现代分子生物学第五章课件

名词：5分子生物学研究方法(上)生物技术、基因工程、生物工程、蛋白质组学、生物芯片、RNA干扰、基因敲除技术、大规模克隆技术、遗传多态性：SNP、RFLP、…5.1重组DNA技术回顾几个重要技术的原理和操作：5.1DNADNA操作技术(包括基因克隆及相应的筛选鉴定和分析)、5.2DNA基本操作技术RNA操作技术(分离纯化,特别是mRNA纯化/反转录,iRNA)、5.3RNA基本操作技术PCR技术及PCR演生技术、凝胶电泳、分子杂交、5.4SNP的理论与应用DNA文库的构建(g/cDNAlibrary)、5.5基因克隆技术定点突变技术\、基因表达分析技术、5.6蛋白质组学及其研究技术DNA测序及自动化测序仪的原理、DNA足迹试验、蛋白质-蛋白质互作、蛋白质-DNA互作的研究技术、噬菌体展示技术重要工具酶及其应用：限制性核酸内切酶、连接酶、…限制性内切核酸酶被发现的意义？限制-修饰系统？参考书发酵1、生物化学与分子生物学实验技术大规模利用酵母（面向21世纪教材）杨安钢等编高教出版社上千十1928，Flemming2、现代生物技术年九青霉素世瞿礼嘉等编高教出版社纪3、精编分子生物学实验指南Biotechnology（第四版中译版）科学出版社KarlEreky(1917,Hungary)4、基因克隆实验指南（第三版）甜菜饲料--〉养猪英文影印版/中文版生物制品，初级发酵1970s，DNA重组技术重组DNA技术是现代生物技术的核心重组DNA技术:分子操作DNA技术体外构建重组DNA分子（重组子）：外源DNA+载体基因操作同义词遗传工程转化宿主细胞：向宿主引入重组子向宿主引入基因工程被转化宿主细胞(转化子)稳定遗传和表达新特性核心实验操作:DNA分子的切割与连接、分子杂交、凝胶电泳、意义和应用：DNA分子克隆；遗传修饰；特定产品表达细胞转化、序列分析及人工合成、PCR、定点突变……限制性核酸内切酶5.1重组DNA技术回顾5.1.1限制性核酸内切酶可分为两类：理论基础：核酸酶1940s：DNA是遗传物质核酸外切酶（exonuclease）：从核酸的末端一个接一个水解核苷酸；1950s：DNA双螺旋结构核酸内切酶：从核酸的链中间水解，磷酸二酯键，1960s：破译遗传密码、中心法则、操作子学说(endonuclease)3’5’1970s：DNA分子的切割与连接：体外DNA重组将核酸分子切断。DNA分子操作的重要“工具”相继被发现直接推动了本领的发展：限制性内切酶来自细菌内具有保护自身遗传物质稳定的限制修饰体系，该体1970，限制性核酸內切酶(RestrictionEndonuclease,RE)系一方面甲基化修饰自体的DNA，为自己所识别而不被内部限制酶水解。外来入1967，DNA连接酶(Ligase)侵DNA没有所识别的标记，则被核酸内切酶水解。此体系具有修饰自己限制外来1973，载体(Vector)的作用，限制性内切核酸酶由此得名，1963年在细菌中发现。1970，宿主细胞(Hostcell)1970，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离纯化了限制性内切酶HindII；Ref.toP156,T5-11972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRIDNA酶学回顾(1955),ArthurKornbergandcolleaguesisolatedDNApolymerase.(1966),B.WeissandC.C.RichardsonisolatedDNAligase.(1968).H.O.Smith,K.W.Wilcox,andT.J.Kelleyisolatedandcharacterizedthefirstsequencespecificrestrictionnuclease.1950S’Phagegrowthrestriction.1960S’Methylaseandnuclease.StewartLinnandWernerArberisolatedexamplesofthetwotypesofRE.1968,Site-specificnuclease.H.O.Smith,K.W.Wilcox,andT.J.Kelley,限制酶重要特点：限制酶类型根据结构,辅因子的需求，切位与作用方式，分为三种类型。第一型限制酶（TypeI）多亚基，同时具有修饰及识别切割的作用；通常其切割位距离识别可达数千个碱基之远。需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）例如：EcoB、EcoK。第二型限制酶（TypeII）只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。无需ATP和SAM。所识别用于DNA分子的鉴定、识别、分析等。的位置多为短的回文序列(palindromesequence)；所剪切的碱基序列通常即为所用于异源DNA黏接重组识别的序列。是遗传工程上实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。第三型限制酶（TypeIII）与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称即：识别特定序列（多为回文序列）；序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfIII。产生粘性末端（5’-P，3’-OH）；产生特定的限制酶片断6bp回文序列限制性片段平平限制性核酸内切酶识别的DNA序列一般为4~8bp。限制性内切核酸酶的命名：对于随机序列，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶的识别切割位点，同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4kb或65kb出现一次识别切割位点。这样大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可按酶的来源的属、种名而定。取属名的第一个字母与种名的头两个字母组能具有切点频率，以便选用合适的内切酶。