《薄层色谱法》

薄层色谱法1概述1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。薄层色谱与高效液相色谱的差别（特点）固定相和流动相TLC——流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制。而HPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制。样品处理TLC要求没有HPLC严格。色谱分离TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双相多次展开，通常采用正相色谱。HPLC一通常采用反相色谱。对污染物抗受力强TLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。HPLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。2薄层色谱系统薄层板未改性固定相硅胶—为使用最广泛的薄层材料氧化铝—有碱性、中性、酸性硅藻土—为化学中性吸附剂纤维素—天然多糖类聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。表面改性固定相疏水改性硅胶——化学键合烷基亲水改性硅胶——引入氨基、氰基、二羟基等，薄层板极性介于极性吸附剂和疏水改性剂之间（极性次序：硅胶﹥氨基﹥氰基﹥二羟基﹥反相）。表面改性纤维素——乙酰化纤维素药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径一般要求10–40um。载板:薄层色谱中负载固定相薄层的平面介质,一般为玻璃板、金属板或塑料板——玻璃板，放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。黏结剂无机黏结剂——石膏（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字母“H”表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。有机黏结剂——羧甲基纤维素钠(CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。荧光黏结剂——在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂在254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。在366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F”表示，并以下标注明其激发光波长。例硅胶HF254薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例：硅胶板（粒度10～40um）硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。硅胶CMC——以CMC为黏合剂。配制0.2%～0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。反相薄层板制备——以不同链长的正构烷烃为固定液,配制成适当浓度的溶液(如5%硅酮油乙醚溶液),浸渍硅胶板。薄层板活化涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：硅胶110℃1h氧化铝110℃30min比纸色谱具有速度快、分离清晰、灵敏度高、可以采用各种方法显色等特点。点样要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。手工点样工具：定容玻璃毛细管（1–5ul），微量注射器。自动点样LimomatIV喷样仪——样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；条带宽度不超过2mm，有利于改善分辨率；便于狭缝式光密度计扫描；要求薄层板强度高。自动薄层色谱点样仪——由计算机控制。药典规定：点样基线距底边2.0cm,样点直径2-4mm,点间距离约为1.5-2.0cm。展开方式多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75为最佳。展开距离一般为10-15cm。多次展开——一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。分步展开——混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。连续展开——使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对保留值。二维展开——在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90的方向进行展开。原点12离心展开——薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。锲尖技术——圆形离心展开具有分辨率高的优点，但需要有一定的仪器装置。采用锲尖技术可以在一般的展开室中进行类似展开。薄层被刮掉部分溶剂前沿检测物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭化学方法——加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。斑点定位方法碘蒸气法——灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。将展开后的板挥干溶剂置碘缸中至薄层色谱上出现棕色斑点。放置时间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。用针头将斑点标记下来，放在通风处使碘挥发。