Binding Assay ProtocolBindingAssayProtocolWenzhiTian01/04/10ProceduresforBindingActivityofAnti-MSPRAntibodyA.Reagents&Materials:∙Testagent:Chimericanti-MSPRantibody(MS20)∙Antigenforcoating:recombinanthumanMSPR-Fc(R&DSystems,Cat#1947-MS-050)∙Coatingbuffer:SodiumCarbonate,pH9.5∙Washi...
BindingAssayProtocolWenzhiTian01/04/10ProceduresforBindingActivityofAnti-MSPRAntibodyA.Reagents&Materials:∙Testagent:Chimericanti-MSPRantibody(MS20)∙Antigenforcoating:recombinanthumanMSPR-Fc(R&DSystems,Cat#1947-MS-050)∙Coatingbuffer:SodiumCarbonate,pH9.5∙Washingbuffer:0.05%PBS-T(0.5%Tween-20inPBS)∙Blockingbuffer:3%milkinPBS-T∙Sampledilutionbuffer:3%milkinPBS-T∙2ndAb-HRP:GoatF(ab')2anti-humankappa,HRP-conjugated(Biosource,Cat#AHI1804)∙Substrate:TMBPeroxidaseSubstrateA(Cat#50-76-02,Lot#ZE020)∙PeroxidaseSolutionB(H2O2)(Cat#:50-65-02,Lot#ZF051)∙Stopsolution:1NH2SO4B.Procedures:1.Coata96-wellplatewithrhMSPR-Fcprotein(100ng/well)in100lofcoatingbufferforO/N;2.Washtheplateoncewithwashingbuffer;3.Blocktheplatewithblockingbuffer(150l/well)for1houratRT;4.Washtheplateoncewithwashingbuffer;5.Adjusttheanti-MSPRantibodytobe5nM(750ng/ml);6.Inaseparatefreshplate,seriallydilutetheanti-MSPRantibodyfrom5,2.5,1.25,until0.005nM;7.TransferthedilutedantibodysolutiontotherhMSPR-Fc-coatedplate;8.IncubatetheplateatRTfor1houronarotator;9.Washingtheplatewithwashingbufferfor5times;10.Add2ndantibody(GoatF(ab')2anti-humankappa.,HRP-conjugated)ata1:5000 dilution,incubateatRTfor1hour;11.Washingtheplatefor7times;12.PreparethesubstratesolutionbymixingTMBSubstrateAandSubstrateBattheratioof1:1;13.Addthesubstrate(100l/well),andincubateatRTupto10minutesoruntilthecolorischangedtoblue;14.Add50lofStopsolutiontostopthereaction;15.Determinetheabsorbanceat450nMinastandardplatereader.
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