（4n）成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先至今已发现上千多种限制酶，下表列出了几种最常用的限制性核酸内切酶后分离到种限制酶，则分别命名为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。3HindHindHind限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点BamHⅠG↓GATCCClaⅠAT↓CGATEooRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTTHindⅡGTPy↓PuACKpnⅠGGTAC↓CNotⅠGC↓GGCCGCPstⅠCTGCA↓GSalⅠG↓TCGACSau3AⅠ↓GATCSfiⅠGGCCNNNN↓NGGCCSmaⅠCCC↓GGGXbaⅠT↓CTAGAXhoⅠC↓TCGAG5.1.2DNA连接酶（1967世界上5个实验室同时报道连接酶，1970Khorana实验室发现T4连接酶）大肠杆菌的DNA连接酶：分子量为75KD的一条多肽链，对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。噬菌体T4DNA连接酶单条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。NH4Cl可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。DNA连接酶作用机制：表：DNA克隆的工具酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步：（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA（2）DNA连接酶：催化形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段(1)NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核（3）DNA聚合酶Ⅰ：苷酸)或ATP将其腺苷酰基转移到a.合成双链cDNA中第二条链。DNA连接酶的一个赖氨酸残基的b.缺口平移制做探针。ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸c.DNA序列分析。中间物，同时释放出烟酰胺单核苷d.填补3′末端。酸(NMN)或焦磷酸。（）酶催化反应，聚合(2)将酶-腺苷酸中间物上的腺4TaqPCRDNA苷酰基再转移到DNA的5'-磷酸基（5）反转录酶：端，形成一个焦磷酰衍生物，即a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析DNA-腺苷酸;（6）多聚核苷酸激酶催化DNA5′羟基末端磷酸化，或标记探针(3)这个被激活的5'-磷酰基端（7）碱性磷酸酶：切除DNA5′末端磷酸基可以和DNA的3'-OH端反应合成磷（8）末端转移酶：在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。酸二酯键，同时释放出AMP。（9）DNA酶：切割DNA（10）RNA酶：切割RNA实际应用上：黏端连接平端连接同聚物加尾连接5.1.3载体用于整合重组目的基因，并且具有自主复制能力的DNA分子。限制酶切位点（克隆位点）“Vector”（载体）isanagentthatcancarryaDNAfragmentintoahostcell.IfitisusedforreproducingtheDNAfragment,itiscalleda“cloningvector”（克隆载体）.IfitisusedforexpressingcertaingeneintheDNAfragment,itiscalledan“expressionvector”（表达载体）.Commonlyusedvectorsincludeplasmid（质粒）,Lambdaphage（噬菌体）,cosmid（黏粒）andyeastartificial复制起点chromosome(YAC酵母人工染色体).可作筛选的标记Threecharacteristicsofanidealizedcloningvector含有启动子、操纵序列、甚至于上游YACvectoriscapableofcarryingalargeDNAfragment(upto2Mb),其他表达调节序列酵母游离型质粒(yeastepisomalplasmid)根瘤农杆菌Ti质粒(AgrobacteriumtumefaciensTiplasmid)SV40杆状病毒反转录病毒Characteristicsofanidealizedexpressionvector穿梭载体？直基基因枪因枪动物植最常用的细菌质粒接电激转化细物pUC18电激转化胞细特点：基转微注射胞化原生质体//脂质体、个体小，载因15.2kb/PEG//PEG/花粉管量大。2、寄主中拷贝数多转载体介导转化转质粒载体原核细胞宿主的大于500。基因克隆或表达、噬菌体载体基因克隆或表达、3、多克隆位点。化序列分析鉴定、化黏粒载体文库等4、lacZ基因位于多酶人工染色体载体切为点区，方便筛选。人工染色体载体文库昆虫杆状病毒载体5、带有氨苄青霉素哺乳动物病毒载体转基因、基因R哺乳动物病毒载体抗性基因amp利于附加或敲除、植物病毒载体筛选。