一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β-环糊精载纳米粒的制备方法

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112656776A(43)申请公布日2021.04.16(21)申请号202110198753.8(22)申请日2021.02.22(71)申请人西南医科大学附属医院地址646000四川省泸州市江阳区太平街25号(72)发明人李远志　(51)Int.Cl.A61K9/51(2006.01)A61K31/352(2006.01)A61K47/40(2006.01)A61K47/18(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图5页(54)发明名称一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β-环糊精载纳米粒的制备 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 (57)摘要本申请公开了一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，涉及医药技术领域，包括以下步骤：S1、以β‑环糊精为核心，Sn(Oct)2作催化剂，诱发ε‑己内酯开环聚合，合成β‑环糊精共聚物β‑CD‑CL；S2、并依据cRGD肽是整合素αvβ3特异性受体，对β‑CD‑CL端基进行活化；S3、靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒的制备；S4、靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米稳定性研究。本发明的制备方法操作简单，不会对环境产生污染，反应条件温和，反应后得到的外泌体载体制备简单，所得到的β‑环糊精载纳米粒，免疫原性低、长循环、安全性好，易于装载药物。CN112656776ACN112656776A权　利　要　求　书1/2页1.一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、以β‑环糊精为核心，Sn(Oct)2作催化剂，诱发ε‑己内酯开环聚合，合成β‑环糊精共聚物β‑CD‑CL；S2、并依据cRGD肽是整合素αvβ3特异性受体，对β‑CD‑CL端基进行活化，与cRGD肽连接，使其能与整合素αvβ3特异性偶联，以进一步构建αvβ3靶向β‑环糊精共聚物纳米载体β‑CD‑CL‑αvβ3；S3、靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒的制备：以αvβ3‑野黄芩素纳米粒的粒径、多分散性指数PDI、Zeta电位、包封率、载药量为评价手段，考察野黄芩素浓度、药料质量比、油水相体积比对αvβ3‑野黄芩素纳米粒制备的影响，筛选对β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒制备影响较大的因素并得出最佳优化条件；S4、靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米稳定性研究：将β‑CD‑CL‑Scu与含10％FBS的DMEM完全培养基以1∶8(v/v)比例混合于37℃条件下孵育72h，在预定时间点取1mL样品溶液，采用MalvernZetasizerNano‑ZS90粒度仪测定其粒径和多分散性指数PDI，监测纳米粒的粒径分布情况。2.根据权利要求1所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于：纳米粒的检测 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 包括检测粒径、多分散性指数PDI、Zeta电位、包封率、载药量。3.根据权利要求2所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于：检测方法包括以下步骤：A、称取β‑CD于50mL三口烧瓶中，加入ε‑己内酯，在磁力搅拌下缓缓滴入10mL对二甲苯，使反应物完全溶解，溶解后在N2保护下，加入催化剂(Sn(Oct)2，在120℃条件下反应36h；后处理：停止反应，向反应产物中滴加15mL二氯甲烷，后将其恒速滴加到300mL的冰乙醚中，有大量沉淀析出，过滤，得到滤饼，置于40℃真空干燥箱干燥24h直至恒重，即得产物β‑CD‑CL；B、采用超声乳化法制备Scu‑IR780‑NPs，具体操作如下：精密称取10mg野黄芩素，加入三氯甲烷和甲醇的混合溶液1mL充分溶解，然后精密称取100mg载体材料β‑CD‑CL，用3mL三氯甲烷充分溶解至澄清透明，精密称取0.5mg