解磷解钾自生固氮菌的分离筛选及鉴定

第24卷第1期2005年2月华中农业大学学报JournalofHuazhongAgriculturalUniversilyVo1．24No．1Feb．2005．43～48解磷解钾自生固氮菌的分离筛选及鉴定蒋宝贵赵斌一(华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉430070)摘要从华中农业大学农场试验田不同土壤中分离到一系列解磷、解钾及自生固氮菌，经比较筛选得到1组菌株PJ07、PO1、HZ03、NY03，它们分别具有较强的降解难溶态的磷、分解有机磷、降解难溶态的钾和固定空气中游离态氮的能力。各菌株经鉴定分别属于或接近假单胞菌属(Pseudomonas)、巨大芽孢杆菌(Baeillusffuegaterium)、胶质芽孢杆菌(BacillusIilUCilaginosus)和圆褐固氮菌(Azotoba{terchrococcum)。统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 表明由各菌株组成的复合菌剂在玉米盆栽试验中可显著增加作物的总生物量。关键词解磷细菌；解钾细菌；自生固氮菌；筛选与鉴定中图法分类号S154．381农作物生产不仅要求高产、稳产，而且要求品质优良。长期以来，为了确保农产品的高产丰收，人们大量使用化学肥料和农药，使得生态环境每况愈下，十分不利于农业的可持续发展。微生物肥料由于具有增加土壤生物多样性、改善农产品品质、能够自我更新增殖和永续利用的特性，其发展始终为人们所关注。微生物肥料是指应用于植物或土壤环境中有生物活性，起肥料效应的、或以肥料方法施用的，以微生物活性生物体或其代谢产物为主要作用因子的生物制剂或肥料制品]。微生物肥料种类繁多，按照微生物的作用机理可分为根瘤菌肥料、自生固氮菌肥料、解磷细菌肥料、解钾细菌肥料、抗生菌肥料和复合微生物肥料】。解磷细菌由于其可以分解土壤中的难溶磷矿物，释放出其中的磷或者是分解土壤中的有机质，将有机磷变为植物可以吸收利用的无机磷，从而为作物提供有效磷素。解钾细菌多是硅酸盐细菌，它能分解硅酸盐类矿物并释放出钾等元素供植物利用，同时它也有固氮、解磷功能。固氮菌可以将空气中的N。还原为可以被作物吸收利用的NH’。，由于共生固氮菌有宿主专一性，例如一定的根瘤菌只能用于一定的豆科作物，所以使用范围较窄，而自生固氮菌不受这些因素的限制，其生产和使用都很方便】。本研究主要是筛选和鉴定解磷细菌、解钾细菌和自生固氮菌。1材料与方法1．1土壤样品的采集采自华中农业大学农场试验田的菜园土、稻田土、未耕作的红壤土、磷钾肥试验田土。1．2细菌的分离和筛选1)解磷细菌的分离筛选。在不含磷的基础培养基中添加一定量的难溶性的磷酸盐作为唯一磷源的选择性培养基]，本试验选用的是CaHPO、Ca。(PO)z。将不同的土壤样品作系列梯度稀释后涂平板，根据解磷圈的大小挑取单菌落作为初筛的结果。然后在不含磷的基础培养基5]中添加一定量的磷矿粉制成液体培养基，250mI三角瓶每瓶装液100mI，再添加磷矿粉0．5g，接种初筛菌株，28℃180r／min培养7d，钼锑抗比色法测发酵液中可溶性磷的含量。在卵磷脂培养基上降解有机磷的菌株可以把卵磷脂大分子降解为小分子，产生脂肪，形成不透明的溶脂圈，所以用含有新鲜卵黄的I．B培养基作为分解有机磷细菌的选择性培养基，根据溶脂圈的大小筛选有机磷分解菌。‘2)解钾细菌的分离筛选。选用阿须贝培养基和钾细菌选择性培养基作为筛选培养基，挑取在二者平板上都能生长的产荚膜的光滑透明油滴状菌落。然后在不含钾的基础培养基中加人钾长石矿粉制成收稿口期：2004—05—2l*国家自然科学基金项目(30270021)资助**通讯作者，E-mail：binzhao@mail．hzau．edu．cn蒋宝贵，男，1979q-~，华中农业大学生命科学技术学院硕上研究生，武汉430070维普资讯http://www.cqvip.com华中农业大学学报第2l{卷液体培养基250m1三角瓶装液1OOml，添加钾长石矿粉0．