基因治疗等TiTi质粒载体TwoplasmidsdesignedasvectorsforDNAcloning,showinggeneralstructureandrestrictionsites.InsertionintopBR322isdetectedbyinactivationofonedrug-resistancegene(tetR),indicatedbythetetS(sensitive)phenotype.InsertionintopUC18isdetectedbyinactivationoftheb-galactosidasefunctionofZ,resultinginaninabilitytoconverttheartificialsubstrateX-Galintoabluedye.Cloninginphage.AnonessentialcentralregionofthephagechromosomeisdiscardedCloningbycosmids.Thecosmidiscutatandtheendsligatedtorandom15-kbaBglIIsitenexttothecossite.DonorgenomicDNAiscutbyusingSau3A,fragmentsofdonorDNA.Alinearmultimerwhichgivesstickyendscompatiblewith(concatenate)forms,whichisthenstuffedintoBglII.AtandemarrayofdonorandvectorDNAresultsfrommixing.Phageisphageheadsonemonomeratatimebyusingpackagedinvitrobycuttingatthecosaninvitropackagingsystem.site.Thecosmidwithinsertrecircularizesafteritisinthebacterialcell.真核生物载体穿梭载体（Shuttlevector）：能在两种以上宿主间穿梭。即能够在不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如，大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，另有一个多克隆位点区。由此载体既可在大肠杆菌细胞中复制，也可在酿酒酵母细胞中复制。可克服原核表达体系表达真核基因产品的缺陷：不止受限于cDNA；转录后加工，翻译后加工，形成正确的修饰和折叠；避免包涵体形成等Ti质粒vir基因产物切五个主要功能区域：下T-DNA区①.T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组；②.质粒转移区(PT)；③.冠瘿碱(opine)代谢区；④.复制原点；⑤.毒性区T-DNA区包含两套分别控制植物生长素和细胞分裂素的基因，诱发植物生长失控还有自身所需的冠缨碱合成的基因损伤植物组织分必物：酚类物质诱导vir基因表共整合载体T-DNA的整合机制双元载体系统农杆菌转化植物细胞5.1.4宿主（1970，Mandel和Higa：CaCl2处理的大肠杆菌能够吸收Lamda噬菌体；1972，Cohen：CaCl2处理的大肠杆菌能够吸收质粒）大肠杆菌E.coli；酵母S.cerevisiae若克隆的序列需要表达，则宿主也是表达体系1、原核表达体系大肠杆菌E.coli是当前采用最多的原核表达体系，因为：①有适宜的选择标志，②有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子，③有适当的翻译控制序列和翻译起始点等，④有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。但：①缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA，②缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰，③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理。枯草杆菌:…2、真核表达体系酵母、昆虫、哺乳类动物细胞、植物细胞。哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA，产物形成正确的高级结构。将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。3、体外表达体系（无细胞体系）：高效便捷、自动化，极具发展空间。反义技术的原理5.1.5体外DNA重组1972，P.Berg：用限制性内切酶EcoRⅠ在体外切割猴病毒SV40和λ噬菌体DNA，再用T4DNA连接酶把两种不同来源的DNA片段连接成一个片段，完成了世界上第一个DNA体外重组。1973，S.S.Cohen：不仅完成了体外DNA重组，而且还将这种重组DNA分子成功地转化到大肠杆菌中，成功地进行了第一次基因克隆。其重要意义在于说明像pSC101这样的质粒DNA可作为基因克隆的载体，将外源基因导入宿主细胞；同时也表明像非洲爪蟾这样的动物的基因，可被导入细菌在其中扩增和表达。由此建立了质粒－大肠杆菌这种第一个基因克隆系统，为利用体外重组DNA技术开展基因工程研究开辟了道路。1977，H.W.Boye：第一个基因工程产品（在原核细胞中表达人生长激素释放抑制素）体外表达体系前景诱人pSC101pR6-5抗卡那霉素抗四环素EcoRI抗卡那霉素基因DNA连接酶重组DNA分子1973，Cohen影印平板培养蓝-白颜色筛选注明：lacZ-宿主，IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，诱导lacZ基因表达，双抗生素筛选重组子X-gal：溴氯吲哚半乳糖苷，半乳糖苷酶代谢底物，由无色变为蓝色。实际应用上宿主菌转化及蓝白斑筛选细菌转化(transformation):宿主染色体捕获外源DNA而导致遗传性改变宿主菌感受态处理：低渗膨胀电击形成纳米级缝隙。N端146个氨基酸编码序列lacZ基因C端部分氨基酸编码序列E.coliDH5α菌株这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补其方法也叫α-现象筛选DNA克隆全 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 基本操作技术载体，限制酶目标序列5.2DNADNA样品信息已知：目标序列核酸探针信息未知：抗原性反应染色体步移构建重组DNA分子Ampr筛选出含目标序列或基因的重组体筛选出转化子Ampr+Tecr克隆DNA分析：限制酶单酶切α-互补克隆序列大小和组合酶切，部分酶切，末克隆序列方向端标记，电克隆序列限制酶谱泳，探筛选出重组子cDNA开放读码框ORF针，S1酶，克隆序列组构报道基因，凝克隆序列组构胶阻滞，自动测序DNA文库测序仪，体外DNA功能分析预测诱变，生物信息学等琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力5.21琼脂糖电泳可用于分离限制性片段(DNA片段)关键词：琼脂糖，纯度级别，浓度，分辨率，溴化乙锭溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。