第三章-病毒和亚病毒因子(1)-PPT幻灯片

第一节病毒一.病毒的形态和结构病毒的发现1892年，科学家伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想是由细菌引起的。但研究结果表明烟草花叶病是由一种可以穿过细菌滤器的病原体引起的。1898年，荷兰细菌学家贝杰林克证实了这一结果，将这种病原体称为“病毒”(virus)。（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒类病毒：只含具侵染性的RNA组分卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分朊病毒：只含蛋白质非细胞生物病毒无细胞结构病毒的定义及分类病毒是一类核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微非细胞生物，本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，能以感染态和非感染态两种状态存在，只在宿主细胞中才具有生命特征。分类寄主：动物病毒、植物病毒、噬菌体遗传物质：DNA病毒、RNA病毒形态：杆状(螺旋状）、多面体、复合型病毒的特征1.形态极其微小2.无细胞构造的分子生物3.只含一种核酸4.高度的寄生性5.通过装配方式进行繁殖6.离体可保持长期的侵染活性7.对抗生素通常不敏感8.有些能够整合到寄主的基因组中病毒众生相艾滋病毒SARS病毒烟草花叶病毒T噬菌体流感病毒狂犬病毒典型病毒粒的构造病毒粒的基本构造和特殊构造衣壳核酸包膜刺突病毒粒(Virion)核衣壳(nucleocapsid)基本构造包膜(envelope)刺突(spike)核酸(nucleicacid)DNAorRNA衣壳(capsid)衣壳粒特殊构造衣壳粒概念：为病毒的最小形态单位，由1~6个多肽分子折叠缠绕成的蛋白质亚单位（三级结构）。特点：不同病毒，多肽分子的组成不同。简单病毒只有1~2种衣壳粒，如：TMV就只含有1种衣壳粒；复杂病毒有20种左右的衣壳粒。衣壳概念:是衣壳粒以对称形式有规律的排列形成的病毒外壳。内包核酸，形状多样。壳体蛋白是许多亚基借次级键或静电引力互相聚合而成的具四级结构的多聚体。特点:亚基的组成和数目的不同是区别不同壳体蛋白的标志。形成衣壳的意义a.具较大的灵活性和方便性；b.减少形成畸形衣壳的可能性；c.避免因合成错误而破坏结构；d.符合遗传节约原则。包膜概念：指核衣壳外包裹的由类脂、多糖或蛋白质组成的一层构造较复杂的包膜，亦称被膜或外膜。包膜的形成：a.来源于宿主细胞膜或核膜:如流感病毒；b.在宿主细胞内合成：如痘苗病毒。带状疱疹病毒的包膜包膜的功能包膜的结构具有高度稳定性。功能：a.维系病毒体结构；b.保护病毒核酸；c.包膜型病毒感染所必需：包膜表面上的糖蛋白识别并结合宿主表面受体；病毒包膜与宿主细胞膜结合；病毒衣壳和病毒基因组进入宿主，完成感染过程。刺突概念：病毒包膜或衣壳表面的突起物。图中可见流感病毒的刺突。功能：a.可启动感染；b.可诱生免疫保护作用；c.可中和抗体；d.可促使病毒从宿主细胞上释放.血凝素（HA）：流感病毒包膜上呈棒状突起的糖蛋白刺突。HA也是流感病毒吸附细胞的结构，可刺激机体产生中和抗体。神经氨酸酶（NA）：流感病毒包膜表面呈蘑菇状突起的糖蛋白刺突。NA可水解病毒与细胞之间的黏附物质神经氨酸，因此可帮助病毒从感染细胞膜表面释放。二者均易发生变异，大变异可造成亚型改变。病毒的核酸–dsDNA/ssDNAdsRNA/ssRNA–线状/环状，闭环/缺口环–单分子/双分子/三分子/多分子病毒核酸的功能储存病毒的遗传信息控制病毒的遗传变异控制病毒的增殖控制病毒对宿主的感染性病毒的对称形式螺旋对称如烟草花叶病毒二十面体对称如腺病毒复合对称如T偶数噬菌体二十面体对称的结构特征特点：1)球或近球形；2)高倍电镜下为多面体,具20个等边三角形和12个顶点的物体；3)多面多角多棱,是多颗粒按一定方式对称排列形成,在角上为五邻体（penton)，面上六邻体(hexon)。