免疫标记技术及分析应用

第一节免疫标记技术 第二节免疫荧光技术 第三节免疫酶技术 第四节放射免疫技术 第五节免疫胶体金标记技术免疫标记技术及分析应用用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。第一节免疫标记技术荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位免疫标记技术 反应类型 实验技术 结果判断 标记免疫反应 荧光免疫技术 检测荧光现象 放射免疫技术 检测放射性强度 酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度 金免疫技术 检测金颗粒沉淀用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）免疫标记技术液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）第二节利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或细胞内抗原的技术。在荧光显微镜下，以紫外光为光源进行观察。当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。抗体的荧光素标记 标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 标记 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。FITC异硫氰酸荧光素 去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。荧光显微镜的种类透射式落射式细胞内双标记荧光染色在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。如：FITC（黄绿色荧光）标记Ab1—RB200或TRITC9（桔红色荧光）标记Ab2DAPI+FITCFITC+PI（2）双色免疫荧光技术 如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（红色）DAPI（蓝色）EnzymeImmunoassay（EIA）第三节 抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。*一、常用的酶及其底物 酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。常用酶底物显色辣根过氧化物酶邻苯二胺、H2O2橙黄色四甲基联苯胺、H2O2蓝色碱性磷酸酶对硝基苯磷酸酯黄色二、标记方法 酶结合物 技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。 戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色 葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法四、酶标仪（酶联免疫检测仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nmELISAEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayELISA基本实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色ELISA原理图①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）固相抗原或抗体1.固相载体的性状：聚苯乙烯等固相载体2.试剂的配制:所有试剂的配制都用双蒸水3.包被:(1)包被缓冲液:PH9.6碳酸盐缓冲液(2)包被的浓度:10µg/ml(3)包被的时间：4℃过夜或37℃1-3h(4)包被的量:100µl酶及其底物 酶 底物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 492460449425642 碱性磷酸酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405420 β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光黄色 360,450420DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪DNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪测定OD值 1.直接法 2.夹心法 3.间接法 4.竞争法 5.捕获法ELISA种类1.直接法*2.夹心法：+++双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定双抗体夹心法双抗原夹心法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗原**3.间接法+++　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定间接法ELISA过程4.竞争法竞争法的原理固相支持物表面待测物包被抗体标记抗原此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。**用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量俘获抗体（二抗）待测抗体标记抗原包被体5.捕获法血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法**包被体待测抗原包被连接物标记抗体俘获抗体特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺**（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。捕获法操作过程 食品中盐酸克伦特罗的测定 食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素） 食品中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌） 甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析ELISA在食品安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测： ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊断中的作用 ELISA法检测幽门螺杆菌抗体ELISA试剂盒（radioimmunoassay，RIA）第四节利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质结合相游离相第五节胶体金标记技术 以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。　　胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。胶体金标记技术常用方法：胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点免疫层析试验**********