改良精子染色质扩散..

NJA　中华男科学杂志 　　　　　　　　　　N ationa l Journa l of A ndrology　　　　　Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi　　　　　2009, 15 (12) : 1116 - 1119 http: / /www. androl. cn Original Article ·论 　著 · 改良精子染色质扩散实验对 精子 DNA完整性检测的初步探讨 蔡　靖 , 梁佩燕 , 尹　彪 , 梁锦明 , 林　奇 , 曾　勇 (深圳中山泌尿外科医院生殖与遗传研究所 , 广东 深圳 518001) 摘要 : 　目的 : 通过对传统精子染色质扩散实验 (SCD)方法进行改良 ,探索一种更简单、快速、准确的精子 DNA完整性检 测方法。同时对改良 SCD法检测的正常参考值范围进行初步探讨。　方法 : 对传统 SCD法在实验过程、试剂配制及器具 使用上进行了改良优化 ,同时对改良前后 SCD法进行了比较。此外 ,利用改良 SCD法对 293例正常生育男性精液进行精 子 DNA完整性检测。　结果 : 建立了改良 SCD检测法 ,经统计分析改良前后测定结果无统计学差异 ,同时初步对改良 SCD法检测的正常精子 DNA百分比参考值范围进行了确定 ,其值为精子 DNA异常发生率 <32. 58%。　结论 : 改良 SCD 方法能更快速地对精子 DNA的完整性进行检测 ,同时 ,由于降低了试剂成本 ,该法更容易在实际工作中得到普及。 关键词 : 精子染色质扩散实验 ; 精子 DNA完整性 ; 参考值范围 中图分类号 : R321. 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 100923591 (2009) 12211162043 D eterm ina tion of Sperm D NA In tegr ity by Im proved Sperm Chroma tin Structure A ssay Test CA I J ing, L IANG Pei2yan, YIN B iao, L IANG J in2m ing, L IN Q i, ZENG Yong Institu te of R eproduction and Genetics, S henzhen Zhongshan U rolog ica l Hospita l, Shenzhen, Guangdong 518000, Ch ina Abstract:　O bjec tive: To search for a simp le, quick and accurate method for the sperm DNA integrity test by modifying the conven2 tional sperm chromatin dispersion ( SCD) test, and to investigate the reference value range of normal sperm DNA integrity by the im2 p roved SCD assay. 　M ethods: W e modified the conventional SCD test in its p rocedures, reagents p reparing and utensils to be used, compared the imp roved method with the conventional one, and detected 293 normal semen samp les for sperm DNA integrity by the modified SCD test. 　Resu lts: An imp roved SCD test was established, and no statistical differences were found between the results of the modified and conventional methods. The reference value range was determ ined by the imp roved SCD assay for normal sperm DNA integrity, which was < 32. 58% for abnormal sperm DNA integrity. 　Conclusion: The imp roved SCD test could detect sperm DNA integrity more quickly, and it reduced the cost in reagents. 　N a tl J A ndro l, 2009, 15 (12) : 1116 - 1119 Key words: sperm chromatin dispersion test; sperm DNA integrity; reference value range Correspondence to: YIN B iao, e2mail: yinbiao2004@ hotmail. com Received: February 5, 2009; accep ted: August 21, 2009 　　对精子 DNA完整性进行检测是评估男性生育 能力的重要指标之一 ,被认为优于传统精液常规检 测指标 [ 1, 2 ]。