3薄层色谱参数保留参数（Rf值）用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。Rf=Ls/L。，原点SRWLsL。Lr原点参比样品前沿注意：同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n。相对比移值（Rx）Rf测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相对比移值（Rx）。Rx=Ls/Lr分离效能参数理论塔片数n=16[Ls/W]2，考虑静态扩散引起的起始斑点半峰宽的影响引入真实塔片数（n真实）n真实=5.54[Ls/（b0.5-b0）]2b0.5为样品斑点半峰宽，b0样品起始斑点半峰宽。塔片高度h真实=Ls/n真实容量因子（k）与比移值（Rf）k=ts/tm（物质在两相中滞留时间之比）又k=K（Vs/Vm）Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k）k∞94210.50Rf00.10.20.330.50.671分离参数R=因Ls=RfL。，同时对相邻的两个斑点，假定W1=W2=W则R=L。=×⊿Rf与n=16[Ls/W]2式合并，得：2(Ls2-Ls1)W1+W2Rf2-Rf1WL。WR=由上式，Rf与R之间存在着如图所示关系×4⊿RfRf10.10.30.50.70.9Rf1R1.000.750.50.250Rf=0.3,R最高Rf在0.2-0.5,R变化不大Rf﹤0.1或﹥0.7,R下降4流动相与展开体系液-固吸附——在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：溶解能力流动相溶质吸附剂相互作用竞争液-液分配基于组分在互不相溶的两相间的溶解度不同而实现分离的一种展开系统。可在展开前，将薄层板浸入某种液体固定相。实际上在TLC中，分配与吸附是并存的（大气中水分也是一种固定相）。此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。溶剂强度参数和选择性溶剂的强度参数定义：溶剂强度参数用表示。流动相强度越高，表示它与吸附剂相互作用力强。溶质的Rf值就越大。为得到满意的分离，选用的流动相使溶质的Rf值在0.3–0.7之间为宜。溶剂强度也可用其在水中的溶解度参数来表示。一些常用溶剂的溶剂强度与溶解度参数溶剂溶剂正己烷0.017.3环己烷0.048.2苯0.329.2乙醚0.387.4二氯甲烷0.429.6正丙醇0.8210.2正丁醇0.70/四氢呋喃0.579.1乙酸乙酯0.588.6氯仿0.409.1甲乙酮0.51/二氧六环0.569.8吡啶0.7110.4丙酮0.509.4乙醇0.88/乙酸1.0012.4二甲亚砜0.7512.8甲醇0.9512.9乙二醇1.1114.7甲酰胺/17.9流动相选择时需考虑溶剂的下列情况一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。溶剂的选择性指溶剂引起两种溶质位移差别的能力，即分离度。R=1/4（-1）[k/（k+1）] 分离因子=k1/k2，k为k1和k2的平均值由上式可见，R取决于三个因子：理论塔片n主要是吸附剂性质的函数k反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶剂强度决定取决于吸附剂和流动相的组成溶剂优化规则：增加溶剂强度，使Rf值增大，但也可能降低分离能力。流动相中较强组分的体积比小于5%或大于50%，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相组分的选择性相互作用。用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成氢键可改善选择性。若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或降低薄层活性，有利于改善分离。也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元混合流动相，此时，溶剂强度由弱溶剂控制，而溶剂选择性则由两强溶剂控制。斑点的扩散与形状在TLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现象称为“溶剂的体积梯度”，在各种展开形式中均存在。当然，对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他成分的影响，这种影响的大小取决于混合成分的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后面的一个展开速度较其单独展开时为大。固定相的活度及其调节在其他因素一定时，活度增加，Rf值减少，反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的空间里来达到调节活度的目的。实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的Rf值越小。预吸附还可能影响Rf在0.6-1.0之间的斑点的分离。在层析过程中发生的边缘效应就是由于这种因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，即边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。预吸附中展开中展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛5薄层扫描原理薄层定量方法可分为直接法——测定照射光照射色谱后，因被测物斑点的存在引起的透射光和反射光的变化。并通过随行标准比较待测斑点的量。间接法——将部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即荧光测量。薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。一强度为I的光照射薄层时，被照射的一面为“近表面”，另一面为“远表面”。近表面远表面光（I）镜反射或表面反射Is(表面平滑)漫反射(表面粗糙)入射强度I0出射强度(IT)IT/I0为薄层透射率AT返回光强(IR)IR/I0为介质的漫反射率ARI0-（IR+IT）=差为被介质吸收并转换为热的光强光学系统薄层色谱扫描仪光学系统有三种单光束单波长——受光源稳定性和薄层质量影响严重。单光束双波长——对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。双光束单波长——可补偿光源不稳引起的误差，但对板层不均匀无作用。光单色器检测器光波长1波长2检测器斩波器光单色器分光镜检测器检测器透射光法测定组分对应的斑点对特定波长光的吸收度来确定含量。将薄层板从左至右移动，对斑点扫描，单色光透过薄层板后被记录下来，将测得的吸收度对Rf值绘制扫描曲线，得薄层色谱图光源单色器反射光法一定波长的光照射薄层，穿进薄层内的光部分被薄层吸收，部分经过漫反射又折回表面成为反射光。当对薄层进行扫描时，测量其反射吸收度，可得到反射光谱。反射吸收度与物质含量有确定关系，可进行定量。光源单色器扫描方式直线式扫描——照射在薄层板上的光束与薄层板作直线相对运动。光束固定，扫描板台运动。光束落在薄层上的截面为一长方形带。锯齿式扫描——照射在薄层板上的光束与薄层板的相对运动轨迹呈锯齿形或矩形。直线扫描锯齿扫描轮廓曲线积分曲线斑点斑点ABCABCCAB对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑点从A、B、C三个不同方向扫描，锯齿扫描所得积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。测量方式吸光度测量——测定的是漫反射光。适合于本身有颜色或有紫外吸收的物质。I0IR检测器荧光测量——灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让发射的荧光抵达检测器。滤光片荧光检测器荧光淬灭测量——吸附剂有荧光，样品斑点无荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：测荧光测紫外光测紫外和荧光扫描仪机械扫描仪——可进行吸光度和荧光测量，以反射测量方式为主，也有能提供透射测量方式的（主要用于电泳谱图扫描测量）。高速扫描系统——可分为两类光栅扫描系统位敏扫描系统这类扫描仪技术上一些问题还未解决。扫描定量中的标准曲线校正薄层板上由于光被吸附剂散射，不能得到象通常溶液测定时的吸光度和浓度之间的简单直线关系。即物质浓度越大，薄层试样板上测定的反射吸光度比直线关系所示值越低。扫描仪系统设计时考虑到这一问题，采用微机处理使标准曲线直线化。在理论曲线上选择吸光度0–1之间的7个点，将各吸光度值转换为直线上的值，得到一条通过原点的直线。吸光度1.00物质量经变换后的直线理论曲线直线化方法示意图校正过度校正适当校正不足未校正试样量积分值校正情况判断使用直线化功能时的注意事项发色试样的测定——对于没有吸收的试样进行发色测定时，一般不使用直线化功能就可以得到近似的直线关系。试样变质时——试样展开后，应马上进行测定，如果放置一星期后再测定。即使近似地呈直线状也往往不能通过原点，认为是试样变质所引起的。展开距离——同一试样等量点样，同样展开，展开距离不同将引起误差。展开方法——使用直线化功能定量时，为避免展开距离不同产生的误差，实际定量时，将已知浓度的标准品在同一块板上展开是较理想的。6定性、定量方法定性方法利用保留值测定Rf值测定相对Rf值，即Rx值。利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开通过板上化学反应反应后生成特征颜色的化合物反应后生成复杂的混合物，根据生成物的“指纹”特征加以鉴定。可用于定性的板上反应有：乙酰化、浓硫酸脱水、偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方法施加反应试剂。通过板上光谱图定性直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。与其他技术连用TLC-付里叶变换IR联用TLC-MS联用定量方法间接定量——将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来，再对洗脱液定量。分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法直接定量斑点面积测量——用透明纸覆盖在薄层表面，描出斑点界限，然后测量其面积。目测法——比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。薄层仪扫描定量定量计算归一化法、内标法、外标法方法认证选择性——以分离度表示，当待测组分的Rf值在0.3–0.7之间，扫描峰拖尾因子在0.9–1.1之间时可以接受的分离度为R大于等于1.0稳定性——考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展开后处理等过程中的样品稳定性。线性与范围——相应于待测组分检出量的20%-120%范围。灵敏度——通常以标准曲线的斜率表示。精密度重复性——当待测组分的含量达0.5ug/斑点时,方法的重复性(RSD)应在3.0%以内。中间精密度——多数情况下，RSD应在5.0%以内。再现性——RSD一般应在10%以内。检测限定量限准确度7应用药物鉴别——采用标准对照法杂质检查杂质对照品法高低浓度法药物标准品对照法不允许有杂质斑点存在，即以方法灵敏度来控制杂质量。含量测定——主要用于中药有效成分的分析杂质检查方法杂质对照品法（A）供试品自身对照法（高低浓度法）（B）对照物质法（C）样对样对样对ABC当归枳实药材大黄药材紫外光灯（365nm）检视紫外光灯（254nm）检视氨熏检视