nullnull1. 学习分光光度计的使用方法
2. 掌握吸光光度法测定未知溶液中蛋白质 的浓度 实验目的蛋白质定量测定null一、
标准
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比较法 吸光光度法原理朗伯-比尔定律:吸光度 液层厚度A=κ·d · c摩尔吸收系数 溶液浓度 C未知 =A未知A标准×C标准蛋白质分子中酪氨酸、色氨酸残基的苯环含有共轭双键，在紫外280nm处有最大吸收峰，吸收值与浓度成正比。 用1cm石英比色杯，在280nm处测吸光度A，用标准蛋白对照法测定蛋白浓度。null紫外吸收法---A280光吸收法实验步骤空白管 标准管BSA 样品管 生理盐水 牛血清白蛋白 未知蛋白质 C标准=500μg/mL C未知=（计算）A标准=（测定） A未知=（测定） 先用空白管调零，在280nm处测已知浓度为C标准的标准溶液的吸光度A标准、未知样品的吸光度A未知，未知样品的浓度C未知可按公式求得。null注意事项1. 石英比色杯装3/4溶液2. 拉杆第1格（近自己）---空白管3. 开关“T”---开盖调%旋钮→0.00盖盖调%旋钮→100.04. 开关“A”---吸光度调“零”旋钮→0.005. 拉杆读第2格（标准管）的吸光度A标准
拉杆读第3格（样品管）的吸光度A未知根据公式计算未知蛋白质的浓度C未知 =A未知A标准×C标准null二、标准曲线法原理 考马斯蓝G250在酸性蛋白质染色溶液中呈棕褐色，与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，最大吸收光谱从470nm移到595nm。
蛋白质的浓度与595nm处的吸光度呈正比。null实验步骤考马斯蓝G250染色法 空白0管 标准1管 标准2管 标准3管 标准4管 标准5管 样品6管 100μg/mL 200μg/mL 300μg/mL 400μg/mL 500μg/mL ? μg/mL标准、样品蛋白液—— 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL实际蛋白质含量10μg 20μg 30μg 40μg 50μg ？0.9%生理盐水0.1mL —— —— —— —— —— ——蛋白质染色液5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL吸光度A ？ ？ ？ ？ ？ ？null 各管加入溶液后轻轻旋转摇匀，5min后以0管调“零”，595nm处测各管吸光度A。数据填入上表，画出标准曲线。根据样品的A值，即可查出相应的浓度。注意事项 微量加样器：按一下→吸液；
按二下→靠壁放出液体 先稀后浓，只换吸头，
吸头放回原处null2. 按表测定各管的吸光度生理盐水
(mL)葡萄糖标
准液(mL)蛋白质含量
(μg)蛋白质染色液(mL)吸光度A空白0管 0.1 5.0 标准1管 0.1 100μg·mL-1 10μg 5.0 ？ 标准2管 0.1 200μg·mL-1 20μg 5.0 ？标准3管 0.1 300μg·mL-1 30μg 5.0 ？标准4管 0.1 400μg·mL-1 40μg 5.0 ？标准5管 0.1 500μg·mL-1 50μg 5.0 ？ 样品6管 0.1 5.0 ？ 考马斯蓝G250染色法 null1. 绘制标准曲线实验结果纵坐标: 吸光度A 横坐标: 浓度CC(μg·mL-1) × ×× × 100 200 300 400 500A 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 2. 根据样品管所测的A未知 ，在标准曲线上查出未知样品中蛋白质的相应浓度C未知
浙公网安备 33021202002483