现在 ,可用多种方法对精子 DNA完整 性进行检测。如单细胞凝胶电泳实验 ( single cell gel elect rophoresis assay, SCGE) [ 3 ] ,又称彗星实验 ; 精子染色质结构分析法 ( sperm chromatin structure assay, SCSA ) [ 4 ] 以及精子染色质扩散实验 [ 3, 4 ] ( sperm chromatin dispersion test, SCD 实验 ) 等。 SCD实验由于其快速、简单、准确的特点较适合用于 精子 DNA的常规检测。为了使传统 SCD法更加适 ·6111· 3收稿日期 : 2009202205; 接受日期 : 2009208221 作者简介 : 蔡　靖 (19762) ,男 ,广东普宁市人 ,主管技师 ,大学本科 ,从事生殖医学专业。E2mail: caijing0228@ sina. com 通讯作者 : 尹　彪 , E2mail: yinbiao2004@hotmail. com 用 ,笔者在试剂配制、实验过程优化及器具使用进行 了精心改良 ,现报告如下。 1　材料与方法 1. 1　临床资料 　用于改良前后两种方法比较的 100份精液标本来自本院生殖中心 2008年 3～5月 的门诊患者 ,精液标本的选择具有随机性。用于改 良 SCD法参考值范围确定的 293份精液来自本院 2008年 6 ～11 月的正常生育力男性 (精液符合 WHO正常范围标准且具有自然受孕史 )。所有用 于实验的标本均征得生育供精者同意后方进行实 验。取精方式均采用手淫法 , 393例实验对象年龄 25～35岁 ,平均年龄 28. 6岁。 1. 2　试剂 　本研究所用的所有溶剂和药品均购自 BB I公司 (B IO BASIC INC,加拿大 )。 1. 3　实验方法 1. 3. 1　改良 SCD法实验方法 　溶液配置 :溶液 Ⅰ: 0. 08 mol/L HCL;溶液 Ⅱ: EDTA ( 40 mmol/L ) ,十二 烷基硫酸钠 ( SDS, 0. 8% ) ,二硫苏糖醇 (DTT, 0. 1 mol/L) ,三羟甲基氨基甲烷 ( TR IS, 0. 4 mol/L )。样 本准备 :将新鲜或处理后的精液标本以 1 ×PBS稀 释到密度为 10 ×106 /m l; 50μl 1%的低熔点琼脂糖 于 65～90 ℃水浴箱融化并于 37 ℃恒温放置 3 m in; 将稀释后的精液标本以 1∶2的比例混合到 1%低熔 点琼脂糖中 ,充分混匀 ;取 20μl滴于预先用 1%琼 脂糖包被的玻片上 ,迅速以 22 mm ×22 mm盖玻片 压片 ,并置于 4 ℃冰箱 3 m in;移去盖玻片 ,保留玻片 样本待用。样本处理 :将上述玻片样本垂直插入装 有溶液 I的立式染缸 ,计时 6～8 m in;取出并置于装 有溶液 II的立式染缸 ,计时 15 m in;置于装有去离 子水的立式染缸 5 m in;然后分别置于装有 75%、 90%及无水乙醇的立式染缸分别 2 m in,取出自然晾 干待用。染色及显微观察 :处理后的样本可用不同 DNA染料进行直接染色 ,可在明场或荧光显微镜下 进行观察。通常明场观察用 D iff2Quik染液等 ,染色 方法参照产品说明书 ;荧光显微镜观察用 DAP I、EB 及其类似物或其他荧光染料等 ,以移液器吸取 15μl 染液滴于处理后标本玻片 ,盖玻片压片暗处染色 5 m in即可进行观察。判断标准 :精子经改良 SCD法 检测后经荧光染料或 D iff2Quik等染料染色 ,可根据 染色后精子头部核周围出现的核晕大小判断精子核 染色质断裂情况。染色质断裂较多的精子 ,染色后 仅能观察到深染的精子头部核 ,或仅有少量的核晕 存在 (一般晕宽度 <核短径 1 /3) ;而染色质较完整 的精子不仅能观察到深染的核 ,而且具有明显的核 晕 (一般晕宽度不小于核短径的 1 /3)。 1. 3. 2　改良前后两种方法比较 　100份精液标本 以传统 SCD法与改良 SCD法进行平行实验 ,经染色 后每份标本在显微镜下观察计数 1 000条精子 ,根 据上述判断标准并计算异常精子百分率 ,比较改良 前后精子异常百分率之间的统计学差异。 1. 3. 3　正常参考值范围探讨 　对 293份正常生育 男性的精液以改良后的 SCD法进行 DNA完整性检 测 ,每份样本计数 1 000条以上精子并计算异常精 子百分率。根据统计学计算参考值范围。 1. 4　统计学分析 　采用专业统计分析软件 SPSS 16. 0对改良前后方法差异性进行了 t检验分析 ;对 用于参考值范围分析的 293例结果进行正态分布检 验 ,按照参考值范围制定标准行 95%可信区间分 析。P < 0. 05为差异有显著性。 2　结果 2. 1　荧光染料及 D iff2Quik染色后显微镜下观察结 果 　将上述实验方法制备的玻片样本用荧光染料 EB或其类似物染色后 (可加入抗荧光猝灭剂延长 荧光猝灭时间 ) ,可在 505～525 nm的绿色荧光下进 行观察 ,如图 1,箭头标注了相应的正常及异常精 子。同时 ,同样方法制备的玻片可用 D iff2Quik染色 后在明场显微镜下进行观察 ,如图 2。两种染色方 法比较 ,荧光染色由于其信号强 ,分辨率好等特点更 方便对结果进行判断。 2. 2　改良前后两种方法比较结果 　对 100份精液 样本进行改良前后 SCD法测定 ,并计算异常精子百 分率 (表 1) ,经统计学 t检验分析 ,无统计学差异 ( P > 0. 05)。但对实验后精子的显微镜观察发现 ,改 良后 SCD法保持了更加完整的核完整性 ,这对于结 果的判断是有利的。 