量标准; 和 : 融合蛋白 M1 2His .结构域作为功能单位, 广泛存在于各种复杂的蛋 Fig.5 Expr ession analysis of the fusion pr otein by 白质中. 将蛋白质按其结构单元划分为相对独立 Wester n blotting M: Standard protein marker; Lane 1 and Lane 2: His-fusion protein. LRRN3 C 端结构域蛋白的原核表达和纯化 杨静等: 神经系统富亮氨酸重复超家族成员 第 3 期 231 cloning of novel leucine-rich repeat proteins and their 的模块, 就这些模块单独展开研究成为研究结构expression in the developing mouse nervous system[J]. Brain 功能复杂蛋白质的新思路. Res Mol Brain Res, 1996, 35( 1-2) :31-40. LRRN3 分子的 C 端在昆虫和哺乳动物中同 AKIRA S, TAKEDA K. Functions of Toll-like receptors: [2] 源性很低, 与其他已知蛋白没有同源性. 为了进 lessons from KO mice[J]. C R Biol, 2004, 327( 6) :581-589. 一步研究 LRRN3 基因 编码蛋白的 结构与功能 , MIL"N M, P#REZ L, COHEN S M. Boundary formation in [3] 本文从 C 端结构域入手, 通过简便、高效及生产 the Drosophila wing: functional dissection of Capricious and 成本低的原核表达系统获得 LRRN3 基因编码的 Tartan[J]. Dev Dyn, 2005, 233( 3) :804-810. BRYAN P H, LEE M W, DENNIS S, et al. Regulated [4] C 端结构域重组蛋白. 考虑到目的蛋白是未知的 expression of FLRT genes implies a functional role in the 基因所编码的蛋白 , 我们选择麦 芽糖结合蛋 白 regulation of FGF signalling during mouse development [J]. Dev Biol, 2006, 297( 1) :14-25. GRUMBLES R M, ALMEIDA V W, THOMAS C K. [5] ( Mal) 和组氨酸( His) 标记的表达载体, 为后来的Embryonic neurons transplanted into the tibial nerve 鉴定与分离纯化提供方便. reinnervate muscle and reduce atrophy but NCAM expression persists[J]. Neurol Res, 2008, 30( 2) :183-189. 由于融合蛋 白在大肠杆 菌表达时 大 部 分 以 FUKAMACHI K, MATSUOKA Y, KITANAKA C, et al. Rat [6] 包涵体形式存在, 这给融合蛋白的纯化带来了不 neuronal leucine-rich repeat protein-3: cloning and regulation 便. 通常采用的尿素等变性剂变性、复性纯化蛋 of the gene expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 白的方式, 需要在适当条件下才能使重组蛋白正 2001, 287( 1) :257-263. 确折叠恢复活性, 复性效率与蛋白质终浓度高低 FUKAMACHI K, MATSUOKA Y, OHNO H, et al. Neuronal [7] 及复性速度有关, 给样本的后处理也带来了极大 leucine-rich repeat protein-3 amplifies MAPK activation by +不便. 本试验采用 Ni-NTA 琼脂糖凝胶作为吸附 epidermal growth factor through a carboxyl-terminal region containing endocytosis motifs[J]. J Biol Chem, 2002, 277( 46) : 43549-43552. + 吸附柱中偶联的 Ni-NTA 琼脂糖凝胶能与 介质,WOLFE A D, HENRY J J. Neuronal leucine-rich repeat 6 [8] [ ] 13载体上的 His 发生特异性作用而紧密结合. 同 ( XlNLRR-6) is required for late lens and retina development 时实验所采用的表达质粒 pET21-MAl 带 有较强 in Xenopus laevis[J]. Dev Dyn, 2006, 235( 4) :1027-1041. HAINES B P, GUPTA R, JONES C M, et al. The NLRR [9] 的 T启动子, 外源基因插入后, 在 IPTG 的诱导 7 gene family and mouse development: Modified differential 下与麦芽糖结合蛋白基因 一起以融合 蛋白的形 display PCR identifies NLRR-1 as a gene expressed in early 式进行表达. 而融合蛋白中的麦芽糖结合蛋白的 somitic myoblasts[J]. Dev Biol, 2005, 281( 2) :145-159. 存在, 能与多糖树脂结合, 很容易被含麦芽糖的 ISHII N, WANAKA A, TOHYAMA M. Increased expression [10] of NLRR-3 mRNA after cortical brain injury in mouse [J]. 缓冲液洗脱 下来. 这使得 我们能在 变性的条件Brain Res Mol Brain Res, 1996, 40( 1) :148-152. ENKHBAYAR P, KAMIYA M, OSAKI M, et al. Structural [11] 下, 不需要通过复杂的变性和复性过程, 就能得principles of leucine-rich repeat ( LRR) proteins[J]. Proteins, 到较高浓度的高纯度融合蛋白.本研究通过重组、 2004, 54( 3) :394-403. 分离、纯化 LRRN3 分子 C 端结构域蛋白, 为进一 [12] LUNDBERG M, WIKSTROM S, JOHANSSON M. Cell surface 步研究 LRRN3 基因编码蛋白的结构与功能奠定 adherence and endocytosis of protein transduction domains[J]. 了基础. Mol Ther, 2003, 8( 1) :143-150. [13] BEELER J A, TANG W J. Expression and purification of soluble adenylyl cyclase from Escherichia coli[J]. Methods Mol 参考文献( Refer ences) : Biol, 2004, 237:39-53. [1] TAGUCHI A, WANAKA A, MORI T, et al. Molecular