5g，接种初筛菌株，28℃、180r／mn培养7d，原子吸收法测发酵液中可溶性钾的含量。3)自生固氮菌的分离筛选固氮酶能将乙炔还原为乙烯，因此用乙炔代替氮气，通过气相色谱技术检测乙烯生成量即乙烯还原法来问接测定固氮酶的固氮话性”]。本试验用单位重量的发酵液在单位时间内还原乙炔，生成乙烯的物质的量(微摩尔数)来表示以阿须贝培养基作为选择性培养基。挑取在阿须贝平板上能旺盛生长并能产生棕色、褐色或黑色色素的菌落。摇瓶培养上述自生固氮菌菌株，气相色谱法测供试菌株的固氮酶活性，选取固氮酶活性高的菌株1．3菌株的鉴定1)菌落菌体形态结构观察。分别在解磷细菌选择性培养基、硅酸盐细菌选择性培养基和阿须贝培养基上观察解磷细菌、解钾细菌和自生固氮菌菌落形态+草兰氏染色后显微镜下观察菌体形态，分别作荚膜．芽孢和鞭毛特殊染色观察一。2)生理生化鉴定。参照文献[7]进行以下试验：唯一碳源试验、唯一氮源试验、氧化酶试验、接触酶试验Hs试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验、糖醇发酵试验及细菌运动性观察、石蕊牛乳试验、硝酸盐还原试验甲基红试验、VP试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、脂酶(Fween80)试验、无氮培养基生长试验、卵磷脂酶试验。1．4菌剂的盆栽试验选取有机质较为丰富的菜园土作为供试土壤，将解磷细菌P01、PJ07，解钾细菌HZ03和自生固氮菌NY03．经摇瓶培养和固体发酵制成固体复合菌荆，以市场上畅销的3种微生物肥做参照，进行盆栽试验。设置5个处理．处理I为加等量灭菌剂作为对照，处理2为河北省某公司生产的微生物复合肥料，处理3为本试验的复合微生物菌剂，处理4为上海某公司的微生物肥料，处理5为北京某公司的微生物肥料。选用直径14cm的自皮花盆每盆装土1kg，每盆施用10g固体菌剂，均为与细土拌匀后覆在土层上部，种植玉米，每盆定植2棵，生长期50d，烘干后测生物量(总重、根重)。是PJO7在选择性平板上形成的较大和非常明显的解磷圈。图2左侧菌落是解有机磷菌株P01形成的溶脂圈。培养这些菌株，钼锑抗比色法测含有磷矿粉的发酵液中可溶性磷的含量，从图3可以看出，菌株PJ07和PJO6与对照相比增加可溶性磷量为95．8和5d．1．具有较强的分解难溶态的无机磷的能力，其它菌株与不接菌种的对照相比可溶性磷含量反而有所下降圈2菌株P0I形成溶脂圈Fig2OilmsolvingcircleformedstrainPO12i果与分析圈3解磷细菌分解磷矿粉后的可溶性磷含量2．1解磷细菌的筛选结果g。由。pph。。。phpn。。uS从不同土壤样品中分离得到11株菌株。圈1po‘。edby一。山。_嗍惦i。m几衄呲Ⅱn维普资讯http://www.cqvip.com第1期蒋宝贵等：解磷解钾自生固氮菌的分离筛选及鉴定2．2解钾细菌筛选结果在阿须贝培养基和解钾细菌选择性培养基上解钾细菌可形成透明的光滑的油滴状的菌落，而且随着培养时间的推移．菌落颜色始终不变，这与许多文献和研究中描述的硅酸盐细菌的特征一致，采用此方法共得到6株菌株。图4是HZ03在阿须贝培养基上形成的菌落。将这6株疑似具有解钾功能的细菌接种在钾长石矿粉液体培养基发酵】周，原子吸收法测得发酵液中可溶性钾含量(图5)为HZO3最高，达到55．9t~g／'mg浓度，比对照(21．4i~g／mg)多161，其它菌株与对照相比解钾能力也多出34．6到93．8不等，经统计学分析表明差异具有显著性(P<0．05)。2．3自生固氮菌的筛选结果在阿须贝培养基上自生固氮菌形成光滑半透明粘稠并产生褐色色素的菌落，初筛得到一系列这样的菌株．图6是NY03形成的菌落。本试验得到2株固氮酶活很高的菌株，它们是NY03和NY02，分别达到0．43、0．39Fmol／g·h。这相当于固氮酶活性较高圈4解钾菌HEG3成特有的油滴状菌落Fig4Uniquelyoil—dro~likeeofonyfamdbyPolassiLannreducingbacleriumCKKCACl-hZOIH2：02HZ03Hz04l摊Strain图5解钾细菌分解磷矿粉后的可溶性钾含量F_咱5SolvablepotassiumcontonlofpI1os口h。