5.22核酸的分子杂交用于定性定量的检测Membrane-hybridizationassayfordetectingnucleic将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源acids.Thisassaycanbe区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的usedtodetectbothDNAand双链分子就被称为杂种核酸分子。RNA,andtheradiolabeledcomplementaryprobecanbeeitherDNAorRNA.Seetext经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用按其在fordetails凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。由于该方法是E.M.Southern首先设计出来的，所以又叫做SouthernblottingSouthernblottingisatechniquefordetectingspecificDNAfragmentsinacomplexmixture.NorthernblottingisusedfordetectingRNAfragments,insteadofDNAfragments.Thetechniqueiscalled"Northern"simplybecauseitissimilarto"Southern",notbecauseitisinventedbyapersonnamed"Northern".Westernblottingisusedtodetectaparticularproteininamixture.TheprobeusedisthereforenotDNAorRNA,butantibodies.Thetechniqueisalsocalled"immunoblotting".5.23限制性片段多态性及其应用SouthernBlottingRestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)resultingfromb-globingenemutation.Inthenormalcell,thesequencecorrespondingto5thto7thaminoacidsoftheb-globinpeptideisCCTGAGGAG,whichcanberecognizedbytherestrictionenzymeMstII.Inthesicklecell,onebaseismutatedfromAtoT,makingthesiteunrecognizablebyMstII.Thus,MstIIwillgenerate0.2kband1.2kbfragmentsinthenormalcell,butgenerate1.4kbfragmentinthesicklecell.Thesedifferentfragmentscanbedetectedbysouthernblotting.RFLP分为两类型：5.25PCR技术一、点多态性（pointpolymorphism）:由于限制性内切酶位点上发生了单个碱基突变而使这一限制性位点发生丢失或获得而产生的多态性。这类多态性实际上是双态的，即有（+）或无（-）。二、序列多态性：由于DNA较大的顺序变化所致。这一类多态性又可以分成两类：1、由于DNA顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。2、高变区（highlyvariableregion）内串联重复的拷贝数差异，即高变区的限制酶长度变化很大。这一类型的RFLP是由于高变区内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中的相对位置。VNTR常用于DNA指纹研究。聚合酶链式反应示意图（a）起始材料，双链DNA；（b）反应混合物加热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶DNA区段两端的退火位点上；（c）Taq聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链分开；（e）合成新的互补链DNA；（f）重复b；（g）重复c、、、实时定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)在PCR反应体系中加入可嵌入dsDNA的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的每个循环，根据荧光强度反映PCR的产量，也可以通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。荧光化合物分为非特异性的嵌入荧光染料及特异性荧光(引物)探针两大类型。前者是利用嵌入荧光染料检测,只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,后者具有产物专一性。非特异性嵌入荧光染料（Non-specificDNAbindingdyes）SYBR®GreenISYBR®GoldEthidiumBromide特异性荧光探针5.26ＤＮＡ文库TaqMan探针是一段5’端标记报告荧光基团(R),3’端标记淬灭荧光基团(Q)的特定DNA序列的总集。这些序列往往被克隆进载体以便纯化、贮存与分析。基寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。因文库包括基因组文库和cDNA文库。基因组文库：一个完整基因组DNA制成的基因文库（gDNA文库）。