食品微生物检验：食品卫生细菌检验

食品卫生细菌检验食品微生物检验第一节菌落总数的测定一、菌落总数与食品卫生质量目的：了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况；也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，确定食品的保存期，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数的几个概念菌落总数：AerobicPlateCount，食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培基、温度、时间、pH、需氧性质等）所得1mL（g）检样中形成微生物菌落的总数。只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。菌落：Colony，单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定细菌群落。CFU:ColonyFormingUnits，菌落形成单位。意义：食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。是判断食品卫生质量的重要依据之一。（1）可以反应食品的新鲜度。（2）可以反应食品被细菌污染的程度。（3）生产过程中食品是否变质。（4）食品生产的一般卫生状况等。如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数大约已达到106-107CFU/g(mL或cm2)。 几种食品变质（能被人的感官察觉）时的菌落总数 食品种类 菌落总数/个 1g或1ml 1cm2 鸡肉 108 106-108.5（极少） 牛肉（生） 108 106-108.5（酵母） 腊肠 108-108.5 鱼 106.5-106 106-108.5 蟹肉 108 贝 107 牡蛎 104-105.7 鲜蛋液 107 冰蛋 106.7 豆腐 105-106(pH5.5以下) 鲜牛乳 105-107 米饭 107-108 一般而言，食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系，但有时食品中细菌含量很高，即使已达到相当于同种食品已变质时的细菌数，而食品并未有任何变质现象；有时食品遭受污染的程度特别严重，食品中虽含有大量的细菌，由于时间短暂或细菌繁殖条件不具备，就见不到变质现象。 例如：细菌难以生长的一些干制食品和冰冻食品，它们含有细菌的多少，就可以表明这些食品在生产、运输、贮藏等过程中卫生管理的状况。 另外还有发现在检出菌落总数在5000个/g以下的样品中，和其中仅含菌落总数380个/g的样品中，均可分离出沙门氏菌，并且都有大肠菌群存在。 在一些菌落总数低的食品中(如罐头食品)，曾有细菌繁殖并已产生了毒素，但是由于环境条件的限制使细菌不能延续生长繁殖，而毒素因性状稳定不受环境的影响而仍在食品中保留。 像这种情况，就不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣。 根据以上事实，食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量起着一定的卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确评定。说明： 国家标准中采用的培养方法是样品处理后倾注平板，36℃，培养48±2小时——实际测定的是嗜中温好氧菌的菌落总数。 菌落总数测定是对细菌的无差别培养，不能区分细菌种类，所以有时被称为杂菌数。二、菌落总数的测定方法 GB/T4789.2-2010 数据记录4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基（A1）4.2磷酸盐缓冲溶液（A2）4.3无菌生理盐水（A3）4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基（A1）4.2磷酸盐缓冲溶液（A2）4.3无菌生理盐水（A3）4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基（A1）4.2磷酸盐缓冲溶液（A2）4.3无菌生理盐水（A3）6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.4按6.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.2培养6.2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。6.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。6.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。6.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7结果与 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 7.1菌落总数的计算方法7.1.1若只有一个稀释度平板在30-300CFU，则计算两平行平板的均数，再乘以稀释倍数报告之7.1.2若有连续两个稀释度符合计数 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 则按下公式例1：10-2=232，24410-3=33，35例2：10-1=232，24410-2=33，29菌落总数所有符合计数要求的平板菌落数之和较低稀释度有效平板数较高稀释度有效平板数较低稀释度的稀释倍数N=(232+244+33+35)(2+2×0.1）×10-1=544/0.022=24727上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×1047.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2菌落总数的报告7.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。7.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。7.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。菌落总数检验操作流程图 若样品中可能含有表面蔓延生长的菌落时，可在培基凝固后再覆盖一薄层培养基 水产品置于30℃±1℃培养72h±3h。新计数公式的统计学依据 平板菌落数越多，结果越具有代表性（不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等） 取样量越大，结果越具有代表性（同等取样条件、排除其他方面的干扰因素） 不同的取样量赋予不同的权重，而不是简单的取平均值。 新旧方法计算同一结果会有所不同结果表述 10-1均数 10-2均数 描述 最终结果 255 36 均在30-300间则按计数公式 2.6×103 多不可计 345 各平板均>300，取稀释度最高者报告，余计为多不可数 3.5×104 12 2 均小于30则取稀释度最低者报告 1.2×102 330 29 所有平板均不在30-300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者报告 2.9×103 0 0 所有平板均无菌落则记为1乘以最低稀释倍数报告 1×10，10第二节食品中大肠菌群的测定一、大肠菌群的定义及范围 大肠菌群(coliformbacteria)系一群在37℃，24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中四个菌属内的一些细菌所组成，即埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）及肠杆菌属（Enterobacter）。 