小分子肽的Tricine_SDS_PAGE分离方法

小分子肽的 T ricine2SD S2PA GE 分离方法Ξ 曹佐武 (暨南大学生殖免疫中心 广东广州 510632) 　　在蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化 中, 经常要把某种或某些蛋白质成分分离开来。聚丙烯 酰胺凝胶电泳 (SD S2PA GE) 是分离蛋白质的常用生化 方法, 样品的蛋白质分子热变性解聚后与 SD S 结合形 成带负电的蛋白质2SD S 复合物, 复合物在电泳中的迁 移率取决于蛋白质的分子大小, 使用均匀浓度的 SD S2 PA GE 来分析分子量在 15～ 200kD 的蛋白质时, 电泳 迁移率与分子量的对数成线性关系。但常规定 T ris2甘 氨酸2盐酸系统中电泳分离分子量小于 10kD 的多肽效 果差。作者在分离小分子肽的实验中改进了一套较简便 的分离小分子肽的 T ricine2SD S2PA GE 方法。 1　器材 尿素 (p rom ega) , 巯基乙醇 (E. M erck,D arm stadt) , 过硫酸铵 (A P ) (B io2R ad L ab. , U SA ) , T EM ED (B io2 R ad L ab. , U SA ) , 丙烯酰胺 (Sigm a) , 甲叉双丙烯酰胺 (Sigm a) , 三羟甲基氨基甘氨酸 (T ricine) (Serva)。 戊二醛, 硝酸银, 甘氨酸, 甲醛, 溴酚蓝, 甘油, SD S, T ris 碱, 标准分子量蛋白质, 胰岛素蛋白, 溶菌酶蛋白为 国产试剂。猪心细胞色素C (自制) , 昆虫细胞无血清培 养液为本实验室基因表达收集的样品。 蛋白质微量电泳仪 (B io2R ad L ab, U SA ) , M in i p ro tean Ê 垂直电泳槽 (B io2R ad L ab,U SA )。 2　实验方法 2. 1　T ricine2SD S2PA GE 蛋白质电泳溶液准备 正极缓冲液 (10×) : 用去离子水溶解 121. 14 g T ris, 用 1 mo l HC l 调至 pH 8. 9, 定容至 500 mL。 负极缓冲液 (10×) : 用去离子水溶解 60. 55 g T ris、 89. 58 g T ricine 及 5 g SD S, 加水至终体积为 500 mL。 凝胶缓冲液 (3×) : 用去离子水溶解 181. 5 g T ris, 1. 5 g SD S, 用 1 mo l HC l 滴定至 pH 8. 45, 再加水稀释 至 500 mL。 3 C 丙烯酰胺储存液: 48% 丙烯酰胺和 1. 5% 甲叉 丙烯酰胺, 用去离子水溶解。 6 C 丙烯酰胺储存液: 46. 5% 丙烯酰胺和 3. 0% 甲 叉丙烯酰胺, 用去离子水溶解。 样品缓冲液: 含 4% SD S、12% 甘油、50 mM T ris、 明显。各种畸形形态如附图所示。 4　讨论 小鼠精子畸形试验是分析评价环境外来化合物对 哺乳类雄性动物生殖细胞遗传学损害的一种有效的方 法, 它能特异地鉴定可传递的遗传性损伤, 具有简捷, 快速, 终点明确等优点。试验发现, 小鼠精子畸形率随 着醋酸铅的浓度增大而增加, 说明醋酸铅对小鼠精子 有明显的致畸作用。 从畸变精子的形态来看, 醋酸铅对小鼠精子的损 伤, 主要以头部损伤为主。因精子头部基本上是DNA 成分, 推测可能是铅与精子DNA 作用并干扰有关基因 表达的结果。精子形态的改变可能是诱变剂使精子形 成的有关基因发生突变, 或使有关染色体畸变的结果。 本试验表明, 精子畸形试验易掌握, 且具有实用价值。 同时, 提示了铅对雄性生殖细胞有潜在的诱变性, 以引 起长期处于铅环境下工作的人们的注意。 醋酸铅对小鼠精子畸形试验的影响 受试物 剂量 (m göL ) 总数(个) 畸变数(个) 畸形率 (% )X±SD 畸变精子分形及构成比无定形 香蕉形 无钩 胖头 小头 对照 0 6 000 563 9. 4±0. 3 112 51 249 96 56 19. 9% 9. 0% 44. 1% 17. 0% 9. 9% 醋酸铅 200 6 000 660 11. 3±0. 23 3 227 128 202 69 34 34. 4% 19. 4% 30. 6% 10. 5% 5. 2% 醋酸铅 1 000 6 000 876 14. 5±0. 63 3 226 143 315 113 79 25. 8% 16. 3% 35. 9% 12. 9% 9. 0% 醋酸铅 5 000 6 000 1 125 19. 0±0. 83 3 243 233 373 175 102 21. 6% 20. 7% 33. 1% 15. 6% 9. 1% 　　　　注: 3 3 表示 P< 0. 01 (BH )　　 —55—2003 年第 38 卷第 3 期　　　　　　　　　生　物　学　通　报 广东省自然科学基金资助 2% 巯基乙醇 (vöv) , 及少许溴酚蓝, pH 6. 8。上样前与样 品等体积混合, 沸水浴 5 m in。 　　10% 过硫酸氨溶液: 100 m g 的过硫酸氨溶于 1 mL 去离子水中。 2. 2　T ricine2SD S2PA GE 的凝胶制作 小孔胶 3 mL : 1 mL 凝胶缓冲液 (3x)、0. 