cDNA文库：cDNA构成的文库，即细胞中的mRNA群反转录成互补ＤＮＡ，并构建文库。是个动态的概念，因细胞中的ｍＲＮＡ是动态的。R的荧光波长与Q的激发光波长重叠代表性文库：能够覆盖所有原有序列的文库。荧光共振能量转移使R的提高文库的代表性：增加样品断裂的随机性；增加克隆数目。荧光受到Q的猝灭文库的大小：文库中序列的数量文库大小基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N：表示一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率，如99%f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值所有阳所有阳性菌落性菌落筛选文库筛选文库基因组文库构建3、载体的选择基本流程：常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。分离基因组DNA、选用何种载体可以参考如下几个因素：对基因组DNA作相关的处理、目标序列的大小将基因组DNA片段连接入载体、载体容量（kb）宿主导入细胞方式将重组载体转入宿主细胞。黏粒30-45大肠杆菌转导1、分离基因组DNA（gDNA）P170-100大肠杆菌转导优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要。在分离过程中保证DNA不PAC130-150大肠杆菌电转被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。BAC120-300大肠杆菌电转2、处理基因组DNAYAC250-400酵母转化不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，处理方法有筛选文库的难易程度构建黏粒基因组DNA文库，将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶(Klenow聚合酶)修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效载体拷贝数的考虑率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段。构建BAC基因组DNA文库，将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoRI、4、将基因组DNA片段连接入载体BamHI或者HindIII）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的5、将重组载体转入宿主细胞DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。6、文库克隆数的确定部分酶解可得到更长的片段Preparationofthegenomiclibraryusinglphagevectors.ItisbasicallythecloningofallDNAfragmentsrepresentingtheentiregenome.操作步骤5.3RNA基本操作技术1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。5.31总RNA提取（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。mRNA1~5%3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。tRNA15~20%5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。特征带条rRNA80~85%6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。TRIzol法提取组织和细胞总RNA总RNA定量RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。OD值为1相当于大约40μg/mlTrizol试剂：苯酚，异硫氰酸胍，RNase抑制剂等组成的单链RNA。如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。5.34cDNA文库5.32mRNA纯化cDNA文库构建流程：mRNA分离、纯化、分级分离cDNA合成（第一、二链）cDNA末端处理双链cDNA与载体连接，构建重组分子1、mRNA的分离寡聚(dT)纤维素柱层析5.33cDNA合成寡聚(dT)磁珠吸附洗涤检测样品的完整性：翻译或凝胶电泳样品分级分离：构建特定cDNA文库时，只感兴趣一定长度的mＲＮＡ2、cDNA的合成3、cDNA末端处理cDNA第二链合成的方法有四种：自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。第一、二链的合成4、与载体连接cDNA噬菌体文库1、高质量mRNA的制备2、反转录生成cDNA3、与噬菌体载体相连接5.35基因文库的筛选核酸杂交/PCR/免疫Ref.toP176,F5-174、噬菌粒的包装5.4SNP技术及其应用单核苷酸多态性(singlehaplotype(单倍型)nucleotidepolymorphisms,SNP)一些染色体特定区域内的一组相关联的SNP等位位点.即染色体上共同遗传的SNP组合Asinglenucleotidepolymorphism(SNP,pronouncedsnip),isaDNAsequencevariation(Greekhaploos=simple)isacombinationofallelesatmultiplelinkedlocithatareoccurringwhenasinglenucleotide-A,T,C,orGtransmittedtogether.Haplotypemayrefertoasfewastwolociortoanentirechromosome-inthegenome(orothersharedsequence)dependingonthenumberofrecombinationeventsthathaveoccurredbetweenagivensetdiffersbetweenmembersofaspecies(orofloci.Thetermhaplotypeisaportmanteauof"haploidgenotype.