r0usmirepowderd／ssoP~~：lbyP-ro：tJc／ngbacteria圈6菌株NYO3形成产褐色色素的茸落Fig6BrownC．~onyfoc'm~byStrainNY03圈Fig'712誊l6g2￡0棣SJrain7固氟酶活的气相色谱测定结果Re~JItof*1．Canalysisofnitrogona~2345址．011rr,-~tl-nITotalwe{h《Rotore1ghl圈8复合菌剂的玉米盆栽试验效果Fig8Potplanttestof0口Ie×incoulontinnon-stecilizod9。il2．4菌株的鉴定结果将具有较强功能的无机磷降解菌株P02、PJ02、PJ07和有机磷降解菌株P01以及较强的钾矿粉降解菌株KCAC、HZ03和白生固氮菌NY03进行形态和生理生化鉴定。表1是各菌株的革兰氏染色、菌落和菌体形态特征，表2至表5是菌株的生理生化特征结果显示，菌株NY03细胞卵圆型，直径2m或更大，但随着时间和生长条件的改变，细胞形态会发生剧烈的变化，能短到类似球状，细胞单个，成对或不规则的堆状，不形成芽孢，但形成孢囊，产生夹膜黏液，革兰氏染色阴性，一些菌株常产生水溶性色素，能利用硝态氮和氨态氯，接触酶阳性。这¨g5【u害I^芍t。蝗苗罐匪黜几口-几===几n∞钟∞如加加0g=量2一一莒三0∞_}0兰u薹0二vl_訇目仙之也是燕维普资讯http://www.cqvip.com46华中农业大学学报第24卷些特征与固氮菌属(Azotobacter))特征吻合。从表2看出，NY03与该属内的模式菌株Azotobacterchvococcurl2(圆褐固氮菌)非常接近l8]，所以菌株NY03可能与Azotobacterchrococcum同种。菌株P01和KCAC、HZ03细胞呈直杆状，(1．0～2．0)ffm×(5～10)ffm，常以成对或链状排列，具圆端，革兰氏阳性，有鞭毛，芽孢椭圆或卵圆形，好氧的化能异养菌，接触酶阳性，这些特征与芽孢杆菌属(Bacillus)的特征吻合，所以它们都属于芽孢杆菌属(Bacillus)。更进一步，将菌株P01的特征与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的描述相对照，从菌落特征和革兰氏染色及菌体形态特征分析，二者极为吻合，从生理生化特征分析，二者也非常接近，见表3。对照检索表，可以断定菌株P01和巨大芽孢杆菌(Billusmegaterium)属于同一种。同理，菌株KCAC、HZ03与Bacillusmucilag-inosus属于同一种，见表4。结果还显示，菌株P02、PJ02、PJ07细胞单个排列，直的杆菌，大小(0．5～1)ffmX(1．5～4)ffm，单鞭毛或多鞭毛，革兰氏阴性，有机化能异养，呼吸代谢，不发酵，接触酶阳性这些特征与假单胞菌属(Pseudomonas)的特征吻合，假单胞菌属是个变化较大的菌属，在分类上相距很远，共有的特征不多。从表4可以看出，菌株P02、PJ02、PJ07与假单胞菌属的特征最为接近]，对照检索表，可以断定菌株Po2、PJ02、PJ07属于假单胞菌属(Pseudomonas)。但是鉴定到种还有待进一步的试验。表1格兰氏染色、菌落和菌体形态特征Table1Profileofcolonyshape．cellshapeandGramsmimng菌株Strain特征Characters～、菌落直径2～4mm，湿润。扁平，边缘不整齐，fl色菌落。G，细胞里A牛r状。1．O～2．0f』m×5～1Of』m，成对或链状排列，两端钝圆，有芽孢，芽他椭。P02菌落直径l～2nm，湿润，突起，边缘整齐，黄色菌落。G，细胞里短小的杆状，0．5lJ+mXl『』m，个、成对或成堆排列，芽孢。PJ02菌落直径l～2mm，湿润，突起，边缘整齐，黄色菌落。G，细胞望短小的杆状，0．5pmX1．OI*m，单个、成对或成堆排列，无芽孢。