IR780粉末加入到上述β‑CD‑CL三氯甲烷溶液并充分分散，将Scu溶液与β‑CD‑CL和IR780三氯甲烷溶液混合作为油相，在涡旋振荡的条件下滴加到10mL PVA水溶液中，然后利用超声破碎仪进行超声乳化，将超声后的溶液置于通风橱中搅拌过夜，去除有机溶剂，有机溶剂挥发完全后，利用100KD超滤管对Scu‑IR780‑NPs进行超滤，去除残余的PVA，最终纳米颗粒用βH6.5的MES缓冲液重悬分散；C、利用碳二亚胺法将Scu‑IR780‑NPs表面修饰cRGD，精密称取19.2mg EDC和11.5mg NHS加入到10mL上述Scu‑IR780‑NPs溶液中，于室温孵育25min，然后通过100KD超滤管去除EDC/NHS反应副产物，加入含有10mg cRGD的PB溶液，室温反应4h，最后通过超滤多次去除未反应的cRGD，并用超纯水重悬分散。4.根据权利要求1所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于：所述S4中，预定时间点包括1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h。5.根据权利要求3所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊2CN112656776A权　利　要　求　书2/2页精载纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，β‑CD的量为227.3mg，0.2mmol，ε‑己内酯的量为4.65mL，42mmol。6.根据权利要求3所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤B中，三氯甲烷和甲醇的比例为3∶1。7.根据权利要求3所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤B中，超声破碎仪在冰浴状态下进行超声乳化，功率为100W，时间为5min。8.根据权利要求3所述的一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤C中，PB溶液的pH值为7.4。3CN112656776A说　明　书1/7页一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法技术领域[0001]本申请涉及医药技术领域，尤其涉及一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法。背景技术[0002]随着分子生物学、免疫学及相关学科的发展，以及在治疗前列腺癌对雄激素撤退产生抵抗和化疗药耐药等分子机制的研究中，基因治疗逐渐显示了其巨大的优势，具有靶向性好、毒副作用小及可特异性地杀伤肿瘤细胞等特点。但是外源基因容易发生体内降解，因此基因治疗应用于临床还需要一种安全、高效、稳定的传递载体进行递送。随着近年来纳米靶向递药系统的发展，将纳米靶向载药系统与基因治疗技术联合应用已逐渐成为生物技术药物领域的研究热点，也被认为是癌症治疗中最具前景的方向。[0003]目前对于靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法较为复杂，不利于纳米粒的制备，所制备的纳米粒载药量较低。发明 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 [0004]本发明的目的在于提供一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，以解决上述背景技术中提出现有技术中的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。[0005]一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，包括以下步骤：[0006]S1、以β‑环糊精为核心，Sn(Oct)2作催化剂，诱发ε‑己内酯开环聚合，合成β‑环糊精共聚物β‑CD‑CL；[0007]S2、并依据cRGD肽是整合素αvβ3特异性受体，对β‑CD‑CL端基进行活化，与cRGD肽连接，使其能与整合素αvβ3特异性偶联，以进一步构建αvβ3靶向β‑环糊精共聚物纳米载体β‑CD‑CL‑αvβ3；[0008]S3、靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒的制备：以αvβ3‑