FAM-SiRNA的使用方法

广州市锐博生物科技有限公司广州市锐博生物科技有限公司广州市锐博生物科技有限公司广州市锐博生物科技有限公司 GUANGZHOU RIBOBIO CO., LTD http://www.siRNA.cn 中国广州东圃·广州科学城·国际企业孵化器 D 区 906 室 , 邮编：510663 Guangzhou International Business Incubator, D906, Guangzhou Science Park, Guangzhou 510663, China. 电话/Tel: (+86)20-32290221, 32290075, 传真/Fax: (+86)20-32290137; Email: order@ribobio.com, info@ribobio.com, design@ribobio.com 网站/Web site: http://www.sirna.cn, http://www.ribobio.com 荧光标记的荧光标记的荧光标记的荧光标记的 siRNA（（（（FAM-siRNA））））使用说明使用说明使用说明使用说明 （（（（一一一一））））荧光标记的荧光标记的荧光标记的荧光标记的 siRNA 转染效率的高低可以通过荧光标记的 siRNA（FAM-siRNA）实现。 FAM-siRNA 转染细胞后，可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测，确定是否有效转 染和优化转染条件。FAM-siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中 导入了 siRNA 的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。 （（（（二二二二））））使用荧光标记的使用荧光标记的使用荧光标记的使用荧光标记的 siRNA（（（（FAM-siRNA））））检测转染效率检测转染效率检测转染效率检测转染效率 1、、、、保存保存保存保存：-20℃℃℃℃，避光避光避光避光．．保存，冻干粉或液体。液体（贮存浓度为 20μμμμM）避免反复冻融（为保证 siRNA 的 完整性，冻融最多不超过不超过不超过不超过 5 次次次次）。 2222、、、、转染转染转染转染 2.12.12.12.1 使用使用使用使用 lipofectamin2000lipofectamin2000lipofectamin2000lipofectamin2000 转染的步骤转染的步骤转染的步骤转染的步骤（（（（以贴壁细胞为例以贴壁细胞为例以贴壁细胞为例以贴壁细胞为例，，，，仅供参考仅供参考仅供参考仅供参考）））） FAM-siRNA 的转染过程和普通 siRNA 是一样的，注意注意注意注意整个实验过程要尽量避光尽量避光尽量避光尽量避光．．．．。 (1)(1)(1)(1) 转染过程中，细胞密度是一个非常重要的指标和转染成败的最关键因素。转染前一天，分细胞，每孔中 加入无无无无抗生素抗生素抗生素抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到 30～50％；（经验值：以 293T 细胞为例，使用 DMEM 培养基，添加 10％FBS，如用 24 孔板转染，则前一天接种细胞密度为 5～10万个/孔）。 (2)(2)(2)(2) 按如下步骤准备FAM-siRNA-脂质体混和液（以24孔板的操作为例，其他孔板各种的试剂用量，请参照 “siRNA使用说明使用说明使用说明使用说明”或“Lipofectamine2000 manual”）： a. 取 1μl/孔 Lipofectamine2000（（（（使用前轻轻摇匀），），），），用 50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释。轻 轻混和后在室温孵育室温孵育室温孵育室温孵育 5 min；；；； b. 取适量 FAM-siRNA（根据不同转染浓度取量，50nM 为 1.25μl/孔），用 50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释，轻轻混和均匀; c. 