“betweenpairedchromosomesinanindividual).Forexample,twosequencedDNAfragmentsInasecondmeaning,haplotypeisasetofsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)onafromdifferentindividuals,AAGCCTAtosinglechromatidthatarestatisticallyassociated.Itisthoughtthattheseassociations,andAAGCTTA,containadifferenceinasingletheidentificationofafewallelesofahaplotypeblock,canunambiguouslyidentifyallothernucleotide.Inthiscasewesaythattherearetwopolymorphicsitesinitsregion.Suchinformationisveryvaluableforinvestigatingthealleles:CandT.AlmostallcommonSNPshavegeneticsbehindcommondiseases,andiscollectedbytheInternationalHapMapProject.onlytwoalleles.ForavariationtobeconsideredaSNP,itmustoccurinatleast1%ofthepopulation.2002年10月启动国际单倍型图谱 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (HaplotypeMapProject,HapMap)单倍型是DNA的基本结构单位，大约由5000~20000对碱基组成。个体间的cSNP(同义/错义),基因组序列大约99.9%具有一致性，0.1%差异决定了比如人类的遗传多态性。pSNP,HapMap计划正是研究这0.1%差异的排列顺序.rSNP/iSNP常见单倍型:HYPA,LXPA,LYQA,LYPB,罕见单倍型:HYPD,LYQC,A,H,P,X为野生型限制性内微卫星DNA重单核苷酸突变切酶位点复序列SSRSNP/300--1000SNP的检测方法RFLP一、结合常规凝胶电泳：gDNA限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸连接分析(OLA)、1996年被美国MIT的E．Lander提出的被称为“第三代DNA遗传标记“等位基因特异聚合酶链反应分析(AS2PCR)、---单核苷酸多态性标记：单链构象多态性分析(SSCP)、--SNP技术/SNP基因分型技术/SNP检测变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)目前常用的检测方法和原理二、高通量自动化。常用SNP技术是一种基于构象的突变扫描（conformation-basedmutation特异位点杂交(ASH)、scanning）方法：:对于一个经PCR扩增后具有固定长度的DNA片断，其分子构特异位点引物延伸(ASPE)、象是由碱基序列所决定的，因此单个碱基的改变能够引起DNA分子单链或等位基单碱基延伸(SBCE)、因间形成的错配异源双链在变性条件下存在微小的构象差别，这些不同的构象体特异位点切割(ASC)、在电泳或高效液相检测中因移动性的差异而得以区分。特异位点连接(ASL)、DNA芯片法技术不断改进：非序列特异性的SNP检测序列特异性SNP检测简约代表物策略目前,测序是最可靠的……5.5基因克隆技术简介SNP技术应用5.5（clone）构建遗传图普克隆(名词)：克隆就是指同一副本或拷贝的集合。新型的DNA指纹克隆化(动词)：获取同一拷贝的过程称为克隆化。群体遗传学分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。疾病相关基因克隆DNA克隆多基因效应形状的相关基因研究DNA克隆就是在体外利用工具酶，将基因组目标DNA序列与载体DNA制作成具有自主复制能力的重组DNA分子——复制子，再转化或转染到宿主细胞、个体化医疗筛选出含有目标基因转化子细胞，再进行扩增、获得大量同一DNA序列。药物开发克隆的目的是大量获取目标序列……大规模DNA克隆技术？5.51cDNA末端快速扩增技术RACE(rapidamplificationofcDNAends)全长克隆策略Frohman,1988:通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’cDNA和3’端，包括单边PCR和锚定PCR,这就是最早的RACE技术。、（传统的）标记探针筛选文库1Frohman,1995;Schaefer,1995;Chen,1998;Bespalova,1998:Matz1999。对传2、cDNA末端快速扩增（RACE）统RACE技术作了引物设计及RT-PCR技术的改进:3、EST（electrodatabasescreening）查询法1利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3‘端引入两个简并的核苷酸【5’-Oligo(dT)16_30MN-3‘,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，如芯片延伸/电子步查；从头芯片克隆。从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;2在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);都是通过特征序列查询序列数据库，将重叠群的延伸3采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响;4是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。