形成原因：1)从拓扑学看，廿面体容积最大；2)最小单位面所需亚基少，利于遗传节约；3)亚基易于对称排列，等价或准等价成键结合；综上，廿面体对称结构更稳定、更合理。代表：腺病毒螺旋对称的结构特征形状：多为杆状、纤维状、弯曲杆状。特点：长形的衣壳粒螺旋状排列，形成中空的圆柱体，衣壳粒间为准等价结合，直径取决于蛋白亚基的特征，长度取决于核酸分子的长度；核酸埋嵌在衣壳粒之间的壁内，以多个弱键与蛋白质亚基相连。此方式可控制螺旋排列，同时增加壳体结构的稳定性。此形状多为RNA病毒，具螺旋对称的动物病毒多有包膜。代表：烟草花叶病毒复合对称的结构特征大肠杆菌的T4噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。病毒的群体形态包涵体空斑枯斑蚀（噬）斑测定(plaqueassay)：以病毒感染性作为病毒数目测定的依据。在生长的宿主表面，铺上细菌或动物病毒，在单层细胞上形成的蚀（噬）斑，可以认为由单个病毒增殖产生的。由此，可以通过蚀（噬）斑形成单位(pfu)来计算单位体积样品中病毒的数量。二.四类病毒的繁殖方式原核生物的病毒植物病毒人和脊椎动物的病毒昆虫病毒噬菌体的形态与组成基本形态:蝌蚪形——复合对称结构微球形——廿面体对称结构纤丝形——螺旋对称结构其中约95%为蝌蚪形。噬菌体的形态类型dsDNA,蝌蚪状，非收缩性尾；B.dsDNA,蝌蚪状，非收缩性长尾；C.dsDNA,非收缩性短尾；D.ssDNA,球状，大顶衣壳粒；E.ssRNA,球状，小顶衣壳粒；F.ssDNA,丝状，无头尾噬菌体的结构头部——廿面体对称结构；组成：蛋白质、小肽、多胺、内含DNA。颈环——六角形薄盘状、连接头尾的结构；附颈须。尾鞘(tailsheath):长95nm,衣壳粒螺旋对称；可伸缩,伸展时24转，收缩时12转。尾管(tailtube):长80-100nm，中空，DNA可由此进入细胞。基板(baseplate):六角形盘状物，中空，其角上有刺突、尾丝。刺突(spike):长20nm，有吸附功能。尾丝(tailfiber):长140nm，有识别吸附功能，可专一性的吸附在敏感细胞表面相应受体上。尾部噬菌体的增殖主要内容烈性噬菌体的裂解周期一步生长曲线温和噬菌体的溶源性反应噬菌体的增殖根据噬菌体与宿主的关系，可将噬菌体分为2类：烈性噬菌体（virulentphage)：指感染后短时间内能连续完成繁殖过程而使宿主细胞裂解的噬菌体.温和噬菌体(temperatphage)：噬菌体感染细胞后，将其基因组核酸整合（附着）到宿主的基因组上，并随宿主基因组的复制而同步，但不引起宿主细胞裂解，而是导致溶源性发生的噬菌体。(一)烈性噬菌体的增殖烈性噬菌体的增殖亦称裂解性周期或增殖性周期。其裂解周期为：1)吸附(adsorption,attachment)2)侵入(entory,penetration,injection,induction)3)复制(生物合成biosynthesis）/增殖(replication)4)成熟(maturation)/装配(assembly)5)(裂解)释放(release)1.吸附噬菌体特异性识别专性的细菌细胞的过程。①吸附蛋白(在尾丝上)功能：启动感染,特异性识别宿主细胞,与宿主细胞表面受体发生结合.②细胞受体(图中红箭头示)G+细胞壁上的肽聚糖、磷壁酸，G－细胞壁上的LPS以及鞭毛、荚膜、菌毛上均有噬菌体吸附的位点。2.侵入核酸注入细胞的过程。A.无收缩尾部:由引导蛋白引导核酸进入细胞。B.有收缩尾部：当尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突“钉”在细胞表面，在细胞表面“钻孔”（刺突上常含酶类物质，可降解细胞表面）；尾鞘收缩；头部蛋白质构象改变；头部蛋白质与核酸结合松散；核酸注入细胞。3.增殖核酸复制和蛋白质合成期，表现为时序性。此时，细胞表面不见噬菌体，故又称为隐蔽期。4.