稀释的 Lipofectamine2000（a）经过 5min 的孵育后，与稀释 FAM-siRNA（b）轻轻混和，室温静置 20min， 以形成 FAM-siRNA-转染试剂混和物，如果溶液出现浑浊，属于正常现象，不会影响转染效果。 注意注意注意注意：：：：稀释的 Lipofectamine2000（a）尽量尽量尽量尽量在 30min 之内，和稀释的 FAM-siRNA 混和，如果放置时间过长， 可能导致转染试剂活性的降低; (3)(3)(3)(3) 将 FAM-siRNA-转染试剂混和液（c）加入含有细胞及培养液的孔中，轻轻摇晃孔板，使混和； (4)(4)(4)(4) 在 37 ℃的 CO2 培养箱中培养 6 小时小时小时小时就可以检测; (5)(5)(5)(5) 转染效率检测：流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等（见后面）。 广州市锐博生物科技有限公司广州市锐博生物科技有限公司广州市锐博生物科技有限公司广州市锐博生物科技有限公司 GUANGZHOU RIBOBIO CO., LTD http://www.siRNA.cn 中国广州东圃·广州科学城·国际企业孵化器 D 区 906 室 , 邮编：510663 Guangzhou International Business Incubator, D906, Guangzhou Science Park, Guangzhou 510663, China. 电话/Tel: (+86)20-32290221, 32290075, 传真/Fax: (+86)20-32290137; Email: order@ribobio.com, info@ribobio.com, design@ribobio.com 网站/Web site: http://www.sirna.cn, http://www.ribobio.com 2.2 2.2 2.2 2.2 转染操作注意事项转染操作注意事项转染操作注意事项转染操作注意事项：：：： （（（（1111））））FAM 荧光很容易猝灭猝灭猝灭猝灭．．（（（（在日光灯下几秒内在日光灯下几秒内在日光灯下几秒内在日光灯下几秒内））））．．．．．．．．．．，避免 FAM-siRNA 在可见光下暴露，建议转染时建议转染时建议转染时建议转染时．．．．．室内和室内和室内和室内和．．．超净超净超净超净．． 台内不要开灯台内不要开灯台内不要开灯台内不要开灯．．．．．．； （（（（2222））））保持 FAM-siRNA 管外有锡纸包裹锡纸包裹锡纸包裹锡纸包裹，在静置 lipo-siRNA 过程中也尽量避光尽量避光尽量避光尽量避光．．．．，稀释用的管可以事先用锡纸 包裹好，混合液静置过程也最好在锡纸包裹的小管中； （（（（3333））））转染操作尽量快尽量快尽量快尽量快，操作时间尽量短尽量短尽量短尽量短，操作完毕请尽快将培养板放到培养箱。建议建议建议建议：：：：如果需要的话，培养 板可以裹锡纸培养裹锡纸培养裹锡纸培养裹锡纸培养，但注意避免污染注意避免污染注意避免污染注意避免污染，如果您用的细胞需要二氧化碳的话，还要注意透气，免得影响细胞状 态！ （（（（4444））））一般来说，使用 Lipofectamine 2000 作为转染试剂，4～～～～6 小时小时小时小时就可以保证 siRNA 转染进入细胞。因此， 转染效率的检测可以在转染后 6 小时小时小时小时（（（（转染过程完成））））进行。 3、、、、观察与检测观察与检测观察与检测观察与检测 3.1 检测方法检测方法检测方法检测方法：：：：荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪 3.2 荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜观察注意事项观察注意事项观察注意事项观察注意事项（（（（流流流流式细胞仪或激光共聚焦显微镜式细胞仪或激光共聚焦显微镜式细胞仪或激光共聚焦显微镜式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测检测检测检测请参照仪器 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 请参照仪器说明书请参照仪器说明书请参照仪器说明书））））：：：： （（（（1））））FAM 是一种绿色荧光绿色荧光绿色荧光绿色荧光基团，由蓝光蓝光蓝光蓝光激发，激发波长 480nm，，，，发射波长 520nm。 （（（（2））））使用 Lipofectamine 2000 转染后 6 小时小时小时小时就可以检测，检测前细胞处理等操作都必须避光检测前细胞处理等操作都必须避光检测前细胞处理等操作都必须避光检测前细胞处理等操作都必须避光．．．．．．．．．．．．．．．！！！！对于检测的时 间要求相对不是特别严格，成功转染的细胞如果没有受到强光刺激的话，荧光一般不会消失，我们建议尽量 在转染后 24 小时内小时内小时内小时内完成检测。 （（（（3））））到了检测的时间，先用 PBS 或您惯用的细胞洗涤液洗细胞洗细胞洗细胞洗细胞 1～～～～2 次次次次，把没有转染进去而残留在培养基或 附在表面的 FAM-siRNA 洗掉，如果没有特殊需要的话，可以吸弃细胞洗涤液后，直接于荧光显微镜下观察， 这样可以减少背景干扰减少背景干扰减少背景干扰减少背景干扰。注意注意注意注意洗涤时小心，不要使细胞也洗脱落了。房内房内房内房内．．和超净台内和超净台内和超净台内和超净台内．．．．．最好不要开灯最好不要开灯最好不要开灯最好不要开灯．．．．．．！！！！ （（（（4））））确保熟悉荧光显微镜操作。建议建议建议建议．．检测时检测时检测时检测时，，，，．．．．可以先使光路先对准没有转染可以先使光路先对准没有转染可以先使光路先对准没有转染可以先使光路先对准没有转染．．．．．．．．．．．．．FAM．．．-．siRNA．．．．．的孔的孔的孔的孔，，，，调好焦距调好焦距调好焦距调好焦距．．．．．．．，，，，． 打开激发光打开激发光打开激发光打开激发光，，，，一切准备就绪后再进行观察一切准备就绪后再进行观察一切准备就绪后再进行观察一切准备就绪后再进行观察．．．．．．．．．．．．．．．．．．（（（（一般情况下可以马上看到荧光一般情况下可以马上看到荧光一般情况下可以马上看到荧光一般情况下可以马上看到荧光））））．．．．．．．．．．．．．．．。 （（（（5））））观察时间不宜过长观察时间不宜过长观察时间不宜过长观察时间不宜过长．．．．．．．．，，，，．尽量避免荧光被猝灭尽量避免荧光被猝灭尽量避免荧光被猝灭尽量避免荧光被猝灭．．．．．．．．．，光路对准转染孔，马上观察和拍照马上观察和拍照马上观察和拍照马上观察和拍照．．．．．．．。拍完荧光照片后，最好最好最好最好 在在在在同一视野同一视野同一视野同一视野中中中中拍下明场的细胞照片细胞照片细胞照片细胞照片。 （（（（6））））只有成功转染的细胞才能看到 FAM 绿色荧光，与绿色荧光蛋白 GFP 的荧光不太一样，FAM 的荧光比的荧光比的荧光比的荧光比 较弱较弱较弱较弱，散在分布在细胞质中。 （（（（7））））初次操作，可能未必能成功，所以请妥善保存好妥善保存好妥善保存好妥善保存好未用完 FAM-siRNA，避光避光避光避光．．！！熟悉操作后，重做一次， 但注意注意注意注意如果重复次数太多，时间太久，荧光难免减弱！ （（（（8））））FAM 荧光不稳定，很容易猝灭，这是这种荧光基团本身的性质，每一步实验请务必小心操作，耐心实 验，每一个细节上的失误都有可能导致实验失败。 （（（（9））））检测的效果还检测条件有关，包括检测时间、仪器的灵敏度等，不同操作者可能得到不一样的结果。 （（（（10））））由于荧光容易猝灭，应用计数的方法计算转染效率效果不好，最好用流式细胞仪检测最好用流式细胞仪检测最好用流式细胞仪检测最好用流式细胞仪检测．．．．．．．．．．。 （（（（11））））如果您对我们 FAM-siRNA 质量有任何质疑的话，您可以从中吸取少量（2～5μl）FAM-siRNA，加在 载玻片上，盖上盖玻片，直接于荧光显微镜下观察。注意注意注意注意保证 FAM-siRNA 的保存和使用方法无误，另外，所 有操作都必须在避光条件避光条件避光条件避光条件．．．．下进行。