2. 3　参考值范围确定 　经统计学分析 , 293份检测 结果符合正态分布。 95%可信区间范围为 x ± 1. 96 s,由此得出精子 DNA完整性异常精子百分率 为 16. 6% ±1. 96 ×8. 15% ,即 0. 63% ～32. 58% ,笔 者初步将异常精子百分率小于 32. 58%作为判断精 子 DNA完整性正常的标准。 3　讨论 SCD实验由 Fernandez等 [ 5, 6 ]首先提出 ,是一种 简单 ,快速 ,准确且廉价的检测方法。精子包含鱼精 蛋白 ,可作为精子主要的核蛋白与其他细胞进行标 志性区分 [ 7 ]。运用核蛋白溶解液可以在精子细胞 和其他细胞之间造成不同核蛋白的扩散速度。鱼精 ·7111·第 12期 　　蔡 　靖 等 　改良精子染色质扩散实验对精子 DNA完整性检测的初步探讨 表 1　改良前后 SCD检测方法之间结果的比较 Table 1. Comparison of the results of traditional and imp roved SCD tests n Sperm with normal DNA integrity( % ) Mean deviation Standard deviation t value P Traditional SCD 100 75. 6 ±13. 0 0. 038 4 0. 001 9 2. 013 > 0. 05 Imp roved SCD 100 76. 1 ±12. 4 蛋白的扩散速度比组蛋白快 ,可用 DNA靶向性染料 染色分辨精子细胞和其他细胞。精子核蛋白扩散还 可用来分析包含较多染色质断裂的精子细胞。没有 大量 DNA断裂的正常精子细胞可形成由 DNA延伸 环组成的核晕 ,而有较多 DNA断裂的异常精子细胞 没有核晕 ,或者核晕很小 [ 8, 9 ] 。SCD法正是运用核 蛋白携带 DNA扩散的原理 ,对精子 DNA断裂程度 进行检测。 Fernandez等 [ 5 ]应用 DNA 断裂检测 2荧光原位 杂交法 (DBD2F ISH 法 )与 SCD法进行比较 ,证明两 种方法的检测结果具有高度一致性。SCSA是一种 非常有效的方法 ,被认为是分析精子 DNA断裂的金 方法 [ 10213 ]。 Fernandez等 [ 6 ]还将 SCD 方法与 SCSA 方法进行了对比 ,结果两种方法之间没有统计学差 异。本研究通过改良前后 SCD法对精子 DNA完整 性的检测比较 ,结果证明也没有统计学差异。 ·8111· 中华男科学杂志 2009年 12月 　第 15卷 笔者在实验过程中发现 ,溶解精子核蛋白 2鱼精 蛋白的主要物质是 DTT。在合适的条件下 DTT能 将细胞核蛋白从细胞中溶解出来。本研究发现 ,在 特定条件下 , DTT浓度低至 0. 1 mol/L就能发挥较 好的去核蛋白功能。笔者还发现 , DTT的浓度越高 , 容易造成精子核头部的不完整性。为了避免这一现 象发生 ,在试剂的配制过程中 ,笔者将 DTT浓度降 低到 0. 1 mol/L作为实验浓度。与改良前比较 ,对 结果的判断能够更加准确。 实验过程中 ,笔者通过摸索 ,对实验程序进行了 修改。首先 ,由于 DTT是很强的还原剂 ,散发一种 难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健 康。为了尽量减少试剂挥发给人体带来的伤害 ,除 了在通风橱进行操作外 ,笔者使用了密封较好的立 式染缸。另外 ,由于实验玻片在立式染缸中的有效 转移 ,可以节省试剂损耗、实验时间及试剂在空气中 挥发的时间。另一方面 ,笔者发现 ,实验过程中的每 一步并不都是必须的 ,而且 ,通过对试剂的作用时间 进行改变发现 , HCL溶液及核蛋白溶解液的作用时 间可以在较短的时间内达到实验需求。同时 ,由于 有效优化了作用时间 ,一定程度上降低了由于试剂 作用时间过长对精子核 DNA造成的损伤。 通过优化试剂配制 ,实验条件及实验器具的使 用 ,改良 SCD法在传统方法基础上保持了更好的精 子核完整度 ,可以增加对标本判断的准确性。同时 减少了试剂的使用量 ,节约了成本 ,而且 ,改良后的 SCD检测方法缩短了实验时间 ,在原来的基础上缩 短了 30 m in以上 ,检测方法更加快速。 笔者在对结果的观察时采用荧光显微镜。与明 场显微镜相比 ,荧光染色由于其信号强 ,分辨率好 , 对结果的判断能够更加准确。 由于改良后的 SCD 方法能更快速地对精子 DNA的完整性进行检测 ,同时 ,降低了试剂成本 ,有 效避免了试剂挥发对人体造成的伤害并保持了更好 的核完整性 ,该法更容易在实际工作中得到普及。 本研究对精子 DNA完整性的正常参考值范围 进行了探讨 ,得出异常精子百分率小于 32. 58%为 精液正常的指标。这与 Evenson 等 [ 14216 ] 提出的 SCSA得出的参数 DNA 片段指数 (DNA fragmentation index, DF I,即 COMPαt )临界值 30%接近。 笔者通过建立改良 SCD法 ,初步确定了参考值 范围 ,有望可以有效对精子功能评估提供指标。同 时 ,笔者希望得出的结论在临床中进一步得到检验 及应用。为了进一步探索 DNA完整性与辅助生殖 技术之间的相关性 ,笔者将进一步研究各种精子处 理手段对精子功能产生的影响 ,以及精子异常患者精 子在受精、胚胎形成及妊娠过程中产生的不同结局。 参考文献 [ 1 ]　Agarwal A, Said TM. 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