成熟成熟(maturity)，即自我装配(selfassembly)过程。是分期、分批进行的。5.裂解多种酶类(脂肪酶、溶菌酶等)作用，促进细胞裂解，释放子代噬菌体。自外裂解：大量噬菌体吸附在同一宿主细胞表面并释放众多溶菌酶而导致的细胞裂解，仅是一种单纯的溶菌作用，不会导致大量子代噬菌体产生。快速增殖过程（三）噬菌体效价的测定效价:生物制品活性（数量）高低的标志，通常采用生物学方法测定。噬菌体效价：又称噬菌斑形成单位（pfu）数,指每毫升试样中含有侵染性噬菌体的粒子数。优点：1)弥补平板不平2)噬菌斑位于同个平面，较清晰3)上层为半固体培养基，有利噬菌体扩散（四）一步生长曲线定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，用于反映各种噬菌体潜伏期、裂解期和裂解量的特征曲线。实验设计依据：①1个菌体被1个噬菌体感染,避免二次吸附(可引起自外裂解)。②细菌群体被噬菌体同步感染。一步生长曲线的实验过程1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）；3、将上述混合物用培养物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞；4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）；5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线；一步生长曲线潜伏期(侵入到装配)：隐晦期+胞内积累期(eclipseperiod)裂解期(lysisperiod)稳定期(steadyperiod)可分以下阶段：潜伏期：是指病毒侵入宿主细胞到病毒粒子释放出胞外前的一段时间。曲线平行于横轴。潜伏前期又称隐蔽期，是指病毒的核酸侵入宿主细胞后至第一个病毒粒子装配前的一段时间，此时宿主细胞内不含有完整的、有侵染力的成熟病毒粒子。潜伏后期，病毒粒子装配成熟，胞内具侵染性的成熟病毒粒子数目逐渐增，但没有释放出胞外。寄主细胞的裂解标志着潜伏期的结束。此期为病毒复制所需的最短时间。为病毒复制的特征性数据。噬菌体以分钟计；动植物病毒以小时、天计。裂解期：是指宿主细胞迅速裂解，溶液中病毒粒子急剧上升的一段时间。病毒没有个体生长，其宿主细胞裂解也是突发的。曲线表现为直线上升。稳定期：是指感染病毒的宿主细胞全部裂解，溶液中病毒效价达到最高点以后的时期。曲线呈一个平顶。一步生长曲线的特征数据两个特征性数据潜伏期：是病毒颗粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒颗粒所需的最短时间，不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。裂解量：是每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，其值等于潜伏期受染细胞的数目除稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。通过一步生长曲线测定，噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。一步生长曲线的意义1)可获知潜伏期；裂解期。2)裂解量(burstsize):每一受感染细胞所产生的子代virion的平均数。数值上等于：裂解量=稳定期噬菌斑数潜伏期噬菌斑数（五）温和噬菌体与溶源性某些噬菌体侵染细菌后，将自身基因组整合到细菌细胞染色体上，随宿主细胞分裂而同步复制，并不引起细菌裂解释放噬菌体，因而被称作温和噬菌体（temperatephage）。这种噬菌体与细菌共存的特性称为溶原性（lysogeny），被侵染的细胞被称作溶原性细胞或溶原菌（lysogen），整合到细菌细胞染色体上的病毒被称作前病毒或前噬菌体（prophage）。温和噬菌体的特点温和噬菌体：能导致溶源性反应的噬菌体。1）特点:a.均为dsDNA。