野黄芩素纳米粒的粒径、多分散性指数PDI、Zeta电位、包封率、载药量为评价手段，考察野黄芩素浓度、药料质量比、油水相体积比对αvβ3‑野黄芩素纳米粒制备的影响，筛选对β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒制备影响较大的因素并得出最佳优化条件；[0009]S4、靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米稳定性研究：将β‑CD‑CL‑Scu与含10％FBS的DMEM完全培养基以1∶8(v/v)比例混合于37℃条件下孵育72h，在预定时间点取1mL样品溶液，采用MalvernZetasizerNano‑ZS90粒度仪测定其粒径和多分散性指数PDI，监测纳米粒的粒径分布情况。[0010]优选的，纳米粒的检测标准包括检测粒径、多分散性指数PDI、Zeta电位、包封率、载药量。[0011]优选的，检测方法包括以下步骤：4CN112656776A说　明　书2/7页[0012]A、称取β‑CD于50mL三口烧瓶中，加入ε‑己内酯，在磁力搅拌下缓缓滴入10mL对二甲苯，使反应物完全溶解，溶解后在N2保护下，加入催化剂(Sn(Oct)2，在120℃条件下反应36h；后处理：停止反应，向反应产物中滴加15mL二氯甲烷，后将其恒速滴加到300mL的冰乙醚中，有大量沉淀析出，过滤，得到滤饼，置于40℃真空干燥箱干燥24h直至恒重，即得产物β‑CD‑CL；[0013]B、采用超声乳化法制备Scu‑IR780‑NPs，具体操作如下：精密称取10mg野黄芩素，加入三氯甲烷和甲醇的混合溶液1mL充分溶解，然后精密称取100mg载体材料β‑CD‑CL，用3mL三氯甲烷充分溶解至澄清透明，精密称取0.5mg IR780粉末加入到上述β‑CD‑CL三氯甲烷溶液并充分分散，将Scu溶液与β‑CD‑CL和IR780三氯甲烷溶液混合作为油相，在涡旋振荡的条件下滴加到10mL PVA水溶液中，然后利用超声破碎仪进行超声乳化，将超声后的溶液置于通风橱中搅拌过夜，去除有机溶剂，有机溶剂挥发完全后，利用100KD超滤管对Scu‑IR780‑NPs进行超滤，去除残余的PVA，最终纳米颗粒用pH6.5的MES缓冲液重悬分散；[0014]C、利用碳二亚胺法将Scu‑IR780‑NPs表面修饰cRGD，精密称取19.2mg EDC和11.5mg NHS加入到10mL上述Scu‑IR780‑NPs溶液中，于室温孵育25min，然后通过100KD超滤管去除EDC/NHS反应副产物，加入含有10mg cRGD的PB溶液，室温反应4h，最后通过超滤多次去除未反应的cRGD，并用超纯水重悬分散。[0015]优选的，所述S4中，预定时间点包括1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h。[0016]优选的，所述步骤A中，β‑CD的量为227.3mg，0.2mmol，ε‑己内酯的量为4.65mL，42mmol。[0017]优选的，所述步骤B中，三氯甲烷和甲醇的比例为3∶1。[0018]优选的，所述步骤B中，超声破碎仪在冰浴状态下进行超声乳化，功率为100W，时间为5min。[0019]优选的，所述步骤C中，PB溶液的pH值为7.4。[0020]本发明的有益效果是：本发明的制备方法操作简单，不会对环境产生污染，反应条件温和，反应后得到的外泌体载体制备简单，所得到的β‑环糊精载纳米粒，免疫原性低、长循环、安全性好，易于装载药物。附图说明[0021]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：[0022]图1为本发明的凝胶渗透色谱检测结果示意图；[0023]图2为本发明的红外光谱检测结果示意图；[0024]图3为本发明的透射电子显微镜检测结果示意图；[0025]图4为本发明的β‑CD‑CL载药微球动态光散射结果示意图；[0026]图5为本发明的β‑CD‑CL载药靶向微球动态光散射结果示意图；[0027]图6为本发明的β‑CD‑CL载药微球表面zeta电位检测结果示意图；[0028]图7为本发明的β‑CD‑CL载药靶向微球表面zeta电位检测结果示意图；[0029]图8为本发明的荧光光谱检测结果示意图；[0030]图9为本发明的野黄芩素累积释放率曲线图；5CN112656776A说　明　书3/7页[0031]图10为本发明的核磁分析图。具体实施方式[0032]为使本申请的目的、技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。[0033]以下结合附图，详细说明本申请各实施例提供的技术方案。