RACE是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5‘和3’末端的有效方法，具有简单、快速、廉价，快捷获得全长基因序列的优点。用于从已知cDNA片段扩增全长基因。已知序列如EST等，至少28ntRACE是基于PCR由已知的一段cDNA，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’-/5’端。5.52应用cDNA差示分析法克隆基因(representationaldifferenceanalysis,RDA,直译:代表性差异分析法）以往基因表达差异的研究方法方法:蛋白质双向电泳、cDNA减法杂交和mRNA差示技术等Drs.NikolaiLisitsyn,NatalyaLisitsyn,andMichaelWiglerofColdSpringHarborinScienceinFebruary1993(Vol.259,p.946).Itisaprocedurethatanalyzesthedifferencebetweentwocomplexsetsofgenomes.BycomparingDNAfromdiseasedandnormalcellsfromaperson.Hubank&Schatz,1994建立了cDNArepesentationaldifferenceanalysis(cDNARDA)方法.其特点是通过差减杂交和PCR巧妙结合，对靶序列进行差减杂交富集和动力学富集，经3轮杂交后靶序列得到百万倍的富集。RDAisatechniqueusedinbiologicalresearchtofinddifferencesintwogenomicorcDNAsamples.GenomesorcDNAsequencesfromtwosamples(i.e.cancersampleandanormalsample)arePCRamplifiedanddifferencesanalyzedusingsubtractiveDNAhybridization.Thistechnologyhasbeenfurtherenhancedthroughthedevelopmentofrepresentationoligonucleotidemicroarrayanalysis(ROMA),whichusesarraytechnologytoperformsuchanalyses.Procedure1.1AmplifymRNArepresentations(optional)1.2DenaturationandSubtractiveHybridization基本原理是：1.3PCRamplificationtoenrich"Tester"cDNAboundto"Tester"用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基因掩盖起来而只暴cDNA,露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。1.4RepeatsubtractivehybridizationandPCRamplificationtofurtherenrich"Tester"cDNAboundto"Tester"cDNA操作程序:(1)用同一限制性内切酶(一般用BamHI,BglII或HindIII)同时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基因组DNA的量；(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头,其序列与酶切产生的粘性末端的序列相对应；(3)将2个基因组的DNA混合后,高温变性,低温退火。由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA量,那么与掩盖基因组DNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因的影响；(4)用TaqDNA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应的引物,经过30个左右的PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。4nt限制酶三对引物：256nt代表群PR24R12R24J12J24N12N24不连接头去除PR24DP1：R24，J24接J12J24去除ssDNA三种组合DP2：J24，N24产物DP3：R24，--末端填平PJ245.53基因大规模克隆技术GatewayGateway克隆技术是一个高效的大规模克隆系统，由hivitrogen公司开发。利用ʎ噬菌体的位点特异性重组(ʎ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互相转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时还保持正确的ORF和方向。Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统。简化了基因克隆和亚克隆的步骤，克隆效率却高于95%。并且基因在目的表达载体之间快TransferringaDNASegment(Gene)betweenanEntryCloneandMultipleDestinationVectors.DNAsegmentscan速简便的穿梭时，能保证正确的方向和betransferredfromanEntryCloneintoanynumberofrecipient阅读框。vectors(DestinationVectors)togenerateExpressionClones,orfromExpressionClonesbackintoEntryClones.λint是一种酪氨酸重组酶。