b.不同类型的温和噬菌体与宿主DNA的结合位点不同。2）状态：a.游离态—成熟后被释放并具有侵染性的游离噬菌体粒子。b.整合态—即整合在宿主基因组上的前噬菌体状态。c.营养态—前噬菌体因自发或经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。λ噬菌体的溶原和裂解周期细胞反复分裂溶原途径裂解途径溶原性是一种比裂解反应更有利于噬菌体持续和传播的生存方式;可随之复制可传至宿主后代的特性。λ噬菌体的整合过程溶原性的特点溶原性转变（lysogenicconversion）：温和噬菌体在菌体细胞内以前噬菌体形式存在可导致宿主细胞的表型改变，这种改变与其生命周期是否完成没有直接关系，这种改变称为溶原性转变。免疫作用：前噬菌体基因还导致溶原性细菌对同类型噬菌体的侵染具有免疫作用，阻止携带与溶原性菌体所含的前噬菌体DNA相同的噬菌体的吸附和生物合成。但这种免疫作用不能阻止溶原菌体被别种类型的温和噬菌体或烈性噬菌体所侵染。前噬菌体基因的表达可以产生一种λ阻遏蛋白，抑制该病毒自身在菌体内的复制作用。溶原性的特点致病性改变：某些溶原菌体还因所含的前噬菌体的作用导致致病性改变。如白喉棒状杆菌(Corynebecteriumdiphtheriae)和肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)一旦被相应的温和噬菌体侵染，含有了编码毒素基因的前噬菌体后，就从不产生毒素的菌株转变为产毒素的菌株，造成侵染组织的损伤，分别引发白喉和肉毒中毒症状。溶原性可以是可逆的：前噬菌体可以自发地或在外界刺激诱导下被激活，裂解寄主细胞，进入裂解途径。前噬菌体离开细菌基因组进入裂解途径的几率很低（约1/10000-1/100000）。溶原菌的特点1.概念：基因组上整合有前噬菌体的宿主菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。2.特点：a.可稳定遗传；b.可诱导裂解:用化学、物理诱导;c.可自发裂解:10-2～10-5；d.具有“免疫性”；e.可复愈：自然遗失前噬菌体;f.溶源转变：产生新的生理特征。溶原菌的检出培养UV辐射（诱导裂解）复制培养（进入裂解周期）离心取上清与敏感菌倒平板菌落周围出现透明圈即为溶源性细菌溶源菌独特的噬菌斑形态形成原因：溶源菌在细胞分裂过程中有极少数个体会引起自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔。溶源菌独特的噬菌斑形态三.植物病毒与动物病毒---病毒粒子形态螺旋对称---通过昆虫、伤口等传播途径进入宿主细胞---核酸主要为ssRNA---引起花叶、黄化、从枝、枯斑等症状植物病毒的特点植物病毒的形态植物病毒的形态植物病毒的装配TMV的装配模式TMV的装配模式动物病毒与人类疾病2008年诺贝尔医学或生理奖获得者：楚尔.豪森发现人乳头瘤病毒能导致宫颈癌动物病毒与人类疾病动物病毒的核酸类型腺病毒CAR蛋白（coxsackie/adenovirusreceptor）HIVT-辅助细胞上的CD4流感病毒A型黏膜细胞上含唾液酸的糖蛋白狂犬病毒神经元上乙酰胆碱动物病毒与人类疾病动物病毒与人类疾病动植物病毒的复制周期吸附(adsorption)侵入(penetration)脱壳(uncoating)生物合成(biosynthesis)装配和释放吸附：病毒粒子与敏感细胞表面特异性受体的接触、结合的过程。可逆吸附：由随机碰撞、布朗运动、静电引力引起。不可逆吸附:病毒粒子与敏感细胞表面特异性的化学组分形成牢固的结合，病毒体结构随之发生改变，则吸附病毒不再感染。吸附左：E.coliphage吸附在E.coli上；右：腺病毒吸附在鸡红细胞上1)内吞作用：吞入的病毒在吞噬小泡中，与溶酶体结合后释放。2)受体介导的内吞作用：受体与病毒（脊髓灰质炎病毒）多价的相互作用;引起病毒结构变化，病毒直接穿入，又称为移位。3)与细胞膜融合：由包膜病毒具有的细胞融合活性的包膜糖蛋白介导，核衣壳进入。