[0034]一种抗结肠癌的中药单体野黄芩素靶向整合素αvβ3的β‑环糊精载纳米粒的制备方法，包括以下步骤：[0035]1.整合素αvβ3靶向β‑环糊精共聚物的制备与表征研究[0036]方法：以β‑环糊精为核心，Sn(Oct)2作催化剂，诱发ε‑己内酯开环聚合，合成β‑环糊精共聚物β‑CD‑CL；并依据cRGD肽是整合素αvβ3特异性受体，对β‑CD‑CL端基进行活化，与cRGD肽连接，使其能与整合素αvβ3特异性偶联，以进一步构建αvβ3靶向β‑环糊精共聚物纳米载体β‑CD‑CL‑αvβ3。[0037]检测指标：傅里叶变换红外光谱(FT‑IR)、核磁共振氢谱(1H‑NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)对所得聚合物进行结构表征分析。[0038]2.靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒的制备[0039]方法：以αvβ3‑野黄芩素纳米粒的粒径、多分散性指数PDI、Zeta电位、包封率、载药量为评价手段，考察野黄芩素浓度、药料质量比(野黄芩素/载体材料)、油水相体积比(油相/水相)对αvβ3‑野黄芩素纳米粒制备的影响，筛选对β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米粒(β‑CD‑CL‑Scu)制备影响较大的因素并得出最佳优化条件。[0040]检测指标：检测粒径(透射电镜，里来生物)、多分散性指数PDI、Zeta电位、包封率、载药量(紫外分光光度计或HPLC，里来生物)。[0041]3.靶向整合素αvβ3的β‑环糊精共聚物载野黄芩素纳米稳定性研究[0042]方法：将β‑CD‑CL‑Scu与含10％FBS的DMEM完全培养基以1∶8(v/v)比例混合于37℃条件下孵育72h，在每一个时间点(1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h)取1mL样品溶液，采用MalvernZetasizerNano‑ZS90粒度仪测定其粒径和多分散性指数PDI，监测纳米粒的粒径分布情况。[0043]4.载野黄芩素整合素靶向β‑CD‑CL微球制备及表征[0044]1、实验思路[0045]本项目首先制备了β环糊精衍生物β‑CD‑CL共聚物并包裹野黄芩素形成纳米微球，并在表面修饰cRGD。[0046]2、实验步骤[0047]称取β‑CD(227.3mg，0.2mmol)于50mL三口烧瓶中，加入ε‑己内酯(4.65mL，42mmol)，在磁力搅拌下缓缓滴入10mL对二甲苯，使反应物完全溶解。溶解后在N2保护下，加入催化剂(Sn(Oct)2(0.1％w/w)，在120℃条件下反应36h。后处理：停止反应，向反应产物中滴加15mL二氯甲烷，后将其恒速滴加到300mL的冰乙醚中，有大量沉淀析出，过滤，得到滤饼，置于40℃真空干燥箱干燥24h直至恒重，即得产物β‑CD‑CL。6CN112656776A说　明　书4/7页[0048]采用超声乳化法制备Scu‑IR780‑NPs，具体操作如下：精密称取10mg野黄芩素(Scu)，加入三氯甲烷和甲醇的混合溶液(3∶1)1mL充分溶解。然后精密称取100mg载体材料β‑CD‑CL，用3mL三氯甲烷充分溶解至澄清透明。精密称取0.5mg IR780粉末加入到上述β‑CD‑CL三氯甲烷溶液并充分分散。将Scu溶液与β‑CD‑CL和IR780三氯甲烷溶液混合作为油相，在涡旋振荡的条件下滴加到10mL PVA水溶液(3％)中，然后利用超声破碎仪进行超声乳化(100W，5min，冰浴)。将超声后的溶液置于通风橱中搅拌过夜，去除有机溶剂。有机溶剂挥发完全后，利用100KD超滤管对Scu‑IR780‑NPs进行超滤，去除残余的PVA，最终纳米颗粒用pH6.5的MES缓冲液重悬分散。[0049]利用碳二亚胺法将Scu‑IR780‑NPs表面修饰cRGD。精密称取19.2mg EDC和11.5mg NHS加入到10mL上述Scu‑IR780‑NPs溶液中，于室温孵育25min，然后通过100KD超滤管去除EDC/NHS反应副产物，加入含有10mg cRGD的PB溶液(pH7.4)，室温反应4h。最后通过超滤多次去除未反应的cRGD，并用超纯水重悬分散。[0050]实验试剂[0051][0052]实验仪器7CN112656776A说　明　书5/7页[0053][0054]检测表征[0055]1)凝胶渗透色谱检测检测[0056]检测结果：参阅图1，通过凝胶渗透色谱检测β‑CD‑CL共聚物分子量：[0057]检测结论：β‑CD‑CL共聚物分子量为10396，符合聚合物分子量大小。