试验七食物中脂溶性维生素含量分析高效液相色谱法——

实验七食物中脂溶性维生素含量剖析（高效液相色谱法——HPLC）一、实验目的与要求目的认识高效液相色谱仪的工作原理。要求掌握HPLC测定食物中脂溶性维生素含量的方法。二、实验原理样品中的维生素A及维生素E经皂化提取办理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分别，经紫外 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 器检测，并用内标法定量测定。最小检出量分别为维生素A：0.8ng，αE：91.8ng，γE：36.6ng，δE：20.6ng。三、实验仪器与试剂1仪器1）实验室常用设施；2）小离心管：1.5~3.0ml带盖塑料离心管（与高速离心计配套）；3）高速离心计；4）旋转蒸发器；5）恒温水浴锅；6）紫外分光光度计；7）高压液相色谱仪带紫外分光检测器。试剂1）高纯氮气；2）无水乙醚：不含有过氧化物。①过氧化物检查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该醚需办理后使用。②去除过氧化物的方法：熏蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许，弃去10%蒸馏水和10%残留液。无水乙醇：不得含有醛类物质。①检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醛，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反响则表示乙醇中有醛。②脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（时时摇动，促使反响），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适合增加。4）无水硫酸钠。5）甲醇：重蒸后使用。6）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。7）10%抗坏血酸溶液（100g/L）：临用前配制。8）1∶1氢氧化钾溶液。9）10%氢氧化钠溶液（100g/L）。10）5%硝酸银溶液（50g/L）。（11）银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的积淀从头溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生积淀，再加氨水直至溶解。（12）维生素A 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液：视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化办理后使用，用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大概为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其正确浓度。（13）维生素E标准液：α生育酚（纯度95%），γ生育酚（纯度95%），δ生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大概为1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的正确浓度。（14）内标溶液：称取苯并\[e\]芘\[纯度98%\]，用脱醛乙醇配制成每1ml相当于10μg苯并\[e\]芘的内标溶液。15）pH1~14试纸。四、实验步骤样品办理（1）皂化：称取1~10g样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约40μg）于皂化瓶中，加30ml无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分别平均为止。加5ml10%抗坏血酸，苯并\[e\]芘标准液2.00ml，混匀。加10ml1∶1氢氧化钾，混匀。于开水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立刻放入冰水中冷却。（2）提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100ml乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液经过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。（3）洗涤：用约50ml水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸查验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。（4）浓缩：将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250~300ml球形蒸发瓶内，用约10ml乙醚冲刷分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于65℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2ml乙醚时，取下蒸发瓶，立刻用氮气吹掉乙醚。立刻加入2.00ml乙醇，充分混淆，溶解提取物。（5）带乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000r/min）。上清液供色谱剖析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇从头定容，并记下体积比。标准曲线的制备（1）维生素A和维生素E标准浓度的标定方法：取维生素A和各维生素E样本若干微升，分别稀释至3.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值，用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表71所示。表71测定维生素A和各维生素E标准浓度的实验条件标准加入标准的量V/μl比吸光系数E1%cm波长/nm视黄醇10.001835325α生育酚100.071294γ生育酚100.092.8298δ生育酚浓度计算按下式：c1=AE×1100×1100×3.00V×10-3①式中：c1——其维生素浓度g/ml）；A——维生素的平均紫外吸光值；V——加入标准的量（μl）；E——某种维生素1%比吸光系数；3.00V×10-3——标准液稀释倍数。（2）标准曲线的制备：本方法采用内标法定量。把一定量的维生素A、γ生育酚、α生育酚、δ生育酚及内标苯并\[e\]芘液混淆平均。选择合适敏捷度，使上述物质的各峰高约为总量程的70%，为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点（其内标苯并\[e\]芘的浓度值不变），用此两种浓度的混淆标准物进行色谱剖析，结果见色谱图，维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微办理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。图71维生素A和维生素E色谱图3高效液相色谱剖析色谱条件（介绍条件）如下：预柱：ultrasphereODS10μm，4mm×4.5cm。剖析柱：ultrasphereODS5μm，4.5mm×25cm。流动相：甲醇+水=98+2。混匀，于临用前脱气。紫外检测器波长：300nm。量程0.02。进样量：20μl。流速：1.7ml/min。样品剖析取样品浓缩液20μl，待绘制优秀谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。（1）定性：用标准物色谱峰的保存时间定性。（2）定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查测其含量。或用回归方程求出其含量。五、实验结果与剖析X=cm×V×1001000②式中：X——某种维生素的含量（mg/100g）；c——由标准曲线上查到某种维生素含量（μg/ml）；V——样品浓缩定容体积（ml）；m——样品质量（g）。计算结果表示到三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。六、实验报告七、注意事项维生素A极易被损坏，实验操作应在微弱光芒下进行，或用棕色玻璃仪器。在皂化过程中，应每5min摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。提取过程中，振摇不应太强烈，防止溶液乳化而不易分层。洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，免得被测样品含量有损失。用高纯氮吹干时，氮气不能开得太大，防止样品吹出瓶外结果偏低。 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf （1）实验七食物中脂溶性维生素含量剖析（高效液相色谱法——HPLC）一、实验目的与要求目的认识高效液相色谱仪的工作原理（2）实验七食物中脂溶性维生素含量剖析（高效液相色谱法——HPLC）一、实验目的与要求目的认识高效液相色谱仪的工作原理（3）三、实验仪器与试剂1仪器1）实验室常用设施（4）4）无水硫酸钠（5）临用前用紫外分光光度法标定其正确浓度