属 代表种 致病性 埃希氏菌属（Escherichia） 大肠埃希氏菌(E.coli) 肠道外感染，急性腹泻 志贺氏菌属（Shigella） 痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae) 细菌性痢疾 爱德华氏菌属（Edwardsiella） 迟纯爱德华氏菌(E.tarda) 蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内 沙门氏菌属（Salmonella） 伤寒沙门氏菌(S.typhi) 肠热症、急性肠炎、败血症 柠檬酸杆菌属(Citrobacter) 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 条件致病菌，引起继发性感染 克雷伯氏菌属(Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、创伤感染败血症等 肠杆菌(Enterobacter) 阴沟肠杆菌(Enterobactercloacea) 很少引起原发性感染 属 代表种 致病性 哈夫尼亚菌属(Hafnia) 蜂窝啥夫尼亚菌(H.alvei) 对人无致病性 沙雷氏菌属(Serrati) 粘质沙雷氏菌(S.marcescens) 条件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及创伤感染 变形杆菌属(Proteus) 普通变形杆菌(P.vulgaris) 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等 耶尔森氏菌属(Yersinia) 鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis) 鼠疫 欧文氏菌属(Erwinia) 草原居民欧文氏菌(E.herbicola) 植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到 大肠菌群中大肠埃希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、V-P和枸橼酸盐利用四个生化反应分别为“++--”，通常称为典型大肠杆菌； 而其他类大肠杆菌则被称为非典型大肠杆菌。产气克雷白氏菌大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、克雷白氏菌和肠杆菌等。总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系二、大肠菌群的测定意义1.粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。 一年后，塞乌博耳德·史密斯指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的，从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108～109个/g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。 根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。 所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。2．粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。①存在于肠道内特有的细菌，才能显示出指标的特异性。②在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。③在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。④检验方法简便，易于检出和计数。 一般认为大肠菌群都直接或间接来自于人或温血动物的粪便。 粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。 因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等。 这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因为比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处：①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。②大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。③在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。 大肠菌群的检出，不仅反映检样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。 大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目。 如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。 所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。三、大肠菌群测定的国家标准GB4789.3-20103设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒温水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均质器。3.6振荡器。3.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。3.8无菌锥形瓶：容量500mL。3.9无菌培养皿：直径90mm。3.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。3.11菌落计数器。4培养基和试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤（A1）。1、初发酵试验： 蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸； 乳糖提供发酵所需的碳源； 磷酸氢二钾维持缓冲体系； 月桂基硫酸盐：硫胺素二月桂基硫酸盐，无色至白色或白色结晶性粉末。几乎无臭。熔点150-160℃。对碱、热及在空气中稳定。有强表面活性作用。微溶于水分散于热水中形成溶胶。易溶于乙醇、氯仿。难溶于乙醚、丙酮。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵”来促进菌体产气。大肠菌群在LST中的生长情况4培养基和试剂4.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤（A2）。 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）：BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和大肠菌群以外的很多革兰氏阴性细菌，再根据发酵乳糖的情况判断大肠菌群。2、复发酵试验 胆盐（猪、牛或羊胆盐）：是用猪、牛或羊的胆汁制成的各种胆盐，对不同的菌类有不同的溶菌或抑菌作用，借以鉴别某些球菌、肠道菌或抑制一些革兰氏阳性菌类。 因为第一次直接从检样中接种的液体可能含有多种菌，所以利用胆盐抑制其他菌的生长。产气量与倒管：在试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。4培养基和试剂4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）(A3)。4培养基和试剂4.4磷酸盐缓冲液(A4)。4培养基和试剂4.5无菌生理盐水(A5)。4.6无菌1mol/LNaOH(A6)。4.7无菌1mol/LHCl(A7)。检样10倍系列稀释选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管不产气产气BGLB肉汤不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性查MPN表报告结果36℃±1℃48h±1h第一法大肠菌群MPN计数法5检验程序6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。 未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。大肠菌群计数检验流程0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（-）小导管里无气泡LST产气（+）大肠菌群测定——MPN法检验几点说明MPN检索表：MPN为最大可能数(MostProbableNumber)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。第二法大肠菌群平板计数法7检验程序8操作步骤8.1样品的稀释 按6.1进行8.2平板计数8.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。8.3平板菌落数的选择 选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。8.4证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。 例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。第二法VRBA平板计数法选择15-150平板计数典型和可疑菌落36℃±1℃18h~24h挑选10个菌落接种到BGLB典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，0.5mm