毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化
3、毕氏酵母电转化法
（2）线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化
取新鲜制备的（或－70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻；
1）将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5－20μg线性化质粒（5～10μl），轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm 型的电穿孔转化杯中；
2) 转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。
3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10mS；一次电击。
4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
5) 取30℃烘至
表
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面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板
3.4 毕赤酵母电转化方法
3.4.1 菌体的准备：
1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；
2. 取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；
3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
4. 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
5. 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6. 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；
7. 备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。
3.4.2 电击转化：
8. 将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；
9. 将电转化杯冰浴5min；
10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等
参数
转速和进给参数表a氧化沟运行参数高温蒸汽处理医疗废物pid参数自整定算法口腔医院集中消毒供应
，按优化的参数，进行电击；
11. 电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；
12. 将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600μl涂布一块平板；
13. 将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
推荐：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec
电转化用感受态：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。如果不需要可接步骤6
4）加入10ml， pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min
5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min
6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：
第一次沉淀：250ml冰冷的水
第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇
第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇
最终的OD600应为约200
即可进行下步电转化
浙公网安备 33021202002483