PJ07菌落直径l～2mlTl，润，突起，边缘整齐，黄色菌落。G一，细胞里短小的fJ：状，0．5ffmXl_0m，单个、成对或成堆排列，无芽孢。，、，、菌落直径2--5mm，无色透明，边缘整齐，i娃润，隆起，枯稠似汕滴。G，细胞里f『状，1．O『』mx5『』m左右，单个或链状排列，产生很大的英膜，5--1O『』mxl0--20m，行芽抱。，。菌落直径2--5rnlTi，无色透明，边缘整齐，湿润，隆起，粘稠似油滴。G一，细胞呈Ar状，1．OILmX5ffm左右，单个或链状排列，产生很大的英膜，5～10『』m×10--20m，有芽孢。⋯⋯菌落直径l～2mlTl，半透明，光滑粘稠，边缘整齐，后期产棕褐色色索。G，大的椭倒细胞，直径1．5～2m，从杆状到类球状的多形态，单个、成对或不规则的堆状，胞囊，不彤成芽孢。表2菌株NY03与Azotobacterchrococ~mm比较Table2ComparisonbetweenstrainNY03andAzotobacterchro~o~c／utl细胞形态Cellshape杆到卵圆到类球短机轩到卵圆细菌直径Celldiameter／lzm1．5--2．0≥l_5～2．0老菌落产色素棕黑黑色Corlorofcolonies～⋯’‘⋯利用淀粉，甘露醇，有机酸Use。fCarbohydratcs++运动Motion++形成孢囊Cystproduction++产生荚膜Capsuleproduc一十十接触酶Catalase++表3菌株P01与B．megaleriurn的生理生化特征比较Talbe3PhysiologicalprofileofstrainPO1andEmegaterium特征ChactersPOIB．megaterium维普资讯http://www.cqvip.com第l期蒋宝贵等：解磷解钾自生固氪菌的分离筛选及鉴定表4菌株KCAO、HZ03与日n'~ci／eg／c,osus的生理生化特征比较Table4(m∞el"physiol~ielph~letypeamOKCAC．Hz03aIldB．ffdgnⅢ表菌株PO2、PJq3、PJ07与假单胞菌属的特征的比较l'~Jfle5Comparison0rpII叫}‘trails_I附曝P02蹦、2．07∞d“dDm"∞图9玉米盆栽试验结果Fig9PotplanttestofinOa1I帕maiz~从左至右依次为处理5(北京集擞=物趟刺’处理3(率试验州)tj对鼎；B盛裁整体生妊情况，从左至矗依趺为处理5(北京I!iI微生物菌)处理fj．海微生物曲剂)处理3(奉试验复合毒菠物黹刑)、处理2(河北保定艇扛物落刺)和处删I(对照)2．5盆栽试验结果经统计学分析后的结果显示(见表6)，加有率试验复合菌剂的处理和北京的某微生物肥料的作物的生物总量与对照相比，分别增加1倍多和84，其差异是极为显著的(P<0．05)(见图8)，另外2个处理与对照相比差异不显著(P>0．O5)，本试验复合菌剂与北京产微生物肥料相比差异不显著，说明本试验的复合菌剂与市场上畅销的产品相比要强于或至少已相当于市场上最好的产品。3讨论在细菌分解磷矿粉能力试验中，只有2株比对照有显著的增加，大部分接种的发酵液的可溶性磷含量与对照相比有所下降，这个结果与前人的结果类似，但这不能否定细菌的解磷能力，这可从微生物的解磷机制上进行解释，微生物解磷机制一般认为与微生物分泌有机酸有关。在培养过程中一开始由于微生物产酸导致磷古量有所增加，然后微生物细胞可能改变他们的代谢机制，释放有机代谢物于基维普资讯http://www.cqvip.com48华中农业大学学报第24卷质中，如乳酸、琥珀酸等，可能形成有机磷化合物而降低溶液中的磷含量。在细菌的生长繁殖过程中，有些细菌利用大量所溶解的磷，将其转化为有机磷，另一些细菌则发生对分解出来的无机磷酸盐的奢侈吸收，在细胞内储藏大量的无机磷酸盐，所以，不能因为发酵液中磷含量低于不接种的对照，就推断此菌株没有解磷能力[9]。有人认为解磷菌为了保证自身的生长而大量的利用磷，其结果是造成可溶性磷含量的减少，但大部分人还是认为磷浓度的增加是由于细胞生长和裂解的不断循环累积起来的。