[0058]2)红外光谱检测[0059]参阅图2，检测结论：β‑CD末端的羟基伸缩振动特征峰O‑H为3392.5cm‑1，β‑CD上亚甲基的不对称伸缩振动峰C‑H为2928.9cm‑1，亚甲基的面内弯曲振动峰C‑H为1417.4cm‑1，β‑CD上C‑O‑C键(醚基)的不对称伸缩振动峰C‑O‑C为1028.6cm‑1；β‑CD‑CL的红外谱图所示β‑CD‑CL上的酯基伸缩振动峰C＝O为1726.7cm‑1，结构单元中亚甲基的伸缩振动峰为2946.8cm‑1(VasC‑H)与2867.5cm‑1(VsC‑H)。此外，β‑CD‑CL上的羟基伸缩振动峰O‑H为3439.9cm‑1，由于β‑CD上的伯羟基被取代导致羟基特征峰强度大大减弱。共聚物β‑CD‑CL的FT‑IR谱图中既有β‑CD特征峰，又有ε‑CL特征峰出现，根据结果初步可判断β‑CD与ε‑CL连接成功。[0060]3)透射电子显微镜检测：[0061]参阅图3，检测结论：β‑CD‑CL载药靶向微球透射电镜图显示电镜尺寸在80‑100nm，呈现均匀分散的球型，并有明显的核壳结构。[0062]4)DLS和表面zeta电位检测：[0063](1)DLS检测[0064]检测结果：[0065]参阅图4，β‑CD‑CL载药微球动态光散射结果[0066]参阅图5，β‑CD‑CL载药靶向微球动态光散射结果[0067]检测结论：偶联cRGD后水合粒径有所增大，从127.1nm增大到140.2nm。β‑CD‑CL载药靶向微球Pdi为0.21，分散性较好。8CN112656776A说　明　书6/7页[0068](2)表面zeta电位检测[0069]参阅图6，β‑CD‑CL载药微球表面zeta电位[0070]参阅图7，β‑CD‑CL载药靶向微球表面zeta电位[0071]检测结论：β‑CD‑CL载药微球偶联cRGD后，表面电位由‑19.3mV变为‑11.3mV，可能是由于偶联cRGD导致表面基团发生变化。[0072]5)荧光光谱检测：[0073]参阅图8，检测结论：如图所示采用720nm激发光激发β‑CD‑CL载药靶向微球，由于微球含有IR780荧光分子(ex/em＝790/810)，扫描750nm‑850nm范围检测到810nm处有发射光，证明微球中含有IR780荧光分子，可进行荧光成像。[0074]6)高效液相色谱检测包封率和载药量，参阅图9和下表；[0075]峰面积浓度(mg/ml)11969420.0221040720.0432838840.0639912440.0849157900.1样品峰面积3613349 3620511 3624509平均值3619456.333浓度(mg/ml)0.066289127[0076]样品质量＝0.067mg/mL*稀释倍数*样品体积＝0.067mg/mL*10*50uL＝33.5ug[0077]此样品为1mg β‑CD‑CL载药靶向微球通过甲醇破乳溶解包含的药物[0078]载药率＝药物质量/微球总质量*100％＝33.5ug/1mg*100％＝3.35％，即1mg微球中含有33.5ug的野黄芩素。[0079]包封率＝药物质量/投料量*100％＝33.5ug/100ug*100％＝33.5％[0080]5、结论[0081]HPLC结果显示野黄芩素载药量为3.35％，包封率为33.5％。包封率较低主要是由于野黄芩素溶解性很差(已尝试氯仿，丙酮，甲醇，乙腈)，相比姜黄素，紫杉醇等。使用之前请涡旋振荡及水浴超声分散。荧光光谱为增值服务，微球携带荧光不会影响微球稳定性和药物装载率，且可以进行体内体外示踪。[0082]6、核磁分析：[0083]参阅图10，图谱基本信息，除溶剂峰外，在5.74，5.69，4.83，4.46，4.34，3.98，3.63，3.36，2.27，1.53，1.29处有明显的质子峰。但3.98，2.27，1.53，1.29ppm处的信号明显强于其他信号。[0084]图谱解析[0085]目标化合物主要由两部分构成，环糊精及PCL片段，其中，5.74，5.69ppm两处信号对应环糊精结构上朝内的两个羟基上的质子，4.83，3.63，3.36ppm处的信号对应环糊精结构式行亚甲基及次甲基上的质子，而3.98，2.27，1.53，1.29ppm处较强的信号则对应PCL中9CN112656776A说　明　书7/7页亚甲基上的质子。[0086]结论：核磁图谱中可以找出目标化合物对应的峰，表明产物的生成。[0087]以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。10CN112656776A说　明　书　附　图1/5页图1图211CN112656776A说　明　书　附　图2/5页图3图412CN112656776A说　明　书　附　图3/5页图5图613CN112656776A说　明　书　附　图4/5页图7图814CN112656776A说　明　书　附　图5/5页图9图1015