所谓酪氨酸重组酶类（tyrosinerecombinase）是指：该酶的活性部位包含酪氨酸，这个酪氨酸（带OH-）破坏DNA一条单链上的磷酸二酯键，产生一个缺口，同时结合上去。λint作用时先切断、连接两个双链DNA分子的各一条链，形成Holliday连接结构，再切断、连接另外的链，完成重组。酪氨酸重组酶类（tyrosinerecombinase）的活性部位包含酪氨酸（带OH-）破坏DNA一条单链上的磷酸二酯键，产生一个缺口，同时结合上去。λint作用时先λ噬菌体侵入后，细菌不裂解,附在E.coli切断、连接两个双链染色体上的galDNA和分子的各一条链，形成bio位点间的attλ座位上通过交换整合到细菌染色体，并能阻止其它λ噬菌体的超数感染。Holliday连接结构，再切断、连接另外的链，完成重组attB=25bpattR=125bp(100+B)attL=100bp(75+B)Gateway克隆技术主要由三大反应组成:attP=200bp(----+L)TOPO反应：将目的基因的PCR产物连入Entry载体LR反应：将目的基因从Entry载体重组入Destination载体,取代cooB形成表达克隆.BP反应：将目的基因从Destination载体或PCR产物重组入Entry载体或者attBxattPattLxattR(where“x”signifiesrecombination).GATEWAYCloningReactions:TheLRGATEWAYCloningReaction.AnEntryReactions:TheBPReaction.Clone,containingageneAgeneinanExpressionflankedbyrecombinationClonecanbetransferredintosites,recombineswithaanEntryVectorbytheBPDestinationVectortoReaction.OnlyplasmidsyieldanExpressionwithouttheccdBgenethatareCloneandaby-productalsokanamycinresistant(Knr)plasmid.Theresultisthatwillyieldcolonies.agenesequenceintheEntryCloneistransferredintoanExpressionVector,donatedbytheDestinationVector.Theby-productplasmidcontainstheccdBgene,andhencegivesrisetonocolonieswhenusingstandardstrainsofE.coli.5.54基因位图克隆法(Map–basedcloning)图位克隆(map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning)，1986年首先由剑桥大学的AlanCoulson提出。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息，而是通过分析突变位点与己知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。5.6蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组学技术平台1995,澳大利亚科学家首次发表蛋白质组(Proteome).2001年的Science杂志已把蛋白质组学(Proteomic)列为六大研究热结构蛋白质组学功能蛋白质组学点之一，其“热度”仅次于干细胞研究名列第二.样品制备蛋白质信息蛋白质鉴定细胞作图细胞/膜/复合体蛋白质组学（Proteomics)是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，是在90年代初期，由MarcWikins等首先提出的新名词。大小排组层析蛋白质互作离子交换层析质谱信息学三维结构氨基酸序列分析蛋白质组学的现实意义高效液相层析Edman降解（X-ray，1、蛋白质是生物特征的直接体现者.疏水层析NMR）2、基因组学的补充。蛋白质组有动态性，1gene≠1Protein.单双向凝胶电泳细胞定位流体/毛细管电泳译后修饰蛋白质组学研究的关键技术包括质谱分析，X-射线晶体衍射，核磁亲和捕获预测/模拟共振和凝胶电泳。5.61双向电泳技术5.62蛋白质印迹法5.63蛋白质的质谱分析技术(MassSpectrometry,MS)Westernblotting/Immunoblotting质谱是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质量比分离进行检测分析的仪器。质谱技术种类2基质辅助激光解吸附质谱技术(MatrixAssistedLaserDesorption／Ionization，1电喷雾质谱技术(ElectrosprayionizationMassSpectrometry，ESI—MS)MALDI)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶基本原理是将分析物分散在基质分剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电子中并形成晶体，当用激光照射晶体时荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降由于基质分子经辐射所吸收的能量，导低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用。致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，检测器可检测分的质量数是没有上限的，因此质谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研究。3快原子轰击质谱技术(FastAtomBomebardmentMassSpectrometry，FABMS)一种软电离技术，是用快速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术