对于硅酸盐细菌分解钾长石矿粉的能力，学术界一直存在不同的见解，近年来很多研究表明硅酸盐细菌能够分解象钾长石、云母等硅酸盐类的矿物，可以使难溶于水的钾转化为植物吸收利用的有效钾，同时还能分解土壤中的无效磷成为有效磷，并且有微弱的固氮能力【l。。。李阜棣认为硅酸盐细菌不具有分解钾长石矿粉的能力|1州。李风汀等认为硅酸盐细菌有解钾能力，并对农作物表现很好的增产效果[1¨，最近盛下放、黄为一等通过大量的试验和盆栽证明硅酸盐细菌破坏钾长石并释放出可利用的钾的能力是显著的l】。本试验的结果是乐观的。固氮是耗能的还原过程，通常每消耗lg碳水化合物非共生地固定大气中的氮气至少10mg。一般来说，自生固氮菌的固氮能力不及共生固氮，但对于NYO3和NYO2，分别达到0．43和0．39~mol／g·h，已经是相当高的了。由于共生固氮菌有宿主专一性，例如一定的根瘤菌只能用于一定的豆科作物，所以使用范围较窄，而自生固氮菌不受这些因素的限制，其生产和使用都很方便。参考文献l葛城．微生物肥料的生产应jH及发展．北京：中国农业科技出版社，19962陈华癸．土壤微生物学．}海：海科学技术出版社，198l3陈廷伟．微生物肥料生产应用及发展．北京：l}I国农业科技出版社，19964赵斌，何绍江．微生物学实验．北京：科学出版社，20025许光辉，郑洪光．土壤微生物分析方法手册．北京：农业出版社，l9866中国土壤学会编．土壤农业化学分析方法．北京：中国农业科技出版社，19997东秀珠．常见细菌系统鉴定手册．北京：科学出版社，200l8赵小蓉，林启美．细菌解磷能力测定方法的研究．微生物学通报，2001，28(1)：l～49中国科学院微物研究所新们杰氏细菌鉴定手册翻译组泽．伯杰氏细菌鉴定=于=栅(第8版)．北京：科学出版社，1984lO李阜棣．土壤微生物．北京：-{】喇农业出版社，1996ll李风汀，郝Ⅱ然，杨则瑗等．硅酸盐细菌HM884l泡株解钾作用的研究．微生物通报，l997，2,1(1)：79～8l12盛下放，黄为一，殷水购．硅酸盐菌剂的应用效果及解钾作用的初步研究南永农业大学学报，2000，23(1)：43~46ScreeningandIdentificationoftheBacteriumWhichHaveHighEfficiencyonResolvingPhosphorusandPotassiumandinNitrogenFixationJiangBaoguiZhaoBin(NationalKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)AbstractAseriesofbacteriumwereisolatedwiththefunctionofresolvingphosphorusandpotassi—umandoffixingnitrogenfromdifferentsortsofsoil．Comparingtheirfunctionfromeachother，thestrainPJ07，P01，HZ03andNY03bearthehighestcapabilityindissolvingphosphoritepowder，breakingdownorganicphosphorus，dissolvingpotassiumfeldsperpowderandnitrogenfixation．Eachwa,qidentifledandbelongedtoorfamiliartoPseudamonas，Bacillus．megaterium，Bacillus．mucilaginOSUSorAzotobacterchrococcum．Keywordsbacteriumofdissolvingphosphorite；bacteriumofdissolvingpotassiumfeldsper；bacte—rium0fnitrogenfixation：screeningandidentification(责任编辑：张志钰)维普资讯http://www.cqvip.com