4 g 甘油、1 mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至 3 mL , 临用 时加入 10 ΛL 的 10% 过 硫 酸 氨 溶 液 和 1 ΛL 的 T EM ED。 夹层胶 3 mL : 1 mL 凝胶缓冲液 (3x)、0. 61 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至 3 mL , 临用时加入 10ΛL 的 10% 过硫酸氨溶液和 1 ΛL 的 T EM ED。 浓缩胶 2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液 (3x)、0. 16 mL “3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至 2 mL , 临用时加 入 10 ΛL 的 10% 过硫酸氨溶液和 1 ΛL 的 T EM ED。 用M in ip ro tean Ê 垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小 孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩胶。 2. 3　低分子量蛋白质标准品　利用低分子量蛋白质 标准品 (5 种成分) , 再添加细胞色素C 和胰岛素蛋白, 加入含巯基乙醇的上样缓冲液还原处理, 可增加 2～ 3 条带。 2. 4　上样与电泳　取 5 ΛL 的昆虫细胞培养液样品, 加 5 ΛL 的加样缓冲液, 煮沸 10 m in 处理样品使蛋白质与 SD S 充分结合, 小心点入凝胶的点样孔中, 同时点入改 进的低分子量蛋白质标准品。内槽加入负极电泳缓冲 液, 外槽加入正极电泳缓冲液。 用 20 mA 恒流电泳 2 h 50 m in。银染显色。 2. 5　T ris2SD S2PA GE 分析　按常规方法配制 15% 的 分离胶和 5% 的浓缩胶, 点入昆虫细胞培养液和溶菌酶 蛋白。 图 1　Tr ic ine-SD S-PAGE 电泳结果 L ane 1: 标准蛋白质样品 L ane 2: 昆虫细胞培养液样品 　 图 2　Tr is-SD S-PAGE 电泳结果 L ane 1: 标准分子量蛋白 L ane 2: 昆虫细胞培养液样品 3　实验结果 用 T ricine2SD S2PA GE 分析昆虫细胞培养液样品 的电泳结果见图 1。从电泳结果看, 用所介绍的方法可 以分辨小至 2. 4kD 的蛋白成分。图中L ane 1 分辨出标 准蛋白质成分, 其分子量分别为97. 4、66. 2、43. 0、 31. 0、20. 1、14. 4、12. 4、3. 5 和 2. 4。L ane 2 为昆虫细胞 培养液的成分, 可见 15kD 以下的蛋白也能形成清晰的 带型, 各条带的分辨效果好。 用常规的 SD S2PA GE 方法进行蛋白质电泳, 小分 子蛋白质的分辨效果差, 即使用较浓的分离胶, 如用 15% 的分离胶和 5% 的浓缩胶分析昆虫细胞培养液中 的分泌物, 比 14kD 的溶菌酶蛋白更小的小肽没有清 晰的条带 (图 2)。而用 T ricine 系统分析昆虫细胞的分 泌物, 可以看到 3～ 15 kD 间有 5 条清晰的带 (图 1 中 L ane 2)。 4　讨论 研究中不时需要分离小分子肽, 但常规聚丙烯酰 胺电泳方法分离 10 kD 以下的小肽效果差。传统上分 离小分子肽要用梯度胶, 制作较麻烦, 而且需要专门的 灌胶设备。 改用 T ricine2SD S2PA GE 系统后, 对小分子肽的分 辨率明显提高。利用浓度 16. 5% 凝胶、11% 甘油, 按“小 孔胶+ 夹层胶+ 浓缩胶”模式制作不连续的梯度胶, 制 作方法相对简单。用本方法分析昆虫细胞的的表达产 物, 小于 14kD 的几个小分子成分可呈现清晰的条带。 前人报道的方法用不同的电压和电流电泳, 操作 繁琐, 有的电泳费时 5, 6 h 以上。国内有人采用 24% 的 甘油, 恒压电泳需 3 h30 m in。本方法降低了甘油浓度, 采用 20 mA 恒流电泳, 只需 2 h30 m in。 但本方法对大分子成分的分离没有明显优势。利 用常规的 SD S2PA GE 分析分析昆虫细胞培养液时, 也 可清晰地区分 30 kD 以上的条带。与常规的 SD S2 PA GE 方法相比, 本文介绍的 T ricine2SD S2PA GE 方法 分析小分子肽, 尤其是分辨 3～ 30 kD 的蛋白质成分效 果明显改善。 (BH )　　 我国投资 25 亿保护三江源 　　我国拟投资 25. 2 亿元建设“三江源”国家级自然 保护区, 以有效保护江河水源, 抢救性保护珍稀濒危野 生动物, 保护生物多样性和生态环境安全。 三江源地处青藏高原腹地, 是我国最大和最高的 天然湿地, 是长江、黄河以及澜沧江——湄公河的发源 地, 也是世界上海拔最高、生物多样性最集中、最丰富 的地区。近年来, 江河源头生态环境持续恶化, 湖泊减 少、沼泽消失、水土严重流失、草地沙化退化、野生动物 濒临灭绝。 据介绍,“三江源”国家级自然保护区总面积 15. 23 万 km 2。建设内容包括核心区禁牧移民工程、湿地保护 和湿地植被恢复工程、野生动物及其栖息地保护和野 外巡护工程、草原草甸生态保护及治理工程、森林草原 防火工程、科研监测以及宣传教育、社区发展等。 摘自《科学时报》2003 年 2 月 24 日 —65— 生　物　学　通　报　　　　　　　　　2003 年第 38 卷第 3 期