引物设计
引物设计基本原则
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物只跟目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会扩增出其他非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性引物所具有的令人满意的特点:
? 典型的引物长18-24bp。引物足够长，保证序列特异性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24bp的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
? 选择GC含量为40%-60%。高GC含量导致形成稳定的不正确的配对，而高AT含量降低正确配对的Tm值。
? 设计5’端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
? 避免多碱基序列(如poly dG)或者重复结构域的延伸——它们能够在模板上进行不
正确的配对。
? 避免在PCR反应中使用与其它引物互补的序列，以阻止引物之间的配对，形成引物二聚体，抑制扩增。
? 在引物5’末端加入限制性酶切位点序列时，一定要包含几个额外的碱基(2-6碱基)作为固定，以防止5’末端在消化时的移动。
互联网上简并引物设计的基本步骤
? 从www.google.com 或www.yahoo.com搜索到NCBI网站。
? 登陆NCBI网站主页，在Search的复选框中选择Nucleotide，在for的选框中键入所需查找的基因，如β-actin，然后按Go键搜索已发表的不同物种的beta-actin基因。
? 经搜索后，网页上会显示一系列物种的beta-actin基因编号。单击某物种的基因编号查看该物种的β-actin基因序列。下载若干物种的β-actin基因的cDNA序列及氨基酸序列(力求所下载的基因序列是完整的)。
? 利用提供的软件对所下载的物种的基因氨基酸序列进行多重比较，找到高度保守区域，对高度保守区进行分析，设计所需的简并引物。
? 利用软件对所设计的引物进行分析检测，以排除二聚体、发夹结构。
? 引物设计完成后，送去合成。
特异性引物一般用于已知目的基因的克隆，而利用遗传密码子的简并性设计简并引物，则是克隆未知功能基因cDNA的常规方法。由于不同物种的同一基因的cDNA序列的变异性很大，通过核苷酸序列的多重比较难于找到目的基因的cDNA序列的保守区域。相对而言，基因的氨基酸序列的保守性较高，因此一般通过对不同物种的目的基因的氨基酸序列进行多重比较，找出氨基酸高度保守区，利用遗传密码子的简并性进行简并引物的设计。某些亲缘关系非常近的物种的cDNA序列的保守性会比较高，因此也可利用该核苷酸序列进行简并引物的设计。利用氨基酸序列高度保守区进行简并引物设计理论上应将每一氨基酸的所有可能密码子包括在内，但部分氨基酸如亮氨酸(L)、精氨酸(R)和丝氨酸(S)的相应密码子有
236种之多，一段保守序列中如出现2,3个这样的氨基酸，就需合成6,6种简并引物。利
用这些氨基酸设计的简并引物简并度会很高，而引物简并度过高时，有效引物的利用率就会降低，PCR产物非特异性则增高，从而难以得到所需的目的基因。简并引物一般要求小于(或等于8)，因此在设计简并引物时应尽量选用简并性低的氨基酸，如色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)等。简并引物的长度一般为30bp左右为宜，利用已发表的氨基酸序列，通过多重比较找到序列的高度保守区域，如果没有合适长度的高保守序列时，应尽量使引物的3' 端处于高保守区，这样才有利于引物与模板的结合及延伸。应使用较高的引物浓度(1µM到3µM)，因为许多简并混合物的引物不是特异针对目的模板。
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