侵入1.动物病毒左：膜融合（membranefusion);右：内吞作用(endocytosis)侵入2.植物病毒1)携带病毒的介体在植物上取食(具吸吮口器的昆虫)2)自然或人为造成植物细胞壁破损(如摩擦接种)3)经植物细胞的胞外连丝进入,增殖后经胞间连丝扩散。多为受体介导，温度为35~38℃时，在宿主细胞水解酶和热裂解酶作用下，在细胞质内完成。有四种情况：1)经溶酶体酶的作用脱壳：如包膜病毒和内吞进入的病毒；2)病毒自己合成脱壳酶脱壳：如痘苗病毒；3)对蛋白酶敏感脱壳：壳体变形破损的病毒；4)个别病毒不完全脱壳：如呼肠孤病毒；脱壳生物合成利用宿主的RNA聚合酶合成病毒mRNA，再在细胞质中进行转译并合成蛋白质。动物病毒的装配和释放1）有包膜DNA病毒2）有包膜RNA病毒3）无包膜病毒1）有包膜DNA病毒a.包膜成分同核膜的DNA复制在核内,蛋白质在细胞之中合成后入核，装配好后以出芽的方式再到细胞质中，经细胞通道或裂解细胞释放。b.包膜成分同细胞膜的：出芽或排废方式释放动物病毒的装配和释放2)有包膜的RNA病毒装配释放均在细胞质中同步进行，以出芽方式通过细胞膜，包膜同细胞膜。3)无包膜的病毒DNA病毒装配分步进行；RNA病毒壳体的形成与核酸的结合几乎同步进行；***二者均由细胞裂解释放***包膜蛋白插入膜中，细胞膜出芽方式释放病毒粒子。出芽方式释放e.g.流感病毒：-ssRNA）病毒粒子的感染与释放裂解感染持续感染潜伏感染正常细胞转化成肿瘤细胞潜伏感染正常细胞转化成肿瘤细胞动物病毒的感染结果动物病毒的感染结果动物病毒的感染结果HIV感染CD4淋巴细胞HIV的结构及生活史HIV的感染过程HIV的感染过程HIV的发展过程HIV的发展过程●疫苗昆虫病毒昆虫病毒是引起昆虫致病和死亡的重要病原体。最早关于昆虫病毒的记载是中国，在1149年出版的《农书》中，就记载有家蚕的“高节”“脚肿”病，这就是现在所称的核型多角体病毒病。多角体：包裹着病毒粒子、光学显微镜可见的碱溶性结晶蛋白质。多角体----核型多角体病毒（NPV）杆状病毒科。在昆虫细胞核内增殖，具有蛋白质包含体的杆状病毒，数量最多。----质型多角体病毒（CPV）杆状病毒科。在昆虫细胞质内增殖，可形成蛋白质包含体的球状病毒。----颗粒体病毒（GV）呼肠孤病毒科。具有病毒包含体，且每个包含体内通常仅含一个病毒粒子。昆虫病毒的类型多角体大小常因寄主昆虫种类的不同而不同，甚至在统一寄主细胞内，多角体的形状大小也有区别。常见的形状有三角形、四角形、五角形、立方体、不规则形等。核型多角体病毒（NPV）NPV对昆虫的侵染感病特征(以鳞翅目为例)：感病初期无明显异常变化;行动迟缓食欲减退，体色变淡或呈油光;病虫常爬向寄主植物高处，死前体躯变软;以腹足紧附枝叶倒挂而死;皮肤则脆弱易裂，破后流出乳白色或褐色的浓稠液体，内含大量新形成的核多角体。质型多角体病毒(CPV)在被感染细胞的细胞质内形成。质型多角体呈六角形、四角形、球形、椭圆形等。质型多角体的直径为0.5μm～25μm，1个多角体可包埋100～10000个病毒粒子。病毒粒子为球形二十面体，直径为30nm～60nm，有内、外两个二十面壳，每个壳有12个小单位构造。家蚕CPV包含体的形态CPV对昆虫的侵染感病特征：早期食欲不振、体躯变小，有时虫体比例不当，头部显得大。中肠中多角体的大量增殖使体色改变为黄色或淡白色等。中肠细胞液化后，多角体可被呕出或由粪便排出。颗粒体病毒(GV)先在被感染细胞的核内形成，但当核膜破裂后可溢出到细胞质内。包含体很小。在电子显微镜下观察，颗粒体的形状有卵形、椭圆形、长卵形等，通常直径为0.1～0.3μm，长0.3～1.0μm。每个包涵体内一般只有一个病毒粒子。有时也出现不正常的形状。霜天蛾GV的形态小菜蛾GV的形态GV对昆虫的侵染感病特征：感染初期无明显病征之后出现反应迟钝和停止取食随后虫体颜色发生改变，血液渐变乳白感病虫体可能膨大或收缩已死幼虫体壁脆弱，破后流出大量颗粒体。染病幼虫可存活较长时间。病死虫体